脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质移植治疗兔角膜碱烧伤

目的:研究复合脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对碱烧伤角膜的治疗效果。方法:制备晾干的脱细胞猪角膜基质,取第3代体外培养的兔自体脂肪干细胞,体外种植到脱细胞猪角膜基质上,培养3d后用于板层角膜移植。结果:板层角膜移植2mo后,术眼角膜基本恢复透明,未发生排斥反应,新生血管较少,3mo后新生血管基本消退。结论:复合自体脂肪干细胞的脱细胞猪角膜基质对兔碱烧伤角膜具有良好的修复能力。     

脱细胞猪角膜基质作为植片的深板层角膜移植治疗感染性角膜溃疡的临床观察

目的 比较脱细胞猪角膜基质与新鲜角膜组织作为植片的深板层角膜移植手术治疗感染性角膜溃疡的临床疗效。设计 回顾性病例系列。研究对象 2015年11月~2016年9月在北京佑安医院就诊的10例病变深度未累及后弹力层的感染性角膜溃疡患者。方法 回顾性分析气泡辅助下的深板层角膜移植手术资料,其中使用脱细胞猪角膜基质材料和新鲜角膜组织材料治疗的患者各5例。比较两组患者术后1年最佳矫正视力（LogMAR）、眼压、球镜度、角膜平均曲率、散光度、角膜内皮细胞数、角膜厚度、眼轴长度、角膜共聚焦显微镜表现、角膜透明度以及植片的生存情况。主要指标 术后1年患者的最佳矫正视力（LogMAR）、眼压、球镜度、角膜平均曲率、散光度、角膜内皮细胞数、角膜厚度、眼轴长度、角膜共聚焦显微镜表现、角膜透明度以及植片的生存情况。结果 在随访期间,两组所有植片均保持透明,植片生存率为100%。术后1年,脱细胞角膜基质组和新鲜角膜组的视力分别为0.53±0.21和0.33±0.06（P=0.184）,眼压分别为（8.00±2.00）mmHg和（10.33±0.58）mmHg（P=0.124）,球镜度分别为（-4.50±4.21）D和（-1.25±0.75）D（P=0.258）,角膜平均曲率分别为（47.59±5.40）D和（44.51±1.87）D（P=0.403）,散光度分别为（-5.52±1.97）D和（-5.14±1.66）D（P=0.812）,内皮细胞数分别为（1272.67±387.63）个/mm2和（1550.33±232.69）个/mm2（P=0.347）,角膜厚度分别为（439.33±67.86）μm和（534.00±14.42）μm（P=0.077）,眼轴长度分别为（23.53±0.91）mm和（23.55±1.56）mm（P=0.981）。角膜共聚焦显微镜显示,脱细胞猪角膜基质组的角膜上皮细胞可以完全覆盖植片,基底细胞和翼状细胞形态和密度与新鲜角膜组织接近,但在基底细胞下方可见高反光的沉着物,基质层细胞的密度明显低于新鲜角膜组织,并且在内皮细胞与深基质层之间仍可见脱细胞纤维排列。结论 脱细胞猪角膜基质具有良好的生物相容性,当缺乏新鲜角膜材料时,用于替代治疗感染性角膜溃疡可以取得满意的效果。     

猪脱细胞角膜基质的制备及组织学特征观察

目的:制备低抗原性、保留天然角膜结构的组织工程角膜支架材料.方法:对猪角膜进行反复冻融联合酶消化,最后冷冻干燥,观察其组织学特征.结果:制备的脱细胞猪角膜基质的细胞成分能被有效去除,材料保留了利于角膜上皮生长的基底膜和有序排列的网状的基质胶原结构,有一定的强度和韧性.结论:采用反复冻融联合酶消化、冷冻干燥法能获得一种无细胞的组织工程角膜支架材料.     

脱细胞猪角膜基质的生物相容性与组织工程化兔角膜上皮移植的研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质的生物相容性,评价组织工程化角膜上皮组织作供体的可行性,观察支架材料的细胞化情况和种子细胞的存活情况.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,用Dispase-Triton-X-100处理猪角膜基质,脱去角膜细胞;以角膜基质囊袋内植入的方法,观察异种角膜基质植入后的生物相容性,A组:脱细胞猪角膜基质,B组:新鲜猪角膜基质,C组:空白对照组.以组织工程化雄性角膜上皮组织为供体,同种雌性为受体,作板层角膜移植,观察角膜的混浊、水肿、新生血管等情况;组织病理学和免疫组化方法检测支架材料的细胞化情况,Y染色体性别决定基因(SRY)-聚合酶链反应(PCR)方法追踪种子细胞的存活情况.结果 猪角膜基质植入兔角膜囊袋后,角膜逐渐恢复透明,排斥反应指数＜6,组织病理学观察角膜结构完整,胶原纤维平行排列,少许细胞长入脱细胞猪角膜基质边缘,各组免疫组化检测未见CIM+、CD8+T淋巴细胞浸润.组织工程化角膜上皮作异体板层角膜移植后,3～4 d上皮光滑,10～20 d变为透明;15 d时角膜上皮、基质、内皮完整,上皮细胞约4或5层结构,少许基质细胞长入支架,1个月时可见角膜上皮细胞约7或8层细胞,基质纤维排列规则,多量细胞长入脱细胞角膜基质.上皮细胞表达CK3,支架内新生细胞表达波形蛋白.SRY-PCR结果显示种子细胞可以在受体内长期存活.结论 脱细胞猪角膜基质生物相容性良好,组织工程化角膜上皮可作为板层角膜移植的供体,脱细胞猪角膜基质细胞化良好,种子细胞可以在受体内长期存活.     

穿透性角膜移植术治疗基质层角膜营养不良

目的:探讨穿透性角膜移植术治疗基质层角膜营养不良的疗效。方法:对基质层角膜营养不良15例17眼施行穿透性角膜移植术,观察其临床特点及手术效果。随访6～36(平均18)mo。结果:术后视力比术前明显提高,最佳矫正视力>0.1者16眼(脱盲率94%),其中>0.3者9眼(脱残率52%)。2眼发生排斥反应,未发现原发角膜病变复发。结论:穿透性角膜移植术是治疗基质层角膜营养不良的有效方法。     

培养兔角膜基质细胞的一种新方法——悬浮基质片法

目的寻找一种新的、简易的兔角膜基质细胞培养方法。方法去除兔角膜上皮层、后弹力层及内皮细胞层,将处理后剩下的全层基质(简称基质片)置于6孔板中,分别进行悬浮培养(悬浮基质片法)、组织块贴壁培养法培养、Ⅱ型胶原蛋白酶消化法培养。观察所培养细胞的体外生长特性,并进行波形蛋白免疫组化鉴定。结果采用悬浮基质片法可成功培养出兔角膜基质细胞,细胞具有长短不等的数个突起,呈梭形、不规则三角形或纺锤形,核椭圆、居中,胞浆清亮,未见其他细胞混杂其中。悬浮培养8～10d贴壁,贴壁后约5d基本融合。其生物学特性与组织块贴壁培养法及Ⅱ型胶原蛋白酶消化法培养的细胞一致。波形蛋白免疫组化染色显示3种方法均为阳性。结论悬浮基质片法培养角膜基质细胞,不需用酶,且具有简便、可靠、不易污染、成功率高等明显优势,为角膜基质细胞的培养提供了新的途径,值得推广。     

组织工程角膜治疗兔无菌性角膜溃疡

目的:探讨利用组织工程技术制备角膜基质进行板层角膜移植治疗无菌性角膜溃疡的可行性和疗效。方法:用去垢剂联合胰酶、DNA-RNA酶去除猪角膜基质细胞后制备成组织工程角膜基质;将16只兔的角膜基质内植入壳聚糖膜使之形成角膜溃疡,随机从16只兔中选8只行组织工程角膜基质板层移植;另外8只作为对照组,行新鲜的同种异体板层角膜移植。术后对角膜进行裂隙灯、HE染色光学显微镜检查。结果:组织工程角膜基质移植后无免疫排斥发生,术后8～10wk角膜溃疡完全修复,角膜恢复透明性,与对照组疗效相同。结论:组织工程角膜基质具有良好的生物相容性和治疗作用。     

大鼠生物活性组织工程角膜等效物穿透性移植后观察

目的观察组织工程角膜等效物（tissue-engineered corneal equivalent,TECE）大鼠穿透性角膜移植后大体及组织病理学特点。方法脱细胞猪角膜基质（corneal acellular matrix,CACM）接种7dSD大鼠原代角膜上皮细胞与基质细胞,气液面培养4～6d至材料透明后作为TECE组植片,单纯CACM作为对照组植片,施行穿透性角膜移植术。术后观察角膜新生血管、植片混浊度、角膜细胞修复情况,2周、4周、8周、16周取材进行HE检查、20周取材进行透射电镜检查。结果TECE组术后10d角膜荧光素钠染色（-）,对照组术后14d角膜荧光素钠染色（-）;TECE组新生血管出现时间（5.00±1.22）d晚于对照组（3.80±0.84）d,差异有显著统计学意义（P〈0.01）,2周时TECE组新生血管面积（15.47±7.01）mm^2少于对照组（62.75±29.22）mm^2,差异有显著统计学意义（P〈0.01）。拆线后2组角膜新生血管均大部分消退,植片逐渐透明;20周透射电镜检查提示2组均有新胶原形成,TECE组有神经纤维长入。结论以CACM为支架构建的组织工程角膜等效物可以抑制角膜新生血管形成,透明度高,支持自体角膜细胞与神经纤维长入。     

猪角膜脱细胞基质的制备及生物相容性的实验研究

目的探讨猪角膜脱细胞基质（CACM）的制备方法，评价其组织学特性和生物相容性。方法应用1％TritonX-100去垢剂振洗，经冷冻干燥处理得到猪CACM，通过苏木精-伊红染色、扫描电镜观察行组织学检测。将猪CACM植入兔角膜板层间观察10周，取材做组织切片，评价其生物组织相容性。结果组织学检测证实角膜细胞完全脱净，胶原纤维排列疏松，板层结构同正常角膜；扫描电镜CACM表面未见细胞结构，纵切面上胶原板层间出现清晰的空穴状裂隙；CACM植入兔角膜层间后，观察期内未见明显排异反应。结论TdtonX．100可以有效地脱净角膜细胞，保存胶原排列的结构特征，经过冷冻干燥可形成多孔隙且胶原排列疏松的板层结构，适合作为载体材料，猪CACM与兔角膜生物相容性好。     

异种角膜脱细胞基质和几丁糖载体构建角膜基质层的比较

目的探索异种角膜脱细胞基质和几丁糖为载体构建生物角膜组织的可行性，评价二者的结构、功能和生物相容性。方法l％TritonX-100及冷冻干燥处理获得猪角膜脱细胞基质，网状几丁糖材料制备成似角膜片状形态，将体外培养的兔角膜基质细胞种植于两种载体，体外培养2周，形成细胞载体复合物。对构建的角膜组织进行苏木精-伊红染色、扫描电镜观察；同时将两种生物材料移植到兔角膜基质囊袋内，观察其生物相容性。结果角膜基质细胞在两种载体上皆可黏附生长，并分泌细胞外基质。脱细胞基质载体内细胞形态不规则，位于胶原板层间，形成类似正常组织的角膜基质结构；细胞可在几丁糖网状纤维上黏附并包绕生长。两种载体移植到兔角膜囊袋后，脱细胞基质降解较慢，与宿主角膜组织相融性良好，未发生明显排斥及毒性反应；几丁糖载体降解较迅速，但降解产物诱导较严重的排斥反应。结论异种角膜脱细胞基质保留正常组织的胶原板层结构，并具角膜的韧性和良好的生物相容性，更适于作为体外构建生物角膜的载体，而几丁糖材料则需要在构成结构和性能等方面进一步改进．     

脱细胞猪角膜基质体外支持皮肤细胞生长的实验研究

目的 探讨脱细胞猪角膜基质体外是否支持皮肤细胞的生长.方法 制备脱细胞猪角膜基质(前期实验已完成).体外培养人皮肤表皮细胞和成纤维细胞,取第3代人皮肤成纤维细胞接种在脱细胞猪角膜基质的中间基质面,培养3 d后,将材料翻转,取第3代人皮肤表皮细胞接种在材料的上皮面上,再培养10 d后,取细胞-支架复合体制作石蜡切片,HE染色后光镜下观察.结果 组织学观察显示皮肤的表皮细胞和成纤维细胞体外均可在脱细胞猪角膜基质上黏附生长.接种10 d后,皮肤表皮细胞在材料表面形成复层结构,可见角化的细胞.接种13 d可见成纤维细胞存活并在支架层间生长.结论 脱细胞猪角膜基质有良好的细胞相容性,在体外能支持皮肤细胞的生长和增生.     

眼部脱细胞修复材料的制备与鉴定

目的：以不同方法制备脱细胞硬脑膜和巩膜,比较不同方法、浓度、作用时间对硬脑膜和巩膜脱细胞效果的差异,找到适合硬脑膜和巩膜的脱细胞方法。 方法：将取自8只新西兰大白兔的硬脑膜和巩膜组织剪成小块,每种组织块均分为8组,每组含有硬脑膜和巩膜两种组织,4组用以5,10,20,50mL/L Triton X-100为主,辅以DNase、RNase的方法处理,另外4组用2.5g/L胰蛋白酶和1g/L SDS分别处理12h＋12h,12h＋24h,24h+12h,24h+24h。完成后分别从大体观察8组的外观,HE染色比较脱细胞后的细胞残留数,透射电镜观察胶原纤维的超微结构。 结果:以Triton X-100处理后的组织外观与处理前相似,2.5g/L胰蛋白酶处理后的组织肿胀增厚。20,50mL/L Triton X-100两组和2.5g/L胰蛋白酶＋1g/L SDS处理时间≥36h的三组组织内的细胞残留平均数都小于2个/高倍镜视野。电镜结果证实,硬脑膜和巩膜经过脱细胞处理后,胶原纤维结构同处理前相同,未受到破坏。 结论:以Triton X-100处理的硬脑膜和巩膜结构紧凑,胶原纤维保存完好,其中20mL/L Triton X-100浓度处理过的组织残留细胞少,处理前后外观改变少,是适合硬脑膜和巩膜进行脱细胞处理的方法。     

Support of acellular porcine corneal stroma for growth of corneal epithelium and stromal cell in vitro

AIM: To determine whether acellular porcine cornea stroma (APCS) could support the growth of the rabbit corneal cells in vitro . METHODS: APCS was prepared. The rabbit's corneal epithelium and stromal cells were cultured and seeded on APCS in vitro . The observation of phase contrast photograph and histological examination were performed. RESULTS: Histological examination showed the epithelium grew on the scaffold of APCS in 2-3 layers at 10th day. The stromal cells adhered to the surface of the scaffold after 24 hours and invaded into the interlaminar of the material at 5th day. CONCLUSION: These results indicate that APCS can support the growth and proliferation of the corneal epithelium and stromal cells in vitro .     

Acellular porcine corneal matrix as a carrier scaffold for cultivating human corneal epithelial cells and fibroblasts in vitro

AIM: To investigate the feasibility of corneal anterior lamellar reconstruction with human corneal epithelial cells and fibroblasts, and an acellular porcine cornea matrix (APCM) in vitro. METHODS: The scaffold was prepared from fresh porcine corneas which were treated with 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) solution and the complete removal of corneal cells was confirmed by hematoxylin-eosin (HE) staining and 4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. Human corneal fibroblasts and epithelial cells were cultured with leaching liquid extracted from APCM, and then cell proliferative ability was evaluated by MTT assay. To construct a human corneal anterior lamellar replacement, corneal fibroblasts were injected into the APCM and cultured for 3d, followed by culturing corneal epithelial cells on the stroma construction surface for another 10d. The corneal replacement was analyzed by HE staining, and immunofluorescence staining. RESULTS: Histological examination indicated that there were no cells in the APCM by HE staining, and DAPI staining did not detect any residual DNA. The leaching liquid from APCM had little influence on the proliferation ability of human corneal fibroblasts and epithelial cells. At 10d, a continuous 3 to 5 layers of human corneal epithelial cells covering the surface of the APCM was observed, and the injected corneal fibroblasts distributed within the scaffold. The phenotype of the construction was similar to normal human corneas, with high expression of cytokeratin 12 in the epithelial cell layer and high expression of vimentin in the stroma. CONCLUSION: Corneal anterior lamellar replacement can be reconstructed in vitro by cultivating human corneal epithelial cells and fibroblasts with an acellular porcine cornea matrix. This laid the foundation for the further transplantation in vivo.