Malassez上皮剩余对炎症牙周膜干细胞成骨能力的影响

目的:研究人体组织Malassez上皮剩余对炎症组织来源的牙周膜干细胞成骨能力的影响。方法:分别从牙周炎患者及健康者的牙周组织中获得牙周膜细胞,并分别采用低密度法筛选纯化出炎症牙周膜干细胞;差速消化法获得Malassez上皮剩余。用流式细胞术对炎症牙周膜干细胞进行表型鉴定,相差显微镜观察Malassez上皮剩余形态,用transwell小室构建Malassez上皮剩余与炎症牙周膜干细胞的共培养体系。然后取小室的下层炎症牙周膜干细胞,用RT-PCR技术检测ALP和Runx-2 mRNA表达水平;ALP染色及茜素红染色观察其成骨分化能力的变化。结果:成功获得了炎症牙周膜干细胞和Malassez上皮剩余,并顺利构建共培养体系;经成骨诱导后,与Malassez上皮剩余共培养的炎症牙周膜干细胞与单独培养组相比,成骨相关基因ALP、Runx-2 mRNA水平均明显上调(P<0.05),ALP染色加深,形成的矿化结节也明显增多。结论:将炎症牙周膜干细胞与Malassez上皮剩余共培养后可使其成骨分化能力增强。     

兔脂肪源干细胞与牙周膜成纤维细胞共培养的实验研究

目的:研究脂肪源干细胞能否与牙周膜成纤维细胞直接共培养,在共培养状态下,脂肪源干细胞能否促进牙周膜成纤维细胞胶原特异基因的表达。方法:分别从新西兰白兔皮下脂肪和牙周膜组织中分离出脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞,体外常规培养;将两种细胞等量混合共培养,利用光镜和F-actin染色标记细胞骨架的方法观察共培养细胞的形态变化,并与单纯培养的细胞比较;利用DAPI染色标示细胞核细胞计数法检测共培养细胞的增殖情况;利用定量PCR法检测特异基因I型胶原在单纯培养和共培养细胞中的表达。结果:脂肪源干细胞和牙周膜成纤维细胞能直接共培养;共培养细胞形态近似牙周膜成纤维细胞;共培养对细胞增殖无明显影响;脂肪源干细胞可提高牙周膜成纤维细胞I型胶原基因的表达。结论:脂肪源干细胞可与牙周膜成纤维细胞共培养,并促进牙周膜成纤维细胞的胶原分泌。     

TNF-α对人牙周膜细胞表达Asporin的影响

目的：检测TNF-α对人牙周膜细胞Asporin表达的影响,初步探讨Asporin在牙周炎致病过程中扮演的角色,为牙周炎的发病机制研究提供线索.方法：改良酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞,qRT-PCR检测在不同浓度TNF-α （0.5、1、2、5、10 ng/mL）作用下牙周膜细胞Asporin的表达及使用1 ng/mL的TNF-α作用于牙周膜细胞3、6、24和48 h后,牙周膜细胞中Asporin的表达;应用免疫细胞化学检测Asporin在牙周膜细胞中表达定位和在TNF-α作用下的表达变化,其结果用Image-Pro Plus （IPP）软件分析.结果：qRT-PCR结果显示,1ng/mL TNF-o能最大程度降低人牙周膜细胞中Asporin的表达（P＜0.05）,TNF-α作用后3h开始,Asporin表达下降,作用24 h,48 h后,其表达降低最为明显（P＜0.05）.免疫细胞化学的检测结果与qRT-PCR一致.结论：TNF-α能显著下调人牙周膜细胞Asporin的表达,推测Asporin可能参与了牙周炎的发生发展过程.     

间接共培养诱导大鼠骨髓间充质干细胞向牙周膜成纤维样细胞分化

目的：探讨通过间接共培养诱导骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）向牙周膜成纤维细胞（Periodontal ligament fibroblasts,PDLFs）分化的可行性。方法：将大鼠BMSCs与PDLFs间接共培养,分别于不同时间段检测碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）活性以及骨钙素（Osteocalcin,OCN）、Ⅲ型胶原（Collagen typeIII,COLⅢ）mRNA表达的变化。结果：间接共培养后的BMSCs表现出类似PDLFs的性质,各检测指标与单独培养的PDLFs无统计学差异,与单独培养的BMSCs有统计学差异。结论：牙周膜成纤维细胞通过旁分泌机制可以诱导骨髓间充质干细胞向其分化。     

内皮素-1对牙周膜干细胞肿瘤坏死因子表达的影响

目的:探讨内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)表达的影响。方法:体外培养鉴定牙周膜干细胞,加入不同浓度(1,10,100 nmol/L)的ET-1培养12、24、72 h,以未作任何处理的牙周膜干细胞为对照,采用ELISA及Western blot检测ET-1作用下牙周膜干细胞TNF-α分泌及蛋白表达的改变。结果:与对照组相比,ET-1对牙周膜干细胞TNF-α分泌及蛋白表达具有显著促进作用,且促进作用具有剂量依赖性及时间依赖性。结论:内皮素-1可以诱导牙周膜干细胞分泌TNF-α,而且这种促进作用呈浓度依赖性及时间依赖性。     

TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

LincRNA-EPS对脂多糖诱导的小鼠牙周膜细胞炎症因子表达的影响

目的:探究基因间区长链非编码RNA-EPS(long intergenic noncoding RNA,lincRNA-EPS)对脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)诱导的小鼠牙周膜细胞(mouse periodontal ligament cells,mPDLCs)炎症因子表达的影响.方法:使用C...     

微环境对牙周膜干细胞分化的抑制和诱导作用

牙周膜干细胞(PDLSC)在牙周组织缺损修复和维持牙周动态平衡中起关键性的作用,是牙周组织再生修复治疗的基础细胞.在不同微环境作用下,PDLSC的增殖分化特性呈现出较大的差别.牙周膜干细胞龛和炎症等微环境对PDLSC的分化有抑制作用,然而,牙本质微环境及发育期根尖微环境能促进PDLSC的分化.研究不同的微环境对PDLSC功能的影响,一方面有助于深入研究PDLSC的生物学功能,另一方面为PDLSC应用于牙周疾病的再生治疗提供理论依据.本文就不同的微环境对PDLSC分化的抑制和诱导作用研究进展作一综述,并展望PDLSC在牙周缺损再生治疗中的应用前景.     

TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

牙周膜干细胞来源外泌体的生物学特性分析

目的 采用超速离心,分离牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）来源的外泌体,检测其生物学特性。方法 采用有限稀释法,体外分离、培养人PDLSCs。收集PDLSCs培养上清,采用梯度离心法分离、纯化外泌体。对PDLSCs来源的外泌体进行检测,透射电镜下观察外泌体形态;蛋白质印迹法检测外泌体表面标志CD9、CD63、CD81和TSG101的表达;纳米颗粒跟踪分析（nanosight tracing analysis,NTA）检测PDLSCs来源外泌体的产量及其粒径分布特征。结果 成功分离出PDLSCs来源的外泌体。透射电镜下可见,外泌体为碟形或椭圆形膜性结构,中央电子密度较低。免疫印迹结果显示,分离得到的囊泡表达外泌体特异性标志物CD9、CD63、CD81和TSG101。NTA显示,PDLSCs来源的外泌体浓度为（3.80±0.39）×10⁸颗粒/mL,粒径分布峰值在（119±12.1）nm。结论 采用梯度超速离心法可以得到PDLSCs来源的外泌体,其具有特征性的外泌体膜蛋白成分和形态特征。     

牙周膜干细胞的表型分析

目的:分析人牙周膜干细胞(PDLSCs)的表型特点,为分离、鉴定和应用PDLSCs提供有效途径.方法:采用免疫磁珠法分离PDLSCs,制备细胞爬片.分别采用免疫荧光、免疫细胞化学染色法检测PDLSCs表面蛋白STRO-1、CD44、Vimentin、CK、COL-Ⅰ、BSP的表达.收集PDLSCs,采用RT-PCR法检...     

肿瘤坏死因子对培养人牙周膜成纤维细胞c-fos表达的诱导作用

目的：深入探索肿瘤坏死因子对人牙周膜成纤维细胞的生物学功能影响的机制。方法：将５０００Ｕ／ｍｌ肿瘤坏死因子作用于培养至第三代的人牙周膜细胞３ｈ后，进行ＦＯＳ免疫组化反应。结果：几乎所有的ＰＤＬＦｓ核均染为棕黄色，为ＦＯＳ免疫组化反应阳性，对照组细胞核未见着色。结论：由于ｃ－ｆｏｓ的表达可以提示核内基因的进一步改变，因而从更深的层次上说明肿瘤坏死因子对牙周膜成纤维细胞的生物学功能的影响     

牙周膜干细胞中乙酰基转移酶MORF调控成骨的研究

目的：：比较正常与炎症来源牙周膜干细胞( H-PDLSCs与P-PDLSCs)中乙酰基转移酶MORF表达水平的差异及其对PDLSCs分化的调控。方法：有限稀释法培养H-PDLSCs与P-PDLSCs, LPS、 TNF-α、IL-β及三者混合物体外模拟炎症微环境诱导H-PDLSCs ( IP-PDLSCs );基因与蛋白检测方法对比2种来源 PDLSCs 中 MORF 的表达水平;蛋白检测方法检测 IP-PDLSCs中MORF的表达水平;基因、蛋白检测与茜素红染色方法对比H-PDLSCs及下调MORF基因后的PDLSCs成骨基因表达的差异。结果：与 H-PDLSCs 相比,P-PDLSCs 中 MORF 的表达显著下降(P <0.05);IP-PDLSCs 中 MORF 的表达下降;MORF基因被下调后,PDLSCs成骨能力下降(P<0.05)。结论：牙周炎及炎症微环境会导致PDLSCs中MORF表达的下降,从而使其成骨分化受到抑制。     

牙龈卟啉单胞菌超声提取物对hPDLSCs表达VEGF的影响

目的:观察牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)超声提取物对人牙周膜干细胞(human per-iodontal ligament stem cells,hPDLSCs)表达血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的影响。方法:标准厌氧培养环境下培养Pg,收集细菌菌落,离心,制备细菌的超声提取物,然后以不同的浓度加入hPDLSCs的培养液中。培养6d,分别观察第2、4、6天时hPDLSCs的增殖情况。提取蛋白并用Western Blotting法检测VEGF和MMP-9的表达。结果:与对照组相比,第2天时,10μg/ml和100μg/mlPg轻度促进hPDLSCs的生长,第4天时,10μg/ml和100μg/mlPg则明显抑制hPDLSCs的生长(P<0.05),第6天时,3种浓度的Pg均明显抑制hPDLSCs的生长(P<0.05);1μg/ml和10μg/mlPg上调VEGF的表达,100μg/mlPg明显抑制VEGF的表达;3种浓度的Pg均上调hPDLSCs中MMP-9的表达。结论:作为牙周炎病原菌,大量的Pg可能通过抑制hPDLSCs的生长增殖,抑制局部血管重建以及加速细胞外基质的降解而降低了牙周组织的自我修复能力。     

血小板衍生生长因子BB对牙周膜干细胞生物学特性的影响

目的：观察血小板衍生生长因子BB（platelet derived growth factor BB, PDGFBB）基因修饰人牙周膜干细胞（human periodontal stem cells, hPDLSCs）的生物学特性,探讨PDGFBB对hPDLSCs细胞增殖、迁移及诱导成骨的影响。方法：分离并扩增hPDLSCs,免疫荧光染色鉴定细胞表面标志和成骨诱导分化能力。通过慢病毒载体介导PDGFBB基因转染hPDLSCs,转染后,采用CCK-8及划痕实验检测其对细胞增殖、迁移的影响。利用实时荧光定量PCR分析PDGFBB基因转染后hPDLSCs细胞内成骨相关基因和成血管相关基因VEGF mRNA的表达水平。采用SPSS 22.0软件包对数据进行统计学分析。结果：采用组织块培养及有限稀释法成功获得hPDLSCs。PDGFBB转染hPDLSCs后,细胞形态良好,与空病毒组和未转染组相比,转染组细胞增殖及迁移能力显著上升,OPN、COL-1和VEGF mRNA表达水平显著上调（P<0.05)。结论：慢病毒载体能在体外将PDGFBB基因转入hPDLSCs,获得持续、稳定表达。PDGFBB可促进hPDLSCs细胞的增殖和迁移,上调成骨和成血管相关基因的表达。     

牙周膜干细胞向脂肪细胞方向定向诱导分化实验

目的探讨人牙周膜干细胞（PDLSCs）向脂肪细胞定向分化潜能,分析其分化过程中形态与功能变化。方法免疫磁珠法分离人PDLSCs,用成脂诱导液连续诱导21 d,通过倒置显微镜、透射电镜、流式细胞仪、RTPCR、Western blot及免疫荧光方法观察诱导细胞形态、结构变化,分析其表面脂肪细胞特异性标志---低密度脂蛋白（LPL）和过氧化物酶体增殖物受体γ（PPAR-γ）的基因及蛋白表达时相及表达量,油红O染色检测脂滴分泌情况。结果诱导21 d,诱导细胞呈脂肪细胞样圆形细胞,超微结构观察可见胞浆中大量脂肪细胞特征性脂滴。流式分析结果显示,有96.54%的PDLSCs向脂肪细胞分化。诱导细胞表达脂肪细胞特异性表面标志LPL mRNA和PPAR-γmRNA及PPAR-γ蛋白,且随诱导时间延长PPAR-γ蛋白表达量增加。诱导细胞产生油红O阳性染色的脂滴。结论人PDLSCs在适当条件下可定向分化为脂肪细胞样细胞,并具有脂肪细胞形态、结构和功能特点,具有可塑性。     

大鼠骨髓间充质干细胞与脂肪间充质干细胞生物学特性的比较

目的:本研究旨在比较同一个体来源的脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)和骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生长特点和诱导分化能力。方法:取7～10 d SD大鼠的脂肪和骨髓,体外分离、纯化脂肪和骨髓来源间充质干细胞,分别从细胞形态、生长动力学、表面标志、分化潜能等方面进行鉴定和比较。结果:脂肪间充质干细胞的增殖速度明显大于骨髓间充质干细胞(P<0.05),两种细胞所表达的表面蛋白标志物基本相似,但脂肪间充质干细胞表面蛋白标志CD106呈阴性,而骨髓间充质干细胞CD106呈阳性。在成软骨分化中脂肪间充质干细胞弱表达Ⅱ型胶原,而骨髓间充质干细胞不表达。第5、10、15、20代ADSCs及BMSCs经成骨诱导后茜素红染色均呈阳性且有"矿化"结节形成,碱性磷酸酶活性以第5代最强,随着细胞代次的递增,碱性磷酸酶活性呈递减趋势。结论:ADSCs较BMSCs更易于分离培养及体外扩增,诱导条件下成骨、成脂、成软骨能力较强,适合作为再生医学的种子细胞。     

釉原蛋白对牙周膜干细胞迁移、黏附及增殖的影响

目的：检测釉原蛋白（amelogenin,AML）对牙周膜干细胞（PDLSCs）迁移、黏附和增殖的影响。方法：用0．25、50和100μg／ml 的 AML 培养人 PDLSCs。用划痕实验和 transwell 法检测 AML 对 PDLSCs 迁移的影响。用黏附实验检测 AML 对PDLSCs 黏附的影响。用 MTT 法和计数法检测 AML 对 PDLSCs 增殖的影响。结果：AML 可促进 PDLSCs 的迁移,而且呈剂量效应关系（P ＜0．05）。AML 对 PDLSCs 迁移和黏附有促进作用（P ＜0．05）,且随培养时间延长而增加。AML 可促进 PDLSCs的增殖,且呈剂量效应关系。结论：AML 可促进 PDLSCs 的迁移、黏附和增殖。     

犬牙周膜干细胞用于附着龈组织工程化再生的实验研究

目的：探讨牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells,PDLSCs）复合脱细胞真皮基质（acellular dermal matrix,ADM）对犬附着龈缺损模型再生修复效果,评估其用于附着龈缺损治疗的可行性.方法：原代培养犬PDLSCs,采用免疫磁珠法分离PDLSCs,将Brdu标记的PDLSCs与生物支架材料ADM复合,体外培养5天后植入犬附着龈缺损模型部位.8w时大体测量修复前后附着龈宽度、面积,Brdu免疫组化标记细胞的迁移、分化及转归,组织学观察PDLSCs-ADM复合物修复再生犬附着龈缺损效果.结果：PDLSCs-ADM复合体移植后8w,新生附着龈呈粉红色,与原黏膜组织形成明显界限,其宽度及面积增加量明显高于对照组.组织学结果显示ADM-PDLSCs组上皮结构类似正常附着龈,为复层鳞状上皮,但上皮钉突粗大、圆钝,无角化层.固有层血管、细胞成分较对照组明显增多,胶原纤维丰富.免疫组化显示ADM-PDLSCs组Brdu标记的阳性细胞在上皮基底层及黏膜下层表达,而ADM对照组无表达.结论：PDLSCs复合ADM较ADM单独使用能显著提高犬附着龈缺损修复效果,本实验为牙龈缺损的生物再生修复提供了有效途径.