Effect of Antisense MBD1 Gene Eukaryotic Expression Plasmid on Expression of MBD1 Gene in Human Biliary Tract Carcinoma Cells

DNAmethylationhasavarietyofimportantfunctionsintheregulationofgeneexpression[1].ManystudiesdemonstratedthatthepathogenesisofbiliarytractcarcinomawascloselyassociatedwiththeaberrantDNAmethylationstatusoftumorrelatedgenes.TheaberrantstatusofDNAmethylationincludedthehypomethylationofonco genesandthehypermethylationoftumorsuppres sorgenes(TSG).IncreasingtheexpressionofTSGandimprovingthefunctionofTSGbyelimi natingitshypermethylationstatusmaybeanewwaytotreatbiliarytractcarcinoma.Toexplorether…     

DNA甲基转移酶1基因在人肝外胆管癌组织和细胞中的表达及意义

目的:研究DNA甲基转移酶1(DNMT1)在人肝外胆管癌组织和人胆管癌细胞系QBC939中的表达,并分析DNMT1的表达与胆管癌临床病理因素之间的关系,探讨其在胆管癌发生发展过程中的作用.方法:用免疫组织化学法检测DNMT1在24例人肝外胆管癌组织和20例慢性胆管炎组织中的阳性细胞表达率,将二者进行对比并分析其与胆管癌...     

DNA甲基转移酶3b基因在肝外胆管癌组织中的表达

目的：研究DNA甲基转移酶3b( DNMT3b)在人肝外胆管癌组织中的表达情况,并分析DNMT3b的表达与胆管癌临床病理因素之间的关系,探讨其在胆管癌发生发展过程中的作用。方法：用免疫组织化学法检测DNMT3b在24例人肝外胆管癌组织和20例慢性胆管炎组织中的阳性细胞表达率,将二者进行对比并分析其与胆管癌临床病理之间的...     

DNMT1蛋白通过沉默MEG3基因促进视网膜母细胞瘤增殖

目的 探讨 DNMT1 蛋白是否通过沉默 MEG3 基因诱导视网膜母细胞瘤增殖。方法 通过转染 pcDNA-DNMT1 或si-DNMT1上调或干扰DNMT1的表达水平;通过转染pcDNA-MEG3或si-MEG3上调或干扰MEG3的表达水平;用Western blot检测视网膜母细胞瘤细胞系中DNMT1蛋白表达量;用CCK-8法及EdU法检测细胞的增殖能力;用实时荧光定量PCR技术检测转染后的视网膜母细胞瘤细胞中MEG3表达量的变化;干扰DNMT1表达后,用甲基化特异性PCR检测MEG3基因启动子DNA甲基化水平的变化。结果 视网膜母细胞瘤SO-RB50及HXO-RB44细胞中DNMT1蛋白表达量显著升高（P<0.05）。转染了 pcDNA-DNMT1 的 HXO-RB44 细胞中 DNMT1 蛋白表达增加,细胞增殖能力增加,MEG3 表达量降低;转染了 siRNADNMT1的SO-RB50细胞DNMT1蛋白表达减少,细胞增殖能力降低,MEG3表达量增加（P<0.05）。干扰DNMT1蛋白表达后,MEG3基因启动子DNA甲基化水平降低（P<0.05）。逆转DNMT1蛋白对MEG3基因的调控后,DNMT1蛋白调控RB细胞增殖的能力减弱（P<0.05）。结论 在视网膜母细胞瘤细胞中,DNMT1蛋白表达的上调,诱导了MEG3基因启动子DNA甲基化失活,最终导致细胞异常增殖。     

甲基化转移酶DNMT1,DNMT3a及DNMT3b在子宫内膜异位症中的表达

目的:检测DNA甲基化转移酶DNMT1,DNMT3a, DNMT3b在子宫内膜异位症(dendometriosis, EMs)异位内膜、在位内膜及正常对照子宫内膜的表达。方法:收集子宫内膜异位症巧克力囊肿20例为实验组,行输卵管吻合术者、宫颈病变行手术者20例为对照组,抽提总RNA,反转录制备cDNA。采用real-time RT-PCR 检测DNMT1,DNMT3a及DNMT3b基因的表达,并通过免疫荧光验证DNMTI在EMs异位内膜和在位内膜以及正常对照组子宫内膜中的表达。结果:Real-time RT-PCR检测表明DNMT1, DNMT3a和DNMT3b 在EMs异位内膜和在位内膜的表达较正常内膜低(P<0.05)。DNMT1, DNMT3a和DNMT3b在异位内膜的表达较对照组正常内膜的表达的倍数变化分别是0.44,0.12和0.27;三者在在位内膜的表达较对照组正常内膜的表达的倍数变化分别是0.27,0.13和0.15;三者在异位内膜与在位内膜的表达差异无统计学意义(P>0.05)。免疫荧光检测结果表明DNMT1蛋白在EMs患者异位内膜及在位内膜中表达显著降低。结论:DNMT1,DNMT3a 及DNMT3b在EMs中的异常低表达可能导致患者表观遗传学异常,参与EMs的发病。     

Effects on Biological Behavior of Bladder Carcinoma T24 Cells via Silencing DNMT1 and/or DNMT3b with shRNA In Vitro

In this study,RNA interference technique was employed to silence the expression of DNMT1 and/or DNMT3b in human bladder cancer T24 cells.The expression levels of their mRNA and protein were greatly decreased by up to 75% and 65% respectively after T24 cells were transfected with lipofectamine2000 for 72 h,indicating RNA interference is an effective tool in gene knockdown.Proliferation and apoptosis of T24 cells were detected by MTT,and annexin-V-FITC and propidium iodide staining flow cytometry,respectively.It was found that loss of the DNMT1 or DNMT3b expression could inhibit the cell growth and promote the cell apoptosis to some extent.However,combined treatment with shRNA targeting both DNMT1 and DNMT3b mRNA could ob-viously enhance the above effects.It was concluded that simultaneously silencing both genes could result in strong suppressing effect on tumor proliferation and promoting ceil apoptosis than separate use,suggesting combined use of DNMT1 and DNMT3b can achieve a synergistic effect in the CpG island methylation in human bladder tumorigenesis.     

DNA甲基转移酶3A siRNA 真核表达载体的构建和鉴定

目的:构建DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferases 3A,DNMT3A)siRNA重组质粒稳定表达载体,为进一步探讨DNMT3A在多种生物学过程及肿瘤发生发展中的机制提供工具.方法:依据DNMT3A基因的cDNA序列,利用siDESIGN软件获得RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板,体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链,克隆到真核表达载体pSUPER-EGFP1中,构建DNMT3A siRNA重组质粒载体,经酶切鉴定后转染人肝癌细胞系SMMC-7721,荧光实时定量PCR初步分析DNMT3A经RNA干涉后的沉默效应.结果:成功构建了靶向DNMT3A基因的siRNA重组稳定表达载体,此载体有效地降低了肝癌细胞系中DNMT3A基因的表达水平.结论:通过该方法初步确定了沉默DNMT3A基因的较佳靶点.     

人反义VEGF_(121) cDNA表达质粒的构建及其对膀胱癌细胞增殖的影响

目的 构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,研究反义基因治疗对膀胱癌细胞增殖的影响。方法将VEGF121反向克隆入真核表达载体pcDNA3中,酶切鉴定。用此真核表达重组质粒转染人膀胱癌细胞株T24,G418筛选获得阳性克隆,RT-PCR法测定转染前后T24细胞中VEGF mRNA表达,ELISA法检测转染前后T24细胞中VEGF蛋白表达。利用MTT法、软琼脂克隆形成试验、流式细胞仪和电镜等检测转染前后T24细胞的生物学性状。结果 获得反义VEGF121 cDNA质粒表达重组质粒。VEGF121反义RNA部分阻断了T24细胞中VEGF表达,转染后肿瘤细胞VEGF mRNA和VEGF蛋白表达都明显减少;转染后单个细胞的克隆形成能力明显减弱;形态学超微结构显示细胞器扩张和肿胀,核染色质边集,凝集成块,可见明显的凋亡改变。结论成功构建了反义VEGF121 cDNA真核表达质粒,转染该质粒可明显抑制膀胱癌细胞增殖,为膀胱癌的基因治疗提供了一定的实验依据。     

DNMT3b基因多态性及其在胃癌组织中的表达水平与胃癌的关联性分析

目的:探讨中国北方汉族人群DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)基因单核苷酸多态性(SNPs)和胃癌发病风险之间的关联性,阐明DNMT3b基因是否为胃癌的易感基因。方法:选择447例胃癌患者作为病例组,961名健康对照者作为对照组,采用TaqMan技术检测2组研究对象DNMT3b基因的rs1569686、rs6119954、rs4911107、rs4911259和rs8118663位点的基因型分布。免疫组织化学技术检测病例组(104例)胃癌患者胃癌组织和85例患者的癌旁对照组织中DNMT3b蛋白的表达水平。结果:在病例组和对照组研究对象中5个SNPs位点基因型分布频率相近,未发现5个SNPs位点的多态性与胃癌的发生有关联(P>0.05)。与癌旁组织比较,胃癌组织中DNMT3b蛋白的表达水平升高(P<0.05)。5个SNPs的不同基因型与胃癌组织中DNMT3b蛋白的表达水平均无关联(P>0.05)。结论:中国北方汉族人群中DNMT3b基因多态性与胃癌的发生无关联,DNMT3b基因可能不是胃癌的易感基因。     

DNA甲基转移酶3A siRNA真核表达载体的构建和鉴定

目的：构建DNA甲基转移酶3A（DNA methyltransferases 3A,DNMT3A）siRNA重组质粒稳定表达载体,为进一步探讨DNMT3A在多种生物学过程及肿瘤发生发展中的机制提供工具。方法：依据DNMT3A基因的cDNA序列,利用siDESIGN软件获得RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板,体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链,克隆到真核表达载体pSUPER-EGFP1中,构建DNMT3A siRNA重组质粒载体,经酶切鉴定后转染人肝癌细胞系SMMC-7721,荧光实时定量PCR初步分析DNMT3A经RNA干涉后的沉默效应。结果：成功构建了靶向DNMT3A基因的siRNA重组稳定表达载体,此载体有效地降低了肝癌细胞系中DNMT3A基因的表达水平。结论：通过该方法初步确定了沉默DNMT3A基因的较佳靶点。     

Effects on biological behavior of bladder carcinoma T24 cells via silencing DNMT1 and/or DNMT3b with shRNA <Emphasis Type="Italic">In Vitro</Emphasis>

In this study, RNA interference technique was employed to silence the expression of DNMT1 and/or DNMT3b in human bladder cancer T24 cells. The expression levels of their mRNA and protein were greatly decreased by up to 75% and 65% respectively after T24 cells were trans- fected with lipofectamine2000 for 72 h, indicating RNA interference is an effective tool in gene knockdown. Proliferation and apoptosis of T24 cells were detected by MTT, and annexin-V-FITC and propidium iodide staining flow cytometry, respectively. It was found that loss of the DNMT1 or DNMT3b expression could inhibit the cell growth and promote the cell apoptosis to some extent. However, combined treatment with shRNA targeting both DNMT1 and DNMT3b mRNA could obviously enhance the above effects. It was concluded that simultaneously silencing both genes could result in strong suppressing effect on tumor proliferation and promoting cell apoptosis than separate use, suggesting combined use of DNMT1 and DNMT3b can achieve a synergistic effect in the CpG island methylation in human bladder tumorigenesis.     

DNMT1、DNMT3b siRNA重组质粒的构建及鉴定

目的:构建DNA甲基转移酶(DNMT1)、DNMT3b微干扰RNA(siRNA)重组质粒,并鉴定其正确性。方法:构建DNMT1siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒各4种,分别用BamHⅠ和PstⅠ酶切、测序、鉴定。结果:用BamHⅠ和PstⅠ进行双酶切后所有质粒均为阳性重组载体,每一种载体选择两个克隆进行测序鉴定,测序结果与插入的寡核苷酸的序列完全相符。结论:DNMT1 siRNA重组质粒和DNMT3b siRNA重组质粒正确,可用于后续实验。     

反义人DNMT1基因对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖和细胞周期的影响

目的 构建表达人DNMT1基因(DNA methyltransferase 1,DNMT1)反义RNA的真核表达质粒,观察其对乳腺癌细胞MDA-MB-435s增殖的影响.方法 应用DNA重组技术,将人DNMT1基因的cDNA片段克隆至pcDNA3.1(-)载体中,构建DNMTl反义RNA真核表达质粒,测序验证,将其转染人人乳腺癌细胞系中,利用荧光定量PCR法检测转染前后细胞DN-MT1基因mRNA表达水平的变化;Western blot检测转染后DNMT1蛋白表达变化;应用MTT法检测细胞生长状况,绘制细胞生长曲线;流式细胞术分析细胞周期的变化.结果 成功构建出能够表达DNMT1反义RNA的真核表达质粒.转染该质粒后,与未转染组和转染正义质粒组相比,MDA-MB-435s细胞中DNMT1基因mRNA和DNMT1蛋白表达量均显著下降;细胞生长变慢;细胞周期分析可见S期明显减少,而G1/G0期细胞显著增加.结论 反义DNMT1能够特异性下调该基因的表达,并抑制乳腺癌细胞的增殖,为乳腺癌基因治疗提供了新的靶标.     

脂质体包裹DNMT1反义寡核苷酸诱导白血病细胞株孕酮受体去甲基化的实验研究

目的研究脂质体包裹DNA甲基转移酶(DNMT1)反义寡核苷酸转染对白血病细胞株孕酮受体(Progesterone Receptor，PR)启动子甲基化及表达的影响，探讨甲基化基因治疗的新途径。方法人工合成的DNMT1反义寡核苷酸MG88用脂质体包裹后转染白血病细胞株，用RT-PCR检测DNMT1、PRBmRNA表达的变化以及用MSP分析PRA、PRB甲基化状态的改变。结果用MG88转染白血病细胞株后，DNMT1 mRNA显著下降；PRA、PRB启动子出现脱甲基化，PRB mRNA表达显著上升。结论DNMT1反义寡核苷酸MC88可以诱导白血病细胞PR脱甲基化，使PRB mRNA表达升高，为DNA甲基化基因治疗的实验性研究提供了可能。     

杆状病毒介导的DNMT1 siRNA对人胰腺癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的:观察介导DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)基因RNA干扰(RNAi)的杆状病毒载体(Bac-si-DNMT1-D)对人胰腺癌裸鼠移植瘤生长的影响及毒性反应。方法:建立人胰腺癌SW1990细胞裸鼠移植瘤模型,随机分为4组:空载体组、生理盐水组、低浓度病毒组及高浓度病毒组进行实验。TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡;实时荧光定量PCR检测DNMT1 mRNA表达;蛋白质印迹法检测DNMT1、Bax和Bcl-2蛋白的表达;病理学及血清学检测裸鼠心、肝、肾功能变化。结果:病毒组肿瘤生长较对照组明显被抑制(P<0.05),凋亡指数显著高于两对照组(P<0.01)。病毒组的DNMT1 mRNA表达量显著低于两对照组(P<0.05)。病毒组DNMT1及Bcl-2蛋白表达低于两对照组,但Bax蛋白表达高于两对照组(P<0.01)。各组间裸鼠心、肝及肾未见异常。结论:杆状病毒介导的DNMT1 siRNA载体可以有效降低人胰腺癌裸鼠移植瘤内DNMT1基因表达,抑制肿瘤生长,诱导肿瘤细胞凋亡,且对裸鼠无明显毒性作用。     

microRNA-21对裸鼠人胆管癌细胞移植瘤EMT的影响

目的 观察microRNA-21 ( miR-21 )对裸鼠人胆管癌细胞移植瘤生长及上皮间质转化( EMT)进程的影响. 方法在两组裸鼠侧腹部皮下注射对数生长期的胆管癌细胞QBC939和稳定表达miR-21的QBC939-miR-21细胞,建立裸鼠移植瘤模型. 采用Western blot、免疫组化及实时定量RT-PCR法检测EMT的上皮细胞标志物 E-钙粘蛋白( E-cadher-in)和间质标志物N-钙粘蛋白( N-cadherin)、波形蛋白( Vim-entin)的表达. 结果 QBC939-miR-21 组移植瘤体积大于QBC939组( P<0. 05 ) ,且E-cadherin相对表达量降低, Vim-entin、N-cadherin相对表达量增加. 结论 miR-21促进了裸鼠胆管癌细胞移植瘤生长和 EMT 进程,为进一步研究 miR-21在胆管癌中的功能及作用机制奠定了基础.     

pmCherry-N1-WWOX真核表达载体的构建及其在胆管癌细胞QBC939中的表达

目的 构建人脆性位点抑癌基因WWOX真核表达载体,并观察其在人胆管癌细胞株QBC939中的表达.方法 通过全基因合成的WWOX cDNA为模版,用PCR技术扩增,将扩增片段连接到PUC57质粒,构建克隆载体,鉴定出阳性克隆后用 DNA测序法鉴定重组质粒.将克隆载体与pmCherry-N1同时用Xho I/BamH I双...     

linc00152通过调控DNMT3A和DNMT3B促进人宫颈癌细胞生长与侵袭

探讨linc00152在宫颈癌中的生物学功能及其调控机制。运用qRT-PCR检测人宫颈癌细胞与正常宫颈上皮细胞中linc00152的表达;转染sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B于HeLa细胞以敲低细胞中linc00152、DNMT3A和DNMT3B的表达水平,采用qRT-PCR与Western blot法检测转染效率;采用Western blot法检测sh-linc00152对甲基化转移酶(DNMT)3A和3B蛋白表达水平的影响;采用MTT、Transwell侵袭实验检测sh-linc00152、si-DNMT3A以及si-DNMT3B对人宫颈癌HeLa细胞增殖与侵袭的影响。结果显示,linc00152在宫颈癌细胞中的表达水平明显高于正常宫颈上皮细胞(P<0.01);在HeLa细胞中,sh-linc00152组DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平明显低于sh-control组;sh-linc00152组、si-DNMT3A以及si-DNMT3B组HeLa细胞的存活率及穿过基质胶的HeLa细胞数量均明显低于各自对照组。linc00152可能通过调控DNMT3A和DNMT3B信号通路促进人宫颈癌细胞生长与侵袭。     

血管内皮生长因子_(165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的实验研究

目的　探讨应用血管内皮生长因子165(VEGF165)反义RNA治疗人脑胶质瘤的可行性。方法　构建和鉴定反义VEGF165真核表达载体 ;将其转染入人脑胶质瘤细胞SHG44 ,检测其转染前、后的生物学性状 ;比较转染前、后SHG44细胞的裸鼠皮下致瘤性 ;分别应用免疫印迹、免疫组织化学、微血管计数、电镜和流式细胞仪检测上述改变。结果　成功构建反义VEGF165真核表达载体并在SHG44细胞获得表达 ,该细胞生物学性状不受外源基因表达影响 ,其在裸鼠皮下致瘤性和血管生成能力明显下降。肿瘤终体积 :实验组 2 12mm3,对照组 7897mm3(P <0 .0 1) ;血管计数 :实验组 5 .5 0 ,对照组11 2 2 (P <0 .0 1)。结论　VEGF165反义RNA能有效抑制人脑胶质瘤血管生成和肿瘤生长 ,为基因治疗实体瘤奠定了基础