猬迭宫绦虫幼虫一个含重复序列的cDNA的分子克隆

目的：研究猬迭宫绦虫幼虫－裂头蚴的某些蛋白抗原的基因结构。方法：用鼠抗猬迭宫绦虫裂头蚴多克隆抗体筛选裂头蚴ｃＤＮＡ文库,筛选出的阳性克隆经亚克隆,测序后,用微机分析其一级结构。并用Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交实验检测与ｃＤＮＡ杂交的ｍＲＮＡ长度。结果：从ｃＤＮＡ文库中筛选出一个长度为１０８４ｂｐ的克隆,此克隆的开放读码框为８２８ｂｐ,编码２７６个氨基酸。开放读码框内有一个由１２３个核苷酸组成的重复单位,此重复单位在开放读码框内重复５次。重复单位编码的４１个氨基酸内疏水性氨基酸占５３．７％。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交结果显示在１．１ｋｂ处有一个很强的杂交带,１．７ｋｂ处有一个弱的杂交带。１．１ｋｂ处的杂交带与ｃＤＮＡ克隆的长度几乎相等。结论：裂头蚴在宿主体内移行或停留时,这些含重复序列的抗原性多肽可能作为逃避抗原,使裂头蚴在体内逃避免疫系统的杀伤作用。     

ELISA法检测猬迭宫绦虫抗体的研究

目的　探讨研制猬迭宫绦虫特异性诊断方法。　方法　将已克隆的编码猬迭宫绦虫幼虫半胱氨酸酶的基因重组到表达载体内 ,制备高纯度的基因工程抗原 ,以此基因工程抗原制成酶联免疫吸附试剂盒 ,检测 6例裂头蚴病患者血清。　结果与结论　基因工程抗原能与裂头蚴病患者血清发生很强的特异性反应 ,而不能与囊虫病患者血清发生反应。此方法的建立为裂头蚴病的特异性诊断奠定了基础。     

mRNA差异显示技术分离猬迭宫绦虫幼虫特异表达基因

目的　查找猬迭宫绦虫幼虫裂头蚴阶段特异性表达基因。　方法　裂头蚴和成虫组织用异硫氢酸胍一步法提取总 RNA,用 DNA酶去除总 RNA中污染的 DNA。使用 T1 2 MA、T1 2 MC、T1 2 MG和 T1 2 MT4种锚定引物反转录合成 c DNA,再用 1种随机引物与上述 4种锚定引物在含同位素的反应液中进行 PCR反应。将 PCR产物用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 ,经放射自显影后 ,从凝胶上选出裂头蚴与成虫不同的差异带 ,PCR扩增后经杂交试验鉴定出不同种类的基因片段 ;以筛选出的差异带作探针 ,分别与裂头蚴和成虫 RNA进行 Northern杂交证实裂头蚴阶段表达基因 ;将差异带测序后与 Gen Bank中的序列进行同源性比较。　结果　从凝胶中共选出 11条差异带。将回收的 11条带再经PCR扩增和杂交试验 ,从中选出 3种不同的基因片段。经 Northern杂交证实片段 1和片段 2为裂头蚴特异表达基因 ,而片段 3为裂头蚴和成虫共同表达的基因。3个基因片段测序后与 Gen Bank中的基因进行同源性分析 ,基因片断 1和 2无同源序列 ;基因片段 3与多种生物的 2 8S r RNA同源。　结论　通过 m RNA差异显示技术查找出 2个裂头蚴阶段特异性表达基因片段     

幼儿曼氏迭宫绦虫感染1例

本文报道１例17个月幼儿感染曼氏迭宫绦虫的诊断与治疗。     

细粒棘球蚴全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的　分离目的基因构建cDNA文库的经典方法繁琐且不易得到全长cDNA(3’和 5’端 ,尤其是基因的 5’非翻译区 )。本研究通过构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,筛选全长目的基因 ,研究其结构和功能。方法　采用TRIZOL试剂提取E .granulosus总RNA ,用ClonTech公司的SMARTTMcDNA文库构建试剂盒构建E .granulosus原头节全长cDNA文库 ,文库的包装使用EICENTERTECHNOLOGIES公司提供的包装蛋白。结果与结论　成功构建细粒棘球蚴全长cDNA文库 ,文库滴度为 1.4× 10 7pfu/ml。文库的重组效率达到 99%以上 ,插入片段长度约为 1.1kb。     

幼儿感染曼氏迭宫绦虫一例

患儿男性,4岁,贵州省桐梓县人,家居农村,无外出史。近1月来出现中上腹部不定时隐痛、食欲下降、间断性恶心呕吐等。在当地医院诊断为肠蛔虫,经服肠虫清(阿苯达唑)治疗无效。2000年10月11日其母带患儿来我院儿科就诊并住院观察。入院前粪便未排出过虫体节段。体检:心率84次/min,心律齐,BP 11.5/7.5 kPa。脾未及,肝肋下刚触及、质软。右臀     

迭宫属绦虫的分类学研究进展

迭宫属绦虫是一类被长期忽视的医学绦虫类群,其中绦期幼虫裂头蚴可侵入人体多种组织和器官引起裂头蚴病,造成较大危害。迭宫绦虫的分类系统一直较混乱,给相关的科研和教学工作带来困难。本文对迭宫绦虫的系统地位变迁及其分类学研究进展进行系统综述,以期为相关问题提供答案,同时为相关物种的研究提供参考资料。     

应用双向电泳及蛋白质印迹分析弓形虫特异性抗原

将感染弓形虫速殖子的SD大鼠血清和健康大鼠血清作为一抗进行蛋白质印迹（Western blotting）分析,比较杂交蛋白点的差异,分析弓形虫速殖子特异性抗原。弓形虫速殖子总蛋白双向电泳考马斯亮蓝染色图谱（7 cm×8 cm, pH 3～10）共检测到209个蛋白质斑点。Western blotting显示实验组抗原抗体反应点17个,对照组仅2个非特异性的蛋白结合点。     

弓形虫研究的过去、现在与未来

弓形虫为顶复动物门寄生原虫,呈世界性广泛分布,可感染所有温血动物,并在宿主免疫功能低下或受抑制时导致严重的疾患,其极高的流行性和致病的机会性已越来越引起人们的关注。本文回顾了弓形虫研究的历史,综述了目前弓形虫研究的热点并提出了在今后研究中需要解决的问题。     

棘阿米巴原虫全长cDNA文库的构建

目的快速构建棘阿米巴滋养体全长cDNA文库,为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定基础。方法以棘阿米巴滋养体分离株总RNA为模板,以经修饰的SMART寡聚核苷酸引物逆转录合成单链cDNA,采用长距PCR(long-Distance PCR,LD PCR)方法扩增得到双链cDNA,经蛋白酶K消化和SfiⅠ酶切后通过色谱柱CHROMA SPON-400按分子质量进行分离,进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收纯化0.4~2.5kb分离产物。取1μl PCR产物与λ噬菌体连接,以XL1-BLUE为受体菌扩增得到cDNA文库,分别用梯度法和随机测序法检测文库滴度与重组率。结果成功构建棘阿米巴cDNA文库,文库滴度为3.85×107pfu/ml,插入片段大小在0.4~2.5kb之间,重组率为100%(20/20)。结论棘阿米巴滋养cDNA文库构建成功,为棘阿米巴滋养体抗原的筛选和基因结构研究奠定了基础。     

粉尘螨全长cDNA文库的构建及初步鉴定

目的构建粉尘螨全长cDNA文库,为粉尘螨相关基因研究奠定基础。方法用RNAiso Reagent试剂盒提取粉尘螨总RNA,然后以SMART IVTM Oligo-nucleotide和CDSIII/3’PCR Primer为引物,在反转录酶作用下合成cDNA第1链,利用LD-PCR方法合成cDNA第2链。合成的双链cDNA经蛋白酶K消化及SfiⅠ酶切,得到的cDNA克隆入λTripIEx2载体中,构建粉尘螨全长cDNA文库,测定分析文库滴度及插入片段大小。结果成功构建粉尘螨全长cDNA文库。检测cDNA文库未扩增时滴度为7.3×106pfu/ml,文库扩增后滴度为5.0×109pfu/ml,插入片段为0.5~2.5kb,平均1.2kb左右。结论成功构建了高质量的粉尘螨全长cDNA表达文库,所建文库容量及插入片段大小适用于对粉尘螨相关基因的进一步研究。     

不同毒力株弓形虫速殖子消减cDNA文库的构建

目的构建不同毒力株弓形虫速殖子cDNA消减文库。方法以弓形虫强毒株RH株速殖子为Tester、弱毒株Prugniaud株速殖子为Driver,进行正向抑制性消减杂交;以Prugniaud株为Tester、RH株为Driver,进行反向抑制性消减杂交。分别将获取的2组抑制性消减杂交产物与pGEM-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并以PCR扩增鉴定插入片段。结果获得正向和反向cDNA消减文库,每个消减文库分别随机挑取384个阳性克隆,PCR扩增显示插入率为98%,片段长度在200~2000bp之间。结论通过抑制性消减杂交技术成功构建2个消减文库,为进一步筛选和鉴定弓形虫毒力相关基因奠定了基础。     

刚地弓形虫主要抗原B细胞表位的筛选及鉴定

目的筛选刚地弓形虫主要抗原B细胞表位并在原核表达载体中表达,对纯化的表位重组蛋白进行免疫反应性鉴定。方法用计算机软件BioSun、DNAstar综合分析6个弓形虫主要抗原的亲水性、可及性、柔韧性、二级结构、极性参数等,每一抗原分子预测2个最佳表位,设计合成24条共12对寡核苷酸,两端分别引入NocI、XhoI酶切位点,退火形成的双链定向克隆至原核表达载体pET-32c中,EcoRI单酶切鉴定重组质粒Epitope/pET-32c。将含有Epitope/pET-32c的BL21单菌落接种至LB肉汤培养基中培养,导入表达。表达产物用Ni2 螯合柱亲和纯化,免疫印迹试验(Westernblot)分析重组表位蛋白与弓形虫抗原免疫血清的免疫反应性。结果成功构建了12个原核表达质粒Epitope/pET-32c,并经测序证实,在E.coliBL21有11个表位基因能有效表达重组融合蛋白;纯化的表位蛋白大小均在20.0kDa左右;Westernblot结果显示表位蛋白SAG2-A、SAG3-B能被弓形虫抗原免疫血清识别,且反应较强,SAG2-B为弱阳性,其余的则不能被识别。结论成功筛选到3个弓形虫B细胞表位基因,为进一步构建弓形虫复合表位抗原诊断弓形虫病奠定了基础。     

双氢青蒿素和阿奇霉素对小鼠体内弓形虫速殖子超微结构的影响

将30只昆明小鼠随机均分为3组,即双氢青蒿素治疗组（A组）、双氢青蒿素和阿奇霉素联合治疗组（B组）, 以及感染对照组（C组）。每鼠腹腔注射感染2×10³个弓形虫速殖子。感染8 h后,A组灌服双氢青蒿素75 mg/（kg·d）, 间隔12 h再给药1次;B组同A组,另于感染24 h后灌服阿奇霉素200 mg/(kg·d)1次。A、B两组均连续给药4 d,双氢青蒿素间隔12 h给药1次,阿奇霉素间隔24 h给药1次。C组不给药。治疗后（即于感染96 h后）,分别随机从各组取 1只小鼠解剖,抽取腹水,分离弓形虫速殖子。常规制备透射电镜标本,观察其超微结构变化。结果显示,A、B两组弓形虫速殖子均出现水肿,细胞膜结构模糊,局部断裂或破损。细胞质脂滴增多、形成空泡。而感染对照组未出现上述变化。     

应用环介导等温扩增技术检测弓形虫

目的 用环介导等温扩增（LAMP）技术检测弓形虫。 方法　 用酚-氯仿法提取弓形虫速殖子基因组 DNA,设计两对扩增弓形虫 B1基因的 LAMP 引物。以间日疟原虫、恶性疟原虫、卡氏肺孢子虫、日本血吸虫及小鼠白细胞作对照,进行LAMP反应,产物经 SYBR Green I显色及电泳后观察结果,绿色判为阳性,棕色判为阴性。将弓形虫速殖子经倍比稀释为（2～3）×106个/ml至（2～3）×10-1个/ml 等8个浓度,进行LAMP反应,验证该方法的敏感性。 结果 LAMP反应结果显示,弓形虫速殖子检测管经显色后呈绿色,对照组均呈棕色。弓形虫的LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP技术可检测到的弓形虫速殖子最低浓度为2～3个/ml。 结论 LAMP技术在弓形虫检测中显示出较好的特异性与敏感性。     

弓形虫缓殖子期特异性抗原1基因的克隆、表达及对重组抗原的免疫反应性分析

目的 克隆与表达弓形虫缓殖子期特异性抗原1(BAG1)的基因,并分析重组抗原的免疫反应性。方法 诱导体外培养的弓形虫RH株速殖子向缓殖子转化,用RT-PCR法从缓殖子期弓形虫扩增BAG1基因片段,进行序列分析;构建表达重组质粒pET32a(+)-BAG1,转入大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达;表达蛋白经次氨基三乙酸镍(Ni-NTA)琼脂糖亲和层析纯化后,蛋白质印迹(Western blotting)分析与ELISA分析其免疫反应性。 结果 从缓殖子期弓形虫克隆的BAG1基因长690 bp,构建的重组质粒pET32a(+)-BAG1经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后,可高效表达重组BAG1。Western blotting分析显示纯化的重组BAG1(SAG1)能被弓形虫慢性感染血清识别。ELISA结果表明重组BAG1抗原检测350份人血清弓形虫IgG抗体的阳性率为17.4％,显著高于重组SAG1抗原的阳性率12.6％（P＜0.05）。 结论 原核表达的重组BAG1抗原具有特异的免疫反应性。