APEH基因在肾透明细胞癌中的表达研究

目的研究APEH基因在肾透明细胞癌中的表达,以探索其意义。方法应用半定量RT-PCR、实时定量PCR、免疫组化（IPH）检测30例配对肾透明细胞癌组织/癌旁正常肾组织标本中APEH基因mRNA和蛋白的表达,并对其中16例配对标本进行Western blot蛋白检测,予以统计分析。结果相较正常对照组,RT-PCR、实时定量PCR及IPH均显示肾细胞癌组织中APEH基因表达下调,其比例分别达到60.0%（18/30）、73.3%（22/30）和80.0%（24/30）,另外,Western blot示62.5%（10/16）的癌组织标本APEH蛋白表达下调。4种方法检验P值均〈0.05,差异有统计学意义,且针对同一批配对标本各检测方法结果之间一致性显著。结论 APEH可能为一新的肾透明细胞癌分子标志物。     

卵巢上皮性肿瘤中nm23H1基因的突变及其与临床病理特征的关系

目的：研究卵巢上皮性肿瘤中nm23H1基因遗传不稳定性与卵巢肿瘤进展的关系．为揭示nm23H1基因作用机制和肿瘤转移机制提供实验依据。方法：采用石蜡包埋组织抽提DNA。PCR-单链构象多态性（PCR—SSCP），常规银染、Envision免疫组织化学染色和Leica—Qwin计算机图像分析等方法，对石蜡包埋的卵巢上皮性肿瘤及相应的正常组织，进行17号染色体D17S396位点微卫星不稳定性、杂合性缺失的检测和nm23H1基因的表达研究。结果：本实验中．卵巢上皮性癌D17S396位点遗传不稳定发生率为40％。明显高于交界性肿瘤的10％。而在良性肿瘤和正常卵巢组织中未见该位点遗传不稳定的发生。结论：nm23H1基因的遗传不稳定性可能是卵巢上皮性癌发生、发展的一个重要因素．杂合性缺失的发生可作为卵巢组织恶变的判断指标之一。[著者文摘]     

凋亡相关基因TNFAIP3、ENC1在人脑胶质瘤组织中的表达

目的：检测细胞凋亡相关基因TNFAIP3和ENC1在不同级别胶质瘤组织和正常脑组织中的表达。方法：提取组织总RNA，用半定量RT-PCR检测其中TNFAIP3和ENC1 mRNA的表达。结果(1)同一患者肿瘤组织与其正常脑组织相比，TNFAIP3基因表达上调，ENC1基因表达下调；(2)与正常脑组织相比，WHOⅡ和Ⅳ级肿瘤组TNFAIP3表达升高，WHOⅠ、Ⅱ和Ⅲ级肿瘤组ENC1表达下降。结论：RT-PCR结果与芯片检测结果基本相符；胶质瘤组织中TNFAIP3表达上调、ENC1表达下调，它们的异常表达可能参与了胶质瘤的恶性进展过程。     

P16及FHIT基因异常表达在非小细胞肺癌发病机制中的研究

目的探讨P16及FHIT基因异常表达在非小细胞肺癌(NSCLC)的发病机制。方法选取肺癌切除术NSCLC患者65例,收集NSCLC肿瘤组织标本、正常肺组织标本。采用聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA,采用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳-硝酸银染色法检测基因杂合性缺失,采用限制性内切酶法检测DNA甲基化,采用免疫组化法检测蛋白表达。结果NSCLC组织P16及FHIT基因杂合性缺失发生率为58.46%和70.77%,甲基化发生率为49.23%和66.15%,蛋白表达缺失率为67.69%和72.31%;正常肺组织未见P16及FHIT基因杂合性缺失、甲基化、蛋白表达缺失,差异有统计学意义(P0.05)。P16基因杂合性缺失及甲基化与P16蛋白表达缺失具有关联; FHIT基因杂合性缺失及甲基化与FHIT蛋白表达缺失具有关联(P0.05)。临床分期是P16蛋白表达缺失的独立影响因素;性别、吸烟史是FHIT蛋白表达缺失的独立影响因素(P0.05)。结论 P16及FHIT基因异常表达在NSCLC的发生发展中起重要作用,发病机制可能与P16及FHIT基因的杂合性缺失和甲基化导致的P16及FHIT蛋白表达缺失有关。     

胶质瘤患者RASSF1A基因转录表达和启动子区甲基化的研究

目的 探讨RASSF1A(RAS association domain family 1A)基因mRNA表达水平和基因启动子区CpG岛甲基化程度及其与启动子甲基化的关系。方法 用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测28份胶质瘤组织和4份正常脑组织中RASSF1A基因mRNA相对表达水平;用甲基化特异性PCR方法研究胶质瘤组织、正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果 RASSF1A mRNA在4份正常脑组织中全部表达;在脑胶质瘤中表达缺失率为21.4％(6/28),且表达量低于正常脑组织,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度间的差异无显著意义(P>0.05)。按病理学分类,胶质母细胞瘤与少突胶质肿瘤的差异有显著意义(P=0.011)。脑胶质瘤中RASSF1A基因启动子发生甲基化的频率为39.3％(11/28),正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动了未发生甲基化。11份启动子区甲基化的胶质瘤标本中,5份同时伴mRNA表达缺失(P=0.022)。结论 RASSF1A基因启动了在胶质瘤中发生异常甲基化。尽管RASSF1A mRNA在脑胶质瘤中表达缺失并不广泛,但其表达普遍下调。推测启动子区CpG岛甲基化可能是导致RASSF1A基因在胶质瘤中表达缺失或表达水平下调的一种机制。     

荧光定量PCR检测肝癌组织GPC3、HSP70基因表达的临床意义

目的实时定量PCR方法检测肝癌细胞系、13例肝癌组织和癌旁组织GPC3、HSP70基因的表达，探讨定量PCR方法在肝癌早期诊断中的作用。方法应用实时定量荧光RT-PCR技术检测7种不同肝癌细胞系以及13例肝癌组织和癌旁组织中HSP70、GPC3基因的表达。结果发现HSP70基因在6个肝癌细胞系中过表达：GPC3基因在正常永生化肝细胞MIHA几乎不表达，而在H2-M、HUH7、HepG2、PLC、Hep3B中过表达；13例肝癌组织中9例HSP70和7例GPC3过表达。结论HSP70、GPC3基因在肝癌中过表达，有可能作为肝癌的临床早期诊断、治疗的参考指标，实时定量PCR方法能有效用于肝癌的诊断。     

荧光定量PCR检测肝癌组织GPC3、HSP70基因表达的临床意义

目的实时定量PCR方法检测肝癌细胞系、13例肝癌组织和癌旁组织GPC3、HSP70基因的表达，探讨定量PCR方法在肝癌早期诊断中的作用。方法应用实时定量荧光RT-PCR技术检测7种不同肝癌细胞系以及13例肝癌组织和癌旁组织中HSP70、GPC3基因的表达。结果发现HSP70基因在6个肝癌细胞系中过表达：GPC3基因在正常永生化肝细胞MIHA几乎不表达，而在H2-M、HUH7、HepG2、PLC、Hep3B中过表达；13例肝癌组织中9例HSP70和7例GPC3过表达。结论HSP70、GPC3基因在肝癌中过表达，有可能作为肝癌的临床早期诊断、治疗的参考指标，实时定量PCR方法能有效用于肝癌的诊断。     

亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的耐药机制研究

目的了解亚胺培南耐药铜绿假单胞菌外膜蛋白(Opr)D2的缺失和金属β内酰胺酶(MBLs)的产生。方法2-巯基丙酸协同试验筛检产MBLs菌株,MBLs序列特异性引物PCR扩增MBLs基因,以及DNA测序以亚胺培南为水解底物测定MBLs活性;蛋白印迹法检测亚胺培南耐药株Opr的表达。结果34株亚胺培南耐药株中有5株(14.7%)产MBLs,其中有2株(5.9%)和3株(8.8%)分别产VIM-2和IMP-1型MBLs,β内酰胺酶活性测定显示这些菌株产生β内酰胺酶可水解亚胺培南,其水解活性可被EDTA所抑制。实时定量RT-PCR和蛋白印迹检测显示,28株(82.4%)表现为OprD2表达缺失,3株(8.8%)表现为OprD2表达降低,其余3株(8.8%)OprD2表达正常。其中5株(14.7%)产MBLs菌同时存在OprD2表达缺失。结论临床分离铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药大多存在OprD2表达缺失或降低,在本地区存在产生VIM-2和IMP-1型的MBLs菌株。     

Runx3基因甲基化与大肠癌发生和转移的关系

目的 探讨Runx3基因启动子甲基化与大肠癌发生发展过程的关系。方法 采用蛋白印迹技术（Western-Blot）检测30例大肠癌组织及肿瘤周围正常黏膜组织中Runx3mRNA的表达，同时用甲基化特异性PCR（MSP）方法检测Runx3基因启动子甲基化情况。结果 30例大肠癌组织标本中Runx3基因的表达（6409．1042±298．2028）较肿瘤周围正常组织中表达明显下调（34565．3921±1108．2163），差异有统计学意义（P〈0．01）。正常黏膜组织中未发现有Runx3基因启动子的甲基化，30例大肠癌组织中有16例检测到Runx3基因启动子的甲基化，大肠癌组织Runx3基因启动子甲基化率显著增高（P〈0．05）。大肠癌标本中Runx3蛋白的表达与其病理临床特征密切相关，在低分化和有淋巴结转移大肠癌组织标本中Runx3蛋白的表达显著下调（P〈0．05）。结论 Runx3基因启动子甲基化是导致Runx3基因失活的主要原因之一，并且与大肠癌的发生发展密切相关。     

抑癌基因LKB1及其产物在胃癌中的表达

目的:研究LKB1、AMPK在人胃癌组织中的表达情况及其在胃癌发生中的作用机制。方法:收集胃癌组织、癌旁组织和癌旁正常组织各30例,采用实时荧光定量PCR法检测胃癌组织中LKB1 mRNA含量;用蛋白印迹法和免疫组化法检测胃癌组织中LKB1及其下游信号AMPK的表达状态。结果:胃癌组织中的LKB1 mRNA水平显著高于癌旁正常组织,而LKB1蛋白表达量和AMPK的172位苏氨酸(Thr)的磷酸化水平显著低于癌旁正常组织。结论:在胃癌组织中,肿瘤抑制因子LKB1的表达可能存在转录和(或)翻译后的调节,而LKB1蛋白激酶活性显著降低,提示存在LKB1/AMPK信号通路下调。     

肾透明细胞癌组织中miRNA-185水平的变化及其意义

目的探讨肾透明细胞癌组织中微小RNA-185（miRNA-185）水平的变化及其意义。方法提取22例手术患者肾癌组织和癌旁正常组织中的miRNAs,用RT-PCR的方法初步检测miRNA-185在肾癌组织和癌旁正常组织中的表达情况。采用Real-time PCR的方法定量分析miRNA-185在肾癌组织及癌旁正常组织中的表达情况。结果电泳结果显示,miRNA-185和U6 RNA均呈单一条带,其所处的位置及其在正常组织和癌组织中的表达情况符合前期的预计。Real-time PCR结果显示,miRNA-185在肾癌组组织中呈高表达,较癌旁组组织平均升高5.14倍。22例标本中有17例（77%）肾癌组组织中miRNA-185阳性表达率为77.3%（17/22）,明显高于癌旁组的22.7%（5/22）（P〈0.05）。G1期的4例肾癌标本均较相应的癌旁正常组织呈现低表达,高表达的则离散分布在G2和G3期。相关性分析结果显示,miRNA-185在肾透明细胞癌组织中的相对表达量与肾癌病理学分期呈正相关（r=0.58,P〈0.05）。结论 miRNA-185在肾癌组织中呈显著高表达,提示其与肾透明细胞癌的发生与演进有关,有望成为指导肾透明细胞癌诊断、治疗、预后的新靶点。     

Smad4 loss in mice causes spontaneous head and neck cancer with increased genomic instability and inflammation

Smad4 is a central mediator of TGF-β signaling, and its expression is downregulated or lost at the malignant stage in several cancer types. In this study, we found that Smad4 was frequently downregulated not only in human head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) malignant lesions, but also in grossly normal adjacent buccal mucosa. To gain insight into the importance of this observation, we generated mice in which Smad4 was deleted in head and neck epithelia (referred to herein as HN-Smad4^–/– mice) and found that they developed spontaneous HNSCC. Interestingly, both normal head and neck tissue and HNSCC from HN-Smad4^–/– mice exhibited increased genomic instability, which correlated with downregulated expression and function of genes encoding proteins in the Fanconi anemia/Brca (Fanc/Brca) DNA repair pathway linked to HNSCC susceptibility in humans. Consistent with this, further analysis revealed a correlation between downregulation of Smad4 protein and downregulation of the Brca1 and Rad51 proteins in human HNSCC. In addition to the above changes in tumor epithelia, both normal head and neck tissue and HNSCC from HN-Smad4^–/– mice exhibited severe inflammation, which was associated with increased expression of TGF-β1 and activated Smad3. We present what we believe to be the first single gene–knockout model for HNSCC, in which both HNSCC formation and invasion occurred as a result of Smad4 deletion. Our results reveal an intriguing connection between Smad4 and the Fanc/Brca pathway and highlight the impact of epithelial Smad4 loss on inflammation.     

肾细胞癌中Mina 53的表达及其与临床病理及预后的关系

目的探讨肾细胞癌组织中Mina53的表达水平及其与临床病理及预后的关系。方法采用RT-PCR技术测定96例肾细胞癌组织及20例癌旁正常肾组织中Mina53的表达,免疫组化法测定其蛋白水平的表达,分析其结果与临床病理及预后的关系。结果 Mina53平均模板量在肾细胞癌组织中的表达明显高于正常肾组织的表达（P〈0.01）,且在Ⅲ期、Ⅳ期肾细胞癌组织中的表达明显高于Ⅰ期、Ⅱ期的表达水平（P〈0.01）,Mina53蛋白在肾细胞癌组织中的表达水平明显高于其在正常肾组织的表达水平（P〈0.01）;Mina53高表达者的预后较低表达者明显要差（P〈0.01）。结论 Mina53基因及蛋白的高表达与肾细胞癌临床病理分期有关,其表达水平越高,预后越差,Mina53有望成为预后判断的新指标。     

荧光定量分析人皮肤瘢痕疙瘩组织中miRNA-34s的表达

背景：通过分析不同肿瘤组织与正常组织miRNA表达谱的差异,有可能筛选到特异性好、灵敏度高、可作为特定肿瘤分子标志物的miRNA。目的：采用实时荧光定量RT-PCR检测miRNA-34家族（miRNA-34s：miR-34a/b/c）在瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中的差异表达,分析评价microRNA-34s在瘢痕疙瘩形成发展的作用及可能的机制影响。方法：收集手术切除瘢痕疙瘩组织（10例）和正常皮肤（2例）;TRIZOL法提取标本的总RNAs并进行质检,再采用 Ambion′s miRNA Isolation Kit 从总 RNAs 中分离 microRNA,采用实时荧光定量 RT-PCR 技术检测miRNA-34s（miR-34a/b/c）在瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织中的表达水平。结果与结论：miRNA-34s（miRNA-34a/b/c）在瘢痕疙瘩组织中均呈下调表达（P＜0.01）。表明该家族成员参与了瘢痕疙瘩的形成发展,下调表达的miRNA-34s可能导致了瘢痕疙瘩的肿瘤性生长。     

大肠癌原发灶及粪便标本中基因mRNA表达及其临床意义

目的通过对COX-2,CK-20,CD44v6mRNA在结直肠原发灶及病人粪便中的表达,证实粪便中COX-2,CK-20,CD44v6mRNA表达来源于原发灶肿瘤细胞的脱落所致,为临床结直肠癌筛查选择合适的多基因标记物联合检测指标。方法对38例行结肠癌根治术的病人,原发灶及术前收集的粪便标本采用RT-PCR技术对COX-2,CK-20,CD44v6mRNA表达进行检查。结果研究发现,COX-2mRNA在原发灶及粪便中同时阳性表达率为44.7%(17/38),同时阴性表达率为39.5%(15/38),同源性可达84.2%(32/38);CK-20有44.7%(17/38)同时阳性表达,36.8%(14/38)同时无表达,同源性为81.5%(31/38);CD44v6mRNA有50%(19/38)同时阳性表达,44.7%(17/38)同时无表达,同源性为94.7%(36/38),同时性表达差异具有显著性,P值均小于0.001。结论粪便COX-2,CK-20,CD44v6mRNA表达与大肠癌原发灶中的表达具有同源性,说明粪便中COX-2,CK-20,CD44v6mRNA来源于原发灶肿瘤细胞的脱落。     

胃肠道肿瘤中EphrinB2和淋巴管密度的表达及临床意义

目的 探讨胃肠道肿瘤中EphrinB2的表达与淋巴管密度、淋巴结转移及临床病理参数的关系.方法 采用免疫组织化学、蛋白质印迹两种方法检测EphrinB2在45例胃腺癌、57例大肠腺癌和正常胃大肠黏膜组织（各15例）中的表达.检测D2-40标记的淋巴管并计数淋巴管密度（LVD）.结果 （1）EphrinB2阳性反应主要定位于肿瘤细胞胞质内;D2-40标记的LVD为棕黄色管腔样结构,阳性反应主要位于淋巴内皮的胞膜上.（2）免疫组织化学：EphrinB2在肿瘤组织中阳性表达率明显高于正常组织的阳性表达率（胃82.2％vs.26.7％,大肠75.4％vs.33.3％,P均＜0.05）;肿瘤组织LVD显著高于正常组织（P均＜0.05）.蛋白质印迹：胃和大肠肿瘤组织的表达分别为2.30±0.86和1.89±0.89,高于正常组织的表达0.90±0.41和0.87±0.56（P均＜0.05）.（3） EphrinB2的表达与肿瘤分化程度、淋巴结转移及临床分期有密切关系（P＜0.05）,而与年龄、性别、肿瘤大小无明显相关性（P＞0.05）.肿瘤组织中LVD与肿瘤分化程度、淋巴结转移、远处转移及临床分期相关（P＜0.05）,Spearman秩相关分析发现EphrinB2的表达与LVD呈正相关性.结论 EphrinB2在肿瘤中高表达,与胃肠道肿瘤的转移和进展密切相关,并与LVD呈正相关性,Eph-rinB2可能诱导LVD的形成参与淋巴结转移的调控.     

人鼻息肉组织白细胞介素-17表达水平及临床意义

目的探讨人鼻息肉组织标本白细胞介素（interleukin,IL）－17表达水平及临床意义。方法48例鼻息肉患者术后鼻息肉组织标本（鼻息肉组）与10例正常下鼻甲组织（对照组）,采用反转录一聚合酶链反应方法检测2组IL－17mRNA的表达水平。结果鼻息肉组IL－17mRNA光密度值（1．82±0．47）明显高于对照组（0．65±0．08）（P〈0．01）;鼻息肉组织中IL－17mRNA表达水平在性别、年龄、息肉初发或复发上差异无统计学意义（P〉0．05）。结论IL－17mRNA在鼻息肉组织中呈高表达,与鼻息肉的发生、发展有关。     

非小细胞肺癌组织Ezrin表达及意义

目的探讨非小细胞肺癌组织Ezrin表达特点及其临床意义。方法采用实时荧光定量RT—PCR的方法,对70例非小细胞肺癌组织和20例癌旁相对正常肺组织（距癌组织5cm之外）Ezrin表达进行检测。结果非小细胞肺癌Ezrin的表达显著高于癌旁相对正常肺组织（x^2=12．07,P〈0．05）。肺癌病人肿瘤组织Ezrin阳性表达与临床分期、病理分型和肿瘤分化程度无相关性（x^2=0．05～4．39,P〉0．05）,与淋巴结转移密切相关（x^2=5．93,P〈0．05）。结论Ezrin表达可能与非小细胞肺癌发生及转移相关,其检测可作为判断病人肺癌转移的一项重要参考指标。     

A reverse transcription comparative real-time PCR method for quantitative detection of angiogenic growth factors in head and neck cancer patients

Objectives: Head and neck cancer is one of the ten most frequent cancers in the world. The angiogenic growth factors VEGF, PDGF and bFGF play a role in cancer aggressiveness. We developed a sensitive method to quantify the gene expression of these factors in the tissues of head and neck cancer patients.

Design and methods: All assays were performed using real-time RT-PCR, which yields a value (Ct) denoting the threshold cycle of PCR amplification at which product is first detected by fluorescence. The Ct is dependent on the quantity of the target molecule in the sample. To control for variation in RNA quantity and quality, we used 18S ribosome RNA as an internal control to calculate a relative Ct for the target molecules of interest, VEGF, PDGF and bFGF. A serially diluted positive control sample was analyzed by linear regression to determine the sensitivity and linearity of the assay. Paired normal and cancerous tissue samples from 115 head and neck cancer patients were assayed to ascertain the relative levels of the growth factors.

Results: The CVs of within-run and between-run assays for VEGF, PDGF and bFGF were all less than 3%. The correlation coefficient of the RNA concentrations and Ct values were 0.9987, 0.9977, and 0.9996 respectively for VEGF, PDGF and bFGF. The assay was sensitive to as little as 10⁻³ ng of RNA. All three growth factors were significantly increased in tumor tissue as compared to normal tissue. VEGF, PDGF and bFGF levels were elevated in 71.3%, 58.2% and 54.0% of cancerous tissue samples, with average levels of over-expression of 35.1, 24.6 and 13. sixfold, respectively.

Conclusion: This method provides sensitive, quantitative, high-throughput analysis for direct comparison of gene expression levels between samples, while adjusting for factors that may influence quantity determination. It should be applicable to molecules other than angiogenic growth factors, as well.