实时荧光定量PCR检测鸟苷酰环化酶C基因表达方法的建立

目的建立实时荧光定量PCR(RFQ-PCR)检测鸟苷酰环化酶C(GC-C)基因表达的方法。方法在GC-C基因高保守区设计了特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,根据标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中GC-C mRNA含量,并以GC-C mRNA和β2M mRNA含量的比值作为评价GC-C表达水平的指标。结果本法检测GC-C mRNA含量的线性范围为101pg／ml-109pg／ml,样本批内和批间CV值分别为6．87％一11．12％和8．86％- 15．19％。30例健康献血员和11例大肠良性病变患者的外周血单个核细胞(PBMC)中均未检出GC-C mRNA表达,大肠癌患者PBMC的GC-C mRNA检出率为83．8％(31／37),表达水平为0．88±0．06。10例大肠癌组织和T84细胞株均检出GC-C mRNA,表达水平分别为每μg组织(0．86±0．07)和每个细胞0．0082。结论成功建立RFQ-PCR检测GC-C mRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度、特异性和可重复性。     

人Toll样受体3基因表达水平的实时荧光定量PCR测定

目的建立检测人Toll样受体3（TLR3）mRNA表达水平的实时荧光定量逆转录PCR（FQ-RT-Pert）法，及探讨其在外周血单个核细胞（PBMC）中的表达水平。方法用Beacon Designer2．1软件设计TLR3基因特异性引物和荧光探针，逆转录扩增目的片段，构建重组体pMD18-T-TLR3作为定量标准品。在ABIPrism7000型荧光定量分析仪上，通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板，建立标准曲线；并检测30名正常人及20例原发性胆汁性肝硬化（PBC）患者，20例慢性乙型肝炎肝硬化患者外周血PBMCTLR3基因的荧光强度，根据标准曲线及循环阈值，由软件自动计算样本中TLR3mRNA的起始拷贝数。结果FQ-RT-PCR检测TLR3基因的线性范围为10^2～10^8拷贝数／μl RNA（r=0．9974），内参β-actin的线性范围为10^3～10^8拷贝数／μl RNA（r=-0．9984）；高浓度样本批内和批间变异系数（CV）分别为6．7％和8．7％，低浓度样本批内及批间CV分别为12．3％和14．0％，30名健康人，20例PBC及20例慢性乙型肝炎肝硬化患者PBMC中均有TLR3 mRNA的表达，分别为3．46×10^2～4．51×10^3拷贝／μg RNA、4．92×10^2～1．42×10^4拷贝／μg RNA和2．58×10^2～7．17×10^3拷贝／μg RNA。结论成功建立检测TLR3 mRNA的FQ-RT-PCR方法，可作为临床和基础研究TLR3基因表达的工具。     

荧光定量RT-PCR检测糖尿病病人PBMC中TGF-β1表达水平

目的：应用荧光定量逆转录聚合酶链反应（FQ—RT—PCR），检测糖尿病病人外周血单个核细胞（PBMC）中TGF-β1mRNA的表达水平。方法：分离外周血单个核细胞，用Trizol裂解液提取总RNA，逆转录为cDNA，在扩增体系中加入SYBR Green I，应用FQ—RT—PCR定量检测TGF-β1mRNA。结果：重组质粒测序证明插入的片断为TGF-β1特异性片断。荧光定量RT—PCR检测TGF—β1mRNA的灵敏度达10^5拷贝／ml，线性范围为10^5～10^11拷贝／ml，批内、批问变异系数分别为2．27％～2．56％和4．78％～5．22％．临床应用显示．糖果病惠者PBMC中TGF—β1 mRNA含量显著高于正常。结论：FQ-RT-PCR检测TGF-β1mRNA具有灵敏、特异、快速等特点．为临床应用提供了方法学依据。     

VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA实时荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的建立检测血管内皮生长因子-C（VEGF-C）mRNA和血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FO-RT-PCR）方法,并在食管癌组织中作初步应用。方法采用TaqMan荧光探针技术,分别以pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,应用循环阈值（Ct）定量起始模板,建立检测食管癌组织的VEGF-CmRNA和VEG—FR-3tuRNA的实时FQ-RT-PCR方法。结果所建方法的线性范围：VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA均为10^3～10^8拷贝／μg总RNA;测定VEGF-C mRNA低值的批内、批间变异系数（CV）分别为7．07％和9．04％,测定VDGF-CmRNA高值的批内、批间CV分别为7．55％和10．28％;测定VEGFR-3mRNA低值的批内、批间CV分别为7．69％和12．49％,测定VEGFR-3mRNA高值的批内、批间CV分别为7．31％和9．17％。24例淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEG—FR-3 mRNA的测定范围分别为3．69×10^4～9．44×10^6拷贝／μg总RNA和2．54×10^4～8．03×10^6拷贝／μg总RNA,均值分别为2．18×10^6拷贝／μg总RNA和2．27×10^6拷贝／μg总RNA。16例无淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的测定范围分别为2．32×10^3～5．85×10^5拷贝／μg总RNA和7．31×10^2～8．21×10^4拷贝／μg总RNA,均值分别为1．08×10^5拷贝／μg总RNA和1．68×10^4拷贝／μg总RNA。提示有淋巴结转移的食管癌组织VEGF-C和VEG—FR-3基因表达水平上调。结论本组建立的检测VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的实时FQ-RT-PCR方法灵敏、准确、稳定、重复性好,可供VEGF-C、VEGFR-3基因表达的临床检测和研究应用。     

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测外周血单个核细胞TRAIL-mRNA

目的 建立TaqMan实时荧光定量RT-PCR（rQ-RT-PCR）检测外周血单个核细胞（PBMC）中肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）mRNA含量的方法,探讨PBMC中TRAIL mRNA的检测价值.方法 在TRAIL基因第二和第三外显子区设计特异性引物和荧光探针,用RT-PCR扩增目的片段,实时检测产物的荧光强度,以标准品建立标准曲线,软件自动计算出待测样本中TRAIL mRNA含量,以TRAIL mRNA和β2M mRNA含量的对数比值进行TRAIL mRNA表达水平评价.结果 TRAIL mRNA含量线性范围为（2.9×10^3～2.9×10^9）copies/ml,批内和批间变异系数分别为9.5%和16.7%.30例健康献血员和58例慢性乙肝患者TRAIL mRNA与β2M mRNA浓度的对数比值的（x）±s分别为0.528±0.014和0.775±0.038,两组差异显著,P＜0.001.结论 FQ-RT-PCR检测TRAIL mRNA水平具有较好的灵敏度和重复性,适用于临床研究.     

系统性红斑狼疮患者B细胞激活因子mRNA定量测及其意义

目的建立实时荧光定量PCR(RFQ PCR)检测人B细胞激活因子(BLyS)mRNA含量的方法,初步探讨BLyS表达水平与系统性红斑狼疮(SLE)的相关性。方法在BLyS基因保守区设计特异性的引物和荧光探针,RT PCR扩增目的片段并实时检测产物的荧光强度,以标准品建立标准曲线,由软件自动计算出待测样本中BLySmRNA含量,并以BLySmRNA和内参β2M mRNA含量的比值作为评价BLyS表达水平的指标。结果本法检测BLySmRNA含量的线性范围为109pg/ml～101pg/ml,批内和批间变异系数(CV)分别为2.4%～7.4%和4.3%～12.3%。SLE患者BLySmRNA表达水平(1.45±0.33)显著高于健康献血员(0.88±0.13),P<0.01,而且与血清IgG水平和抗ds DNA抗体滴度有显著相关性。结论建立RFQ PCR检测BLySmRNA含量的方法,具有较好的检测灵敏度和重复性;BLyS在SLE的发生、发展及预后等方面可能具有重要作用。     

实时荧光定量PCR测定人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因表达

目的 建立检测人肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因表达含量的实时荧光定量逆转录(FQ-RT)-PCR法,探讨其在健康对照者、乙型病毒性肝炎肝硬化患者及原发性胆汁性肝硬化(PBC)患者外周血单个核细胞(PBMC)中的表达状况.方法 设计TRAIL基因的特异性引物和TaqMan-MGB探针,以β-actin基因为内参,RT-PCR扩增目的 片段.胶同收纯化目的 片段,构建克隆载体作为定最模板,在ABI Prism7000型荧光定量分析仪上进行扩增,建立标准曲线;同时检测30名健康对照者、30例PBC患者及25例乙型病毒性肝炎肝硬化患者外周血PBMC中TRAIL基因的荧光强度和循环阈值,计算样本中TRAIL基因的起始拷贝数.结果 FQ-RT-PCR检测TRAIL mRNA的线性范围为103-106拷贝/ug RNA(r=-0.997);高浓度样本批内和批间变异系数(CV)分别为5.6%和6.3%.低浓度样本批内及批间CV分别为12.5%和14.6%.PBC患者TRAIL mRNA表达量为[(3.3±2.5)×105拷贝ug RNA],高于健康对照组[(0.5±0.2)×105拷贝/ug RNA],两组差异有统计学意义(t=5.994,P<0.01);乙型病毒性肝炎肝硬化患者TRAIL mRNA的表达[(2.1±0.9)×105拷贝/ug RNA]亦高于健康对照组,且差异有统计学意义(t=8.536,P<0.01),而两疾病组间差异无统计学意义(t=1.988,P>0.05).结论 成功建立检测TRAIL mRNA的FQ-RT-PCR法,并初步发现TRAIL mRNA在PBC及乙型病毒性肝炎肝硬化患者外周血PBMC中表达升高,这将对肝硬化肝损伤机制研究提供新的思路.     

TLR4 mRNA在中国HIV/AIDS患者外周血单个核细胞中的表达及其与疾病进展关系的研究

目的通过实时荧光定量PCR（RT-PCR）的方法检测中国HIV／AIDS患者外周血单个核细胞（PBMC）中TLR4 mRNA的表达水平，探讨TLR4 mRNA表达水平与HIV感染后疾病进展的关系。方法构建pUCm-TLR4质粒作为定量模板，在LightCycler检测仪上测定62例HIV／AIDS患者和30名健康对照者PBMC中TLR4 mRNA的含量。结果（1）HIV／AIDS患者PBMC中TLR4 mRNA的表达范围是（4．0×10^5-1．04×10^8）拷贝／μg RNA，显著高于健康对照组的（4．5×10^5-1．25×10^6）拷贝／μg RNA，（P〈0．01）。（2）在HIV／AIDS患者组中，艾滋病（AIDS）组外周血中，TLR4 mRNA的含量高于HIV慢性感染（HIV）组及长期不进展（LTNP）组，HIV组高于LTNP组（P〈0．05），LTNP组与对照组比较差别无统计学意义。（3）HIV／AIDS患者外周血中TLR4 mRNA的含量与HIV-1RNA病毒载量呈显著正相关（r=0．697，P〈0．01）。结论成功建立了人TLR4 mRNA表达水平的荧光定量检测方法；中国HIV／AIDS患者外周血单个核细胞中TLR4 mRNA的含量显著高于健康对照组，且与疾病进展密切相关。     

实时逆转录聚合酶链反应检测细胞因子表达相对定量方法的建立

目的 建立一种实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞因子表达相对定量方法。方法 以肿瘤坏死因子α(TNFα)为待测基因，以葡萄糖3—磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照进行检测。当靶基因和内参照基因片段克隆入载体后，进行纯化和定量及系列稀释，建立标准曲线，确定实时RT-PCR的扩增效率；同时优化反应条件，使扩增效率接近100％。然后，检测14份待检标本的TNFα和GAPDH的循环阈值(Ct)。结果 该法检测的最低拷贝数为10^3，线性范围为10^3～10^9拷贝，批内变异系数(CV)和批间CV分别为1％和8％。采用2^△△Ct法进行数据分析后，处理组TNFα的相对表达量比对照组高8．6—9．8倍，平均为9．2倍。结论 新建立的方法敏感，重复性好，数据处理简便、可靠，适用于检测任何基因的相对表达。     

一种快速检测HBV基因的荧光定量PCR法的建立

目的：利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法：根据HBV基因组保守区域precore／core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果：所建方法的检测范围为10^1～10^8 copies／μl,灵敏度达到10copies／μl,低拷贝样品的批内和日间重复性（CV）分别为1．71％和2．57％,高拷贝样品的批内和日间GV,分别为3．00％和3．86％。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min（约减少1／3）,成本降低50％。结论：成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。     

产科新生儿不同部位经皮测黄报警预值的可靠性观察

目的对比观察产科新生儿不同部位经皮胆红素（TCB）报警预值的可靠性。方法132例产科新生儿采取随机数字分组法分为正常产组和剖宫产组各66例,新生儿均于产后第4天同一时间点应用KJ8000经皮测黄仪分别测量额、胸、腹、额胸、额胸腹TCB值,TCB〉12．9mg／dl者,取得亲属同意抽取静脉血检测血清胆红素（SB）,对比分析不同部位TCB及其与sB值的差异。结果两组分别有17例或21例达到TCB报警预值。两组TCB或sB相同方法及相同部位比较,差异无统计学意义（P〉0．05）;两组TCB不同部位对比,额部值最低、胸部值最高,且与其他部位同组对比差异均有统计学意义（P〈0．01）;两组sB值对比差异无统计学意义（t=1．53,P〉0．05）,与不同部位TCB对比均以胸部数值差异无统计学意义（P〉0．05）,而与其他部位TCB两组差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论正常产与剖宫产新生儿术后sB对比差异无意义;TCB动态监测以胸部结果更接近SB。     

韶关市农村留守儿童孤独感状况调查

目的了解广东省韶关市农村地区留守儿童孤独感现状及其影响因素。方法对韶关市某地区两所农村小学3～6年级学生中的489名留守儿童采用儿童孤独量表和自编调查表进行问卷调查。结果17．6％留守儿童存在孤独感,不同性别孤独感发生率无差异性,不同年龄及不同年级间孤独感发生率差异均有极显著性（P〈0.01）;随年级增加,孤独感发生率呈下降趋势（X^2趋势=5．970,P〈0.05）。留守儿童孤独感与健康状况、学习成绩、学习困难程度、父母教育方式、父母间关系和老师教育方式等因素显著相关（P〈0.01～0．05）。结论农村地区留守儿童中存在一定程度的孤独感问题,老师和家长应以正确的态度和方法对待留守儿童,以减少其孤独感的发生。     

31例误诊哮喘原因分析

目的通过对中央气道不全性梗阻和支气管结核、术后痰栓形成误诊为支气管哮喘的分析,探讨误诊原因及正确诊断的方法。方法对误诊为支气管哮喘的3l例患者的临床资料进行分析。结果临床特征以刺激性咳嗽为主,其次为活动后胸闷、气促,肺部闻及哮鸣音,胸部影像学多无特征性改变或极易漏诊,支气管舒张试验阳性率低,诊断前缺乏气管镜及病理检查,均误诊为支气管哮喘。结论中央气道不全梗阻性病变或炎性病变包括支气管结核、术后痰栓形成时原发疾病症状不典型,肺部影像学检查无异常表现或极易漏诊,故该类以表现为咳嗽、喘息、活动后胸闷,进而出现严重呼吸困难的患者常被误诊为支气管哮喘,延误诊治。支气管镜及病理检查再结合肺CT是鉴别诊断的重要方法。     

护理干预对提高中风患者生活质量的效果观察

目的探讨提高中风患者生活质量的护理方法。方法将50例中风患者随机分为对照组23例和实验组27例,对照组给予针灸内科常规护理,实验组在此基础上给予心理护理和康复训练。结果两组患者治疗护理后日常生活活动(ADL)能力和贝克抑郁量表(BDI)评分均有好转,但实验组疗效明显优于对照组(P<0.05)。结论实施针对性心理护理和康复训练可明显提高中风患者的治疗效果。     

中国人四肢瘫日常生活能力评定量表的信度研究

目的研究四肢瘫日常生活能力评定量表评测四肢瘫患者的重测信度及观察者间信度。方法由1位评定者应用四肢瘫日常生活能力评定量表对20例四肢瘫患者进行评定,评定后1周内再次对该患者进行评定;另1位评定者在第1位评定者初次评定后2 d内对该患者进行评定。结果第1位评定者两次评定总分的组内相关系数为0.994(P<0.01);第1位评定者与第2位评定者评定总分的组内相关系数为0.971(P<0.01)。结论四肢瘫日常生活能力评定量表具有良好的重测信度及观察者间信度。     

血液透析患者家庭护理提供者的生活质量调查

目的:了解江汉油田血液透析(血液透析)患者家庭护理提供者(护理者)的生活质量。方法:对60例血液透析患者的家庭护理提供者进行一般情况和生活质量综合评定问卷(QOLI-74)调查,并进行相关性和多因素回归分析。结果:家庭护理提供者各维度的主观生活满意度与其客观指标相关,但也与其需求、年龄、文化程度、与患者的关系有关。结论:客观状态是影响主观生活满意度的重要因素,同时应考虑护理者的需求、年龄、文化程度、与患者的关系对护理者主观生活满意度的影响。     

肇庆市居民颈椎病流行病学调查

目的 :调查肇庆市居民颈椎病发病情况及相关问题。方法 :通过分层随机抽样选择该市区18～70岁居民5000人为研究对象 ,入户或至单位询问调查。结果 :该市居民颈椎病发病率为8.11% ,男女差异无显著性 ,随着年龄的增长 ,发病率逐渐增加。经多因素分析 :体位姿势不正确、情绪紧张、潮湿、疲劳是发病的主要诱因。结论 :该病严重影响肇庆市居民的健康 ,做好防治应从早做起 ,综合防治。     

胰腺癌治疗的Cochrane系统评价证据

目的评价胰腺癌治疗的Cochrane系统评价证据,以及纳入系统评价的临床随机对照试验（RCT）的方法学质量。方法检索Cochrane Library数据库（2009年第4期）中有关胰腺癌治疗的系统评价,并运用RewMan5.0.21对所纳入研究的偏倚进行评估。结果共检索到胆道支架置入术姑息治疗梗阻型胰腺癌的系统评价、放化疗治疗不能手术的进展期胰腺癌的系统评价共2篇系统评价,共纳入79个RCT。依照Cochrane协作网推荐的质量评价方法,对所纳入RCT的偏倚进行评估,表明均存在不同程度的偏倚,方法学质量普遍较低。结论 Cochrane系统评价是公认的最高质量的研究证据,但目前缺少足够强度的证据来支持胆道支架置入术姑息治疗梗阻型胰腺癌的疗效。其他治疗手段的疗效如胰腺癌围手术期的营养支持治疗等还需要通过进一步的完成系统评价来评估。建议推行临床试验透明化,实施临床试验注册制度以及按照CONSORT声明严格规范RCT的报告,以便于总结胰腺癌治疗的临床证据。     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

乳腺叶状肿瘤的影像分析

目的 分析乳腺叶状肿瘤的X线钼靶摄片和超声表现.方法 收集经手术病理证实的19例乳腺叶状肿瘤,术前均行超声检查,其中15例行X线钼靶摄片,回顾分析其临床特点和影像学表现.结果 19例乳腺叶状肿瘤中,良性8例,交界性6例,恶性5例.15例患者X线钼靶摄片中病灶均为高密度孤立肿块影,呈圆形(8例)或浅分叶状(7例),边界清晰(10例)或部分不清(5例),部分肿块周边见"晕"征(4例).超声检查6例发现囊性变,6例表现为后方回声增强.病灶为圆形(8例)、浅分叶状(8例)或有角状突起(3例).所有病例均未发现腋下转移淋巴结及周围组织浸润等恶性征象.结论 认识乳腺叶状肿瘤的病理类型和临床特点,结合影像表现综合分析,可提高术前诊断率.