东北地区恙虫病东方体分离株sta56基因片段的扩增及？…

为了解东北地区恙虫病东方体分离株与其参考析的同源关系。采用了ＰＣＲ技术扩增东北地区恙虫病东方体分离株ｓｔａ５６基因片段,测定ＨＣＡａ９２０２和ＨＣＭ９５０１株ｓｔａ５６基因片段的核苷酸序列,并与右列的参考株进行同源性比较。结果显示,东北地区恙虫病东方体分离株均可在３２０～３３２ｂｐ范围内见到特异性扩增带,但ＭＳＡａ９３０２株和ＭＳＡａ９３０４株在此范围内分别可见２条和３条扩增带。ＨＣＡａ９２０２株     

山东地区恙虫病东方体Sta56基因片段扩增与分型研究

目的 鉴定山东地区恙虫病东方体(Ot)基因型别。方法 采用巢式聚合酶链反应技术对23株恙虫病东方体山东株、2份采自黑线姬鼠体外的小盾纤恙螨匀浆及10份恙虫病患者全血中提取的Ot目的基因进行分析研究,并与Gilliam、Karp、Kato国际参考株进行比较。将群引物扩增产物用双向测序法进行序列测定。结果 35份标本中33份属于Kawasaki型,2份(FXS4 and LHGM2株)属于Karp型。从这33份中选出B-16、FXS2株进行碱基序列测定,结果B-16、FXS2株Sta56基因片段序列与Kawasaki型同源性最高,分别为94.22％、95.21％,而与其他6株Ot同源性均<75.87％.应属于Kawasaki型;FXS4和HGM2株Sta56基因片段序列与Karp型同源性最高,分别为83.03％、96.45％,应属于Karp型。结论 山东地区恙虫病东方体流行株以Kawasaki型为主,但同时存在Karp型。     

东北地区恙虫病东方体分离株sta 56基因片段的扩增及序列分析

为了解东北地区恙虫病东方体分离株与其参考株的同源关系,采用了PCR技术扩增东北地区恙虫病东方体分离株sta56基因片段,测定HCAa9202和HCM9501株sta56基因片段的核苷酸序列,并与已知列的参考株进行同源性比较。结果显示,东北地区恙虫病东方体分离株均可在320～332bp范围内见到特异性扩增带,但MSAa9302株和MSAa9304株在此范围内分别可见2条和3条扩增带。HCAa9202株和HCM9501株与6个已知序列的恙虫病东方体菌株相比较同源性在67.72％～83.18％间,相对与Gilliam的同源性较高。     

我国恙虫病东方体分子流行病学研究进展

恙虫病是由恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi，Ot)引起的以发热、焦痂或溃疡、淋巴结肿大及皮疹为主要临床表现的一种自然疫源性疾病。在我国恙虫病流行原仅限于长江以南广大地区，但自1986年以来，秋冬型恙虫病作为一种新发传染病，于我国北方地区出现暴发和流行。     

恙虫病东方体黑龙江分离株的PCR/RFLP分析

目的：鉴定恙虫病东方体黑龙江分离株的基因型。方法：采用PCR／RFLP技术对恙虫病东方体黑龙江分离株的sta56基因及其酶切图谱进行分析研究，并与国际参考株进行比较。结果：6株分离株的PCR特异性产物经Hinf I、Hha I、Rsa I酶切后呈现3种不同的RFLP图谱；MSAa9301株、NSAa9303株、MSAa9304株及MSAp9305株与Gilliam参考株具有相似的酶切图谱，但缺乏Hinf I的酶切位点，属于Gilliam型；MSAa9306株与Karp参考株具有相同的酶切图谱，属于Karp型；MSAp9302株与Kato参考株具有相同的酶切图谱，属于Kato型。结论：黑龙江密山地区恙虫病东方体分离株存在Gilliam,Karp和Kato 3种型别。     

新疆博乐地区动物感染恙虫病东方体调查研究

目的了解新疆博乐地区动物自然感染恙虫病东方体(Ot)的情况。方法捕鼠、旱獭取脾组织,采用颈部静脉刺穿法取羊血,提取DNA,应用巢式PCR(nPCR)检测Ot-Sta56基因;对部分阳性样本测序,通过NCBI网站对序列进行BLAST比较分析。结果在博乐地区平原湿地、农田和居民区捕鼠126只,其中7只nPCR检测阳性,阳性率5.56%;取绵羊群血210份,8份nPCR检测阳性,阳性率为3.81%;捕获鸟类12只,其中2只nPCR检测阳性,阳性率为16.67%。在山地草原捕获鼠58只,捕获旱獭26只,nPCR检测无阳性。DNA序列分析表明,鼠类、鸟类、羊血阳性样本nPCR产物碱基序列相同,与Karp株相应DNA片段的碱基序列同源性最高,均为97%,应属于Karp型。结论在新疆博乐地区平原湿地中存在恙虫病东方体感染,为下一步深入进行该地区恙虫病东方体疫源地的调查奠定了基础。     

山东地区恙虫病东方体分离株的基因分型与序列分析

目的鉴定山东地区恙虫病东方体分离株的基因型别,分析其核苷酸序列。方法以日本、韩国常用的恙虫病东方体分型引物,用巢式PCR技术检测恙虫病东方体分离株的相对分子质量(Mr)56×103蛋白基因片段,对群引物扩增的PCR产物纯化回收后测序,并行序列分析。结果Gilliam、Karp、Kato、山东分离株用群引物均扩增出481-507 bp的目的片段,Gilliam、Karp、Kato经相应的型引物扩增出了目的片段。山东分离株仅Kawasaki型的分型引物扩增出目的条带,序列分析证实山东分离株与Kawasaki型相似。结论在国内首次扩增出Gilliam、Karp、Kato三型标准株,山东地区恙虫病东方体分离株为Kawasaki型;山东地区恙虫病东方体与日本的Kawasaki型相似,两者有较近的亲缘关系。     

汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的组织细胞培养研究

目的了解汉坦病毒（HV）和恙虫病东方体（Ot）在宿主体内共生情况.方法采用Vero E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内共生特征.结果5组感染Vero E6细胞体外培养检测结果发现：先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加.而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加.在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组.其结果均用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定.结论研究结果提示HV和Ot可在同一宿主细胞内共生,在感染初期有相互抑制作用;对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义.     

山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体的分子流行病学调查

目的从分子水平探讨山东地区不同季节优势恙螨自然感染恙虫病东方体（Ot）情况及其作为恙虫病传播媒介的可能性.方法根据Ot-Sta56 kDa外膜蛋白基因部分序列设计Ot种和型特异性引物,对标本提取的DNA先采用种特异性引物扩增,然后再采用型特异性引物扩增分型,并对部分标本进行序列测定.结果从不同季节优势恙螨幼虫共得到11株Ot分离株和16份恙螨匀浆,从这27份标本提取的DNA经首轮PCR扩增后,18份标本有预期的目的带.对首轮PCR产物采用nested PCR扩增分型,结果17份为Kawasaki型,1份（LHGM2株）为Karp型.序列同源性分析结果证实了nested PCR分型结果：XDM2株首轮PCR产物碱基序列与Kawasaki型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为97.00%,在系统发育树上与Kawasaki株位于同一分支,应属于Kawasaki型;LHGM2株首轮PCR产物碱基序列与Karp型相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为96.45%,在系统发育树上与Karp株位于同一分支,应属于Karp型.结论山东地区不同季节优势恙螨中存在Ot自然感染,Ot主要基因型为Kawasaki型.     

中国内蒙古、新疆部分地区鼠类自然感染恙虫病东方体的调查

目的了解中国内蒙古、新疆自治区部分地区鼠类自然感染恙虫病东方体（Ot）的情况.方法采用鼠夹捕鼠,从鼠脾中提取DNA,应用巢式PCR（nPCR）检测Ot-Sta56基因;对部分阳性标本测序,用Clustal Ⅹ（5.0）和DNA Club软件对序列进行比较分析.结果内蒙古地区捕获各种鼠类共计90只,其中6只nPCR检测阳性,总阳性率为6.67%,不同鼠种间阳性率有差别,但无统计学意义（x^2=8.898,P=0.148）;新疆地区捕获各种鼠类共计20只,其中1只nPCR检测阳性,阳性率为5.00%.不同地区间阳性率比较虽略有差别,但无统计学意义（x^2=0.076,P=0.782）.内蒙古、新疆部分地区从农田中捕获的鼠类标本为9只,占8.18%,无阳性标本;从草原捕获的鼠类标本为101只,占91.82%,其中阳性标本为7只,草原鼠标本Ot感染率为6.93%.序列分析结果：N59（内蒙古莫氏田鼠）、N69（内蒙古黑线仓鼠）、X33（新疆普通仓鼠）3份标本nPCR产物碱基序列与Karp株相应DNA片段的碱基序列同源性最高,均为99%,应属于Karp型;N65（内蒙古黑线仓鼠）及N88标本（内蒙古黑线姬鼠）nPCR产物碱基序列与中国台湾Taitung-2株和TW461株相应DNA片段的碱基序列同源性最高,均为94%;N90（内蒙古黑线姬鼠）与日本Oishi株相应DNA片段的碱基序列同源性最高,为96%.系统发育分析表明,N59、N69、X33位于Karp株所在的分支,而N65、N88、N90与Taitung-2株、TW461株、Yonchon株、Sxh951株、Oishi株、Kanda株属同一支系.结论研究证实内蒙古、新疆部分地区鼠类存在Ot自然感染,其基因型较为复杂.这为进一步深入进行恙虫病疫源地的调查奠定了基础.     

恙虫病东方体蛋白基因的原核表达及活性鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株56kDa外膜蛋白基因进行原核表达，并对表达产物进行纯化，以获得有生物活性的重组蛋白，用于恙虫病诊断试剂的研制。方法 根据GiUiam株东方体56kDa蛋白基因序列设计特定引物。用PCR法扩增出编码56kDa抗原长约1320bp的DNA，克隆至原核载体PET28a，构建了表达载体PET-OTG，并获表达。表达产物经镍(Ni2 )柱亲和层析纯化，聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及蛋白印迹(Western—blot)分析鉴定。并用间接ELISA进行抗原性分析。结果SDS—PAGE检测表明重组蛋白分别以可溶性蛋白和包涵体两种方式表达，在相对分子质量约52kDa处有表达目的条带。经 Ni^2 层析柱纯化得到目的蛋白，包涵体蛋白纯化后纯度大于可溶性蛋白，达电泳纯。Western-blot证实该蛋白能被患者阳性血清所识别，用阴性血清则未出现相应印迹。间接ELISA结果表明重组蛋白具有良好的抗原性，能有效区分恙虫病阳性和阴性血清。结论 重组蛋白具有免疫反应活性。有望作为诊断抗原用于恙虫病的诊断。     

恙虫病东方体山东分离株Sta56基因全序列扩增及酶切分析

目的明确山东恙虫病东方体（Ot）分离株Sta56基因全序列与其他已知的序列之间的遗传变异关系。方法对从山东省费县恙虫病患者、黑线姬鼠、小盾纤恙螨体内分离的3株Ot分离株Sta56基因全序列进行聚合酶链反应（PCR）扩增；选取4种内切酶HinfⅠ、HhaⅠ、HaeⅢ、PstⅠ对PCR扩增产物进行限制性片段长度多态性分析（RFLP）；对代表株XDM2株Sta56基因全序列测序，运用Clustal X（5、0）和PHYLIP软件对测得的序列与GenBank中已知的Ot序列构建系统发育树，进行比较分析。结果患者分离株B-16、黑线姬鼠分离株FXS2和小盾纤恙螨分离株XDM2均扩增出接近1．6kbp的目的条带。Ot山东分离株PCR扩增产物经HhaⅠ、HinfⅠ、HaeⅢ、RstⅠ酶切后图谱一致，但与国际参考株Gilliam、Karp、Kato株的RFLP图谱均不相同；虽与日本地方株Kawasaki株的酶切图谱有相似之处，但存在酶切位点的突变。序列同源性分析结果显示，山东地区代表株XDM2株Sta56基因全序列与Kawasaki型相应的序列同源性最高，为97％，氨基酸序列同源性为92％。结论经Sta56基因全序列分析，仇山东分离株基因型虽与日本Kawasaki型相似，但也存在差异。     

TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体方法的建立

目的建立敏感、特异、定量Real-time PCR方法,用于恙虫病东方体的检测。方法根据恙虫病东方体56 kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的TaqMan-MGB探针具有良好的特异性,建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.99),灵敏性评估发现每个20μlPCR反应管中只要有26个拷贝的目的基因即可被检测到,即最低检出浓度为2拷贝/μl,并且具有较好的重复性。结论建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于恙虫病东方体感染的快速检测。     

Orientia tsutsugamushi in eschars from scrub typhus patients

To verify the value of eschars for the diagnosis of scrub typhus and to characterize genotypes of Orientia tsutsugamushi in patients, we examined eschars and blood specimens of 7 patients from Shandong Province, People's Republic of China, for O. tsutsugamushi by polymerase chain reaction targeting the Sta56 gene. All 7 eschars and acute-phase blood samples were positive, while no specific DNA amplicons were obtained from the 7 convalescent-phase blood samples collected after antimicrobial drug therapy. The findings indicate that patients' eschars can be used for detection and genetic characterization of O. tsutsugamushi during the convalescent phase.