丙烯醛对缺氧复氧H9c2心肌细胞损伤的影响及机制初探

目的研究丙烯醛对缺氧复氧H9c2心肌细胞损伤的影响,并探讨其促凋亡作用机理。方法建立H9c2心肌细胞缺氧复氧(H/R)损伤模型,分为正常对照组、丙烯醛组(ACR)、缺氧复氧组(H/R)、丙烯醛+缺氧复氧组(ACR+H/R)。用10μmol/L丙烯醛预处理H9c2心肌细胞30min后2h缺氧16h复氧,采用MTT法检测细胞存活率,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色检测细胞核凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白cytochrome c(cyt c)、caspase 9和caspase 3的表达水平。结果与H/R组相比,ACR+H/R组H9c2细胞存活率下降、凋亡增加(P<0.05),cyt c的线粒体蛋白表达水平下调、细胞浆蛋白表达水平上调,caspase 9和caspase 3蛋白表达水平下调并出现明显裂解蛋白。结论作为一种来源于人类生活环境的心血管毒物,丙烯醛能加剧缺氧复氧H9c2心肌细胞的损伤,可能与cyt c由线粒体释放到细胞浆、激活caspase级联反应导致线粒体功能损伤有关。     

胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究胡黄连提取物对缺氧/复氧后肾小管上皮细胞氧化应激的保护作用和机制。方法:采用小鼠肾小管上皮细胞建立缺氧/复氧损伤模型,分别用不同梯度浓度胡黄连苷Ⅱ(1,10,100,1 000μg/ml)进行药物干预。MTT法检测细胞活性,BCA蛋白质分析试剂盒检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,免疫组化检测Bax蛋白的表达,Western Blot法检测高迁移率族蛋白(HMGB1)的表达,Realtime PCR检测Bax和Bcl-2mRNA表达。结果:与正常组相比,各缺氧/复氧组细胞内氧化应激水平增高,凋亡细胞或死亡细胞数量明显增加。与单纯缺氧/复氧组比较,不同浓度梯度的胡黄连苷Ⅱ可抑制细胞内的氧化损伤。胡黄连苷Ⅱ使肾小管上皮细胞增殖活性增强,细胞凋亡数量减少,培养液中MDA含量下降、SOD活性增强,Bax蛋白和HMGB1蛋白表达下调,Bax mRNA水平下调,Bcl-2mRNA水平上调。结论:缺氧/复氧导致肾小管上皮细胞内氧化应激增强,胡黄连苷Ⅱ能通过抑制肾小管细胞内氧化应激来改善缺氧/复氧后的细胞凋亡和坏死。     

Caco-2细胞缺氧复氧损伤时母乳对促炎细胞因子表达的影响

目的：研究母乳对坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis, NEC）炎症细胞的分子保护机制。方法通过建立Caco-2细胞缺氧复氧损伤模型,向正常细胞和缺氧复氧损伤模型细胞分别加入常规培养液、未加热乳清、加热灭活乳清。继续培养6 h后用ELISA法检测Caco-2细胞分泌于培养液中的促炎细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平。结果正常细胞组,未加热乳清和加热灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6水平,未加热乳清较加热灭活乳清下调明显,两者之间差异有统计学意义;缺氧复氧损伤后IL-1β、IL-6、TNF-α均明显表达,未加热乳清和加热灭活乳清均可下调IL-1β、IL-6、TNF-α水平,差异有统计学意义,未加热乳清较加热灭活乳清下调IL-1β明显。结论母乳上清液可下调Caco-2炎症细胞促炎细胞因子IL-1β、IL-6的表达,尤其缺氧复氧损伤后TNF-α也下调明显,此类机制可能为母乳防治NEC的作用机制之一。     

人小肠上皮细胞缺氧复氧损伤的预防研究

应用原代培养人小肠上皮细胞（IEC），观察缺氧复氧（A／R）对体外培养人IEC的损伤作用。结果表明：A／R可使IEC细胞存活率下降和乳酸脱氨酶（LDH）漏出增加，二者呈显著的负相关，其变化程度与A／R时间有依从关系。在缺氧前或缺氧后复氧前联合应用超氧化物歧化酶和过氧化氢酶可减轻A／R诱发的细胞存活率下降和LDH漏出量增加，应用别嘌呤醇世有同样的保护作用。表明：人IEC在复氧时可产生超氧基并引起细胞损伤。     

瘦素对缺血缺氧损伤脑星形胶质细胞凋亡的影响

目的 研究瘦素对缺血缺氧/复氧损伤星形胶质细胞凋亡的影响及其作用机制.方法 制作缺血缺氧大鼠脑皮质星形胶质细胞损伤模型,MTT法检测星形胶质细胞活力;采用Annexin V-FITC试剂盒检测星形胶质细胞凋亡;RT-PCR和Western blot方法检测凋亡相关基因bcl-2、bax、caspase-3的表达.结果 与缺血缺氧损伤组比较,瘦素干预组星形胶质细胞存活率升高(P<0.01)、凋亡率下降(P<0.01);抑凋亡基因bcl-2 mRNA和蛋白表达水平上调(P<0.01),促凋亡基因bax、caspase-3 mRNA和蛋白表达水平下调(P<0.01),呈剂量依赖性.结论 瘦素能够使凋亡相关基因bcl-2表达上调、bax和caspase-3表达下调,从而抑制缺血缺氧损伤星形胶质细胞发生凋亡.     

异丙酚对缺氧复氧损伤人血管内皮细胞caspase-3和Bcl-2蛋白表达的影响

目的探讨异丙酚对缺氧复氧损伤所致人血管内皮细胞凋亡及caspase-3、Bcl-2蛋白表达的影响。方法建立人脐静脉内皮细胞缺氧复氧损伤模型。将细胞缺氧培养30min再复氧,或加入不同浓度异丙酚孵育30min后再进行缺氧复氧处理,在复氧不同时相点（2、6、24和48h）以流式细胞仪计数凋亡细胞数量,并采用免疫细胞化学方法检测caspase-3和Bcl-2蛋白表达的变化。结果缺氧复氧后内皮细胞呈现典型的凋亡形态,复氧2h凋亡细胞数量开始增加,复氧6h时升高显著,至24h达峰值;异丙酚明显抑制复氧后细胞凋亡的发生。正常体外培养人血管内皮细胞Bcl-2蛋白表达较低,随复氧时间延长Bcl-2表达明显下调;25μmol/L异丙酚预处理可使复氧后内皮细胞Bcl-2表达升高,与相应缺氧复氧组比较差异有显著性（P〈0.01）,50、100μmol/L异丙酚组作用相似,不同浓度异丙酚作用呈现一定的剂量效应关系。缺氧复氧损伤使caspase-3蛋白表达增强,复氧24h后达高峰;异丙酚预处理以剂量依赖方式显著下调caspase-3表达（P〈0.01）。结论异丙酚降低缺氧复氧损伤所致的内皮细胞凋亡,可能与其抑制缺氧复氧引起的caspase-3活化、上调Bcl-2蛋白表达有关。     

人脐带间质干细胞来源的外切体对大鼠心肌细胞缺血/再灌注损伤的作用

［摘要］目的： 研究人脐带间质干细胞来源的外切体（hucMSC exosome）对大鼠缺血/再灌注（I/R）损伤心肌细胞的修复作用。方法： 在体内,建立大鼠I/R模型：经冠状动脉左前降支（LAD）结扎缺血30 min后取消结扎恢复灌注,与此同时,尾静脉注射hucMSC exosome。在体外,建立大鼠H9C2(2 1)心肌细胞缺氧/复氧（H/R）模型：细胞于无血清低糖培养基中缺氧（5% CO2/93% N2）24 h后,用含hucMSC exosome的高糖10% FBS培养液复氧24 h。采用MTT法、TUNEL法、心肌酶谱以及线粒体膜电位等方法检测大鼠心肌细胞的增殖和凋亡状况。结果： 在体内,心肌细胞经I/R损伤后,hucMSC exosome与hucMSC处理组较PBS处理组血清乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶同工酶（CK MB）值均下降;TUNEL结果显示,前两组较PBS处理组心肌细胞凋亡明显减少;在体外,心肌细胞经H/R损伤后,MTT实验表明细胞增殖显著减弱,hucMSC exosome作用后,TUNEL及线粒体膜电位(ΔΨm)结果分别显示受损心肌细胞凋亡以及膜电位下降明显减少。结论： hucMSC exosome能有效抵抗心肌细胞因缺血/再灌注损伤而引起的细胞凋亡。     

JNK信号传导通路在星形胶质细胞缺氧/复氧后损伤的作用

目的 建立SD大鼠星形胶质细胞（astrocyte,AC）缺氧/复氧损伤模型,探讨JNK信号转导通路与星形胶质细胞损伤的关系.方法 体外培养新生SD大鼠星形胶质细胞,传至第3代,细胞自然纯化,实验设正常对照组（N）、SP600125组（SP组,10 μmol /L）、缺氧/复氧组（H/R组）和缺氧/复氧＋SP600125组（H/R＋SP组）.分别利用MTT法、AnnexinV/碘化丙啶（propidium iodide,PI）双染法、WB法检测缺氧8 h,复氧4、6、12、24 h时细胞存活率、凋亡率、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、磷酸化JNK（p-JNK）的变化.结果 ①缺氧/复氧后细胞活力出现明显下降,SP600125阻断JNK通路后细胞活力高于H/R组;②缺氧/复氧后细胞凋亡率增加,SP600125阻断JNK通路后能够减轻细胞凋亡.③各组AC的JNK水平无显著变化,缺氧/复氧干预后p-JNK表达上调,用SP600125阻断JNK通路后,H/R＋SP组较H/R组p-JNK水平降低.结论 JNK信号通路参与了星形胶质细胞缺氧/复氧损伤过程.     

Nrf2/HO-1通路通过调控内质网应激改善小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用研究

目的：探讨Nrf2/HO-1信号上调对小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的改善作用及相关机制。方法：小鼠原代心肌细胞分为正常培养处理和缺氧/复氧处理,其中缺氧/复氧处理的心肌细胞分为模型组、Nrf2过表达组、HO-1过表达组、HO-1沉默+Nrf2过表达组。采用MTT法检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡,ELISA法检测细胞培养上清中心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量,荧光定量PCR检测内质网应激相关分子水平。结果：小鼠心肌细胞缺氧/复氧处理后,心肌细胞活性降低、细胞凋亡增加及细胞培养上清中cTnⅠ和CK-MB含量升高(P<0.05)。Nrf2或HO-1过表达可有效减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤(P<0.05)。给予HO-1基因沉默预处理后,Nrf2过表达产生的细胞保护作用明显减弱(P<0.05)。此外,缺氧/复氧处理后,心肌细胞内GRP78、ATF6、CHOP和Caspase-3的mRNA表达量升高(P<0.05)。Nrf2或HO-1过表达引起GRP78、ATF6、CHOP和Caspase-3表达水平下调(P<0.05),而下调...     

比索洛尔预处理对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤的影响

目的研究比索洛尔预处理对缺氧/复氧诱导的大鼠心肌细胞损伤的保护作用,并探讨该作用的机制。方法对大鼠心肌细 胞株（H9c2）进行缺氧复氧（6 h/2 h）,模拟大鼠心肌缺血再灌注损伤模型,将H9c2细胞随机分成4组：正常对照组（control组）、缺 氧/复氧组（H/R组）、缺氧/复氧+比索洛尔预处理组（H/R+B组）、缺氧/复氧+比索洛尔预处理+PI3K/AKT阻滞剂LY294002组（H/ R+B+LY组）;分别采用MTT法检测心肌细胞活力,流式细胞仪法检测心肌细胞凋亡、ROS水平,Western免疫印迹法检测心肌 细胞p-AKT及p-GSK3β蛋白表达情况。结果与正常组相比,H/R组细胞活力下降,细胞凋亡率增加、ROS水平升高;经比索洛 尔预处理后,细胞活力明显提高,细胞凋亡率下降、活性氧水平降低,p-AKT/GAPDH、p-GSK3β/GAPDGH显著提高,而加入 PI3K/AKT阻滞剂LY294002后比索洛尔的保护作用消失。结论比索洛尔能减少缺氧/复氧所引起的氧化应激,对心肌细胞具 有明显的保护作用,其作用机制是通过激活PI3K/AKT/GSK3β通路而提高AKT、GSK3β磷酸化水平,减少ROS产生,增加细胞 的活性实现的。     

Dipeptide transport: an active process with energy- and proton-dependence in the human intestinal cell line, Caco-2

Transport of protein in the form of small peptides(di/tripeptides)across the small intestinal wall is amajor route of dietary protein absorption.The dipeptidetransporter,PepT1,is known to be located in the in-testine and the kidney,and plays an important …     

谷氨酸转运体在体外培养大鼠皮质星形胶质细胞机械性损伤中的表达变化

【目的】研究机械性损伤后星形胶质细胞内谷氨酸转运体的表达变化，并探讨其在细胞损伤过程中可能的作用机理。【方法】采用免疫组化方法对培养的细胞进行鉴定，流式细胞术和Western Blotting定量谷氨酸转运体蛋白的表达改变。【结果】流式细胞术结果表明，机械性划伤12h和24h后，谷氨酸转运体（EAATl）蛋白表达均较对照组显著增加（P〈0．05），而损伤12h和24h组组间无显著差异（P〉0．05）；Western blotting显示，对照组、机械性划伤12h和24h组谷氨酸转运体（EAATl）蛋白表达吸光度（A）相对值为：0．21、0．44和0．46。与对照组比较，损伤后12h和24h星形胶质细胞EAATl的蛋白表达均明显升高（P〈0．05），损伤两组间表达无显著性差异（P〉0．05）。【结论】机械性损伤可导致星形胶质细胞内EAATl的表达明显升高，提示其可能在脑损伤的发生发展以及修复过程中起到了一定的作用。     

IDENTIFICATION OF GLUCOSE TRANSPORTER－1 AND ITS FUNCTIONAL ASSAY IN MOUSE GLOMERULAR MESANGIAL CELLS CULTURED IN VITRO

Objective. To evaluate the role of glucose transporter-1 (GLUT1) in the glucose uptake of glomerular mesanglal cells. Methods. Cultured C57/SJL mouse mesangial cells were used in the study. The expression of GLUT1 mRNA was detected by RT-PCR. The expression of GLUT1 protein was detected by immunofluorescence and flow cytometry. The uptake of glucose and its kinetics were determined by 2-deoxy-[3H] -D-glucose uptake. Results. Both GLUT1 mRNA and protein were found in mouse glomerular mesangial cells. 2-deoxy-D-glucose uptake and kinetics assay showed that this glucose transporter had high affinity for glucose and the glucose uptake specificity was further confirmed by phloretin. Conclusion. Functional GLUT1 did present in mouse mesangial cells cultured in vitro and it might be the predominant transporter mediated the uptake of glucose into mesangial cells.     

tBHQ和Sulforaphane对Caco2细胞Nrf2-ARE信号通路的影响

目的:研究抗氧化性诱导剂(激活剂)叔丁基对苯二酚(tert-butylhydroquinone,tBHQ)和莱菔硫烷[1-异硫氰酸-(4R,S)-(甲基亚磺酰基)丁烷](sulforaphane,SFN)对人结肠癌细胞株Caco2的Nrf2-ARE信号通路的影响.方法:选取不同的时间点,分别用20 μmol/L tBHQ和5 μmol/L SFN处理Caco2细胞,从蛋白质水平、mRNA水平和蛋白质定位3个方面,分别用Western blotting、real-time PCR和免疫荧光染色(immunoflourescence staining,IF)方法来检测Nrf2以及其调控基因AKR1C1和NQO1(Western blotting,real-time PCR)表达的变化.结果:细胞核中Nrf2基因表达的最佳时间点为加药诱导后8 h,细胞质中Nrf2调控基因AKR1C1和NQO1表达的最佳时间点为加药诱导后16 h.tBHQ的诱导作用在撤去之后仍能持续4 h.结论:本研究使用激活剂tBHQ和SFN对Caco2细胞的Nrf2-ARE信号通路进行诱导,取得了最佳的诱导时间点,并研究了撤去tBHQ后持续诱导时间,为今后在肿瘤化学预防研究中,筛选合适的激活剂及其剂量和使用次数提供了重要依据,也为研究Nrf2-ARE信号通路的抑制剂提供了重要信息.     

犬低血流心肌缺血诱导GLUT1基因表达增加

目的：通过检测低血流心肌缺血后心肌细胞葡萄糖转运子1(GLUT1)基因的表达,探讨心肌细胞对葡 萄糖摄取增加的代谢机制。方法：建立犬低血流心肌缺血模型,放射 性核素标记方法检测心肌葡萄糖摄取量和GLUT1数量,采用Northern印迹法分析缺血心肌GLU T1 mRNA表达,采用免疫印迹法分析心肌GLUT1多肽表达。结果：与正 常心脏比较,低血流心肌缺血后,缺血心肌GLUT1 mRNA和GLUT1多肽表达明显增加,分别为 正常心肌的3.6倍和1.6倍(P<0.01)。无论在正常或缺血心脏,GLUT1表达均无部位差异 。结论：心肌缺血能诱导缺血心肌局部GLUT1表达增加,致使心肌细胞 在低血流心肌缺血过程中葡萄糖摄取和代谢增强。GLUT1表达增强可能是一种重要的心肌缺 血后代偿性保护机制。     

Anti-microRNA-221通过上调PTEN蛋白表达增加结直肠癌细胞的放射增敏性

目的探讨下调microRNA-221（miR-221）表达对人结直肠癌细胞的放射敏感性的影响及其分子机制。方法常规培养人
结直肠癌Caco2细胞系,以脂质体转染反义miR-221（anti-miR-221）后,应用实时荧光定量PCR（Real-time Q-PCR）检测Caco2
细胞中miR-221和PTEN mRNA表达水平,应用Western-blot分析肿瘤细胞中PTEN蛋白表达变化;不同处理组的肿瘤细胞经
照射后,流式细胞仪检测各处理组细胞的死亡情况。结果Real-time Q-PCR显示转染anti-miR-221后miR-221的表达水平明显
下调（P<0.05）,同时PTEN蛋白表达增高（P<0.05）;流式细胞仪检测可见anti-miR-221转染组及anti-miR-221转染联合照射组
死亡细胞比例均明显增多（P均<0.01）,转染anti-miR-221可明显提高Caco2细胞的放射敏感性,且此效应能被PTEN-siRNA部
分但不完全阻断。结论Anti-miR-221可通过上调PTEN蛋白表达增加结直肠癌细胞的放射敏感性。
     

HO-1激动剂Copp对放射所致内皮细胞凋亡的抑制作用

目的探讨血红素加氧酶1(HO-1)在放射所致内皮细胞凋亡中的作用。方法预先通过HO-1激动剂Copp和(或)HO-1抑制剂Znpp分别处理人血管内皮细胞EA.hy926。然后,预处理后的部分细胞接受8 Gy的照射。分别通过Western blotting和流式细胞仪检测EA.hy926细胞HO-1蛋白、细胞色素C的表达以及EA.hy926细胞的凋亡率。结果PBS R组EA.hy926细胞经8 Gy照射后低表达HO-1蛋白;而细胞先经Copp和(或)Znpp处理后,再行8 Gy照射,其HO-1蛋白的表达则显著增高(P<0.01)。与Znpp R组相比,Copp R组的增高较为明显(P<0.01);另外,Copp R组HO-1蛋白的表达低于Copp Znpp R组(P<0.01)。进一步通过流式检测各组细胞凋亡的情况显示,与其他各组相比,Copp R组细胞的凋亡率最低(P<0.01),这与相应各组细胞细胞色素C的表达水平结果一致。结论诱导并激活HO-1能够减少放射所致的内皮细胞凋亡。     

Cu-ATSM保护内皮细胞糖氧剥夺再灌注损伤的机制

目的：探讨铜-二乙酰-2(N⁴-甲基氨基硫脲)(Cu-ATSM)对糖氧剥夺再灌注(OGD/R)后人脐静脉内皮细胞(HUVECs)凋亡的作用及其潜在机制。方法：将体外培养的HUVECs分为Control组、OGD/R组、OGD/R+Cu-ATSM组;采用流式细胞术检测HUVECs的凋亡情况;采用Mito-tracker染色检测线粒体形态;JC-1染色分析各组线粒体膜电位的变化;采用蛋白质印迹法(Western blot)检测各组自噬相关蛋白如ATG5、Beclin1、LC3Ⅰ/Ⅱ的激活情况;采用免疫荧光检测各组细胞LC3Ⅱ的表达情况。结果：流式细胞术结果显示,与Control组比,OGD/R损伤后HUVECs凋亡数目显著上升,而当Cu-ATSM治疗后,凋亡的HUVECs显著减少(均P<0.05)。Mito-tracker及JC-1染色结果显示,与Control组比,OGD/R组损伤后线粒体的形态明显受到损伤,线粒体功能受损,膜电位下降,而OGD/R+Cu-ATSM组治疗后能够改善损伤的线粒体功能,维持线粒体形态和线粒体膜电位(均P<0.05)。Weste...     

Src 激酶抑制剂PP2对星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的探讨Src激酶抑制剂PP2对大鼠星形胶质细胞缺氧/复氧损伤的保护作用。方法实验分为正常对照组,缺氧/复氧组
（H/R;缺氧8 h/复氧24 h）,PP2 +缺氧/复氧组（PP2+H/R;缺氧前给予10 μmol/L PP2作用24 h）。MTT法检测各组星形胶质细胞
存活率,流式细胞术测定各组星形胶质细胞凋亡率,Western blotting法检测各组星形胶质细胞中Src激酶、Bax及Bcl-2的蛋白
表达。结果MTT检测结果显示H/R 损伤后细胞存活率降低,而在使用PP2预处理后细胞存活率增加（P<0.01）;流式细胞术实
验结果显示H/R 损伤后细胞凋亡增加,而在使用PP2预处理后细胞凋亡显著减少（P<0.01）;Western blotting法检测结果显示H/
R 损伤后Src激酶表达增加,用PP2预处理后Src激酶表达降低。H/R 损伤后凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2的比值增加,在用PP2预
处理后Bax/Bcl-2的比值显著降低（P<0.01）。结论PP2可对星形胶质细胞H/R损伤起保护作用,其机制可能与抑制Src激酶的
蛋白表达和激活抗凋亡机制有关。