焦磷酸测序技术快速检测结核分枝杆菌利福平耐药性研究

目的利用焦磷酸测序技术，建立一种高通量结核分枝杆菌利福平耐药性快速基因检测方法。方法应用生物素标记的引物扩增rpoB基因片段，经链亲和素标记的磁珠分离制备单链模板，设计2个测序引物在焦磷酸测序仪上检测rpoB基因耐药突变区的81bp序列突变情况，与H。Rv序列比对后判断耐药结果。结果通过建立的基于焦磷酸测序技术的结核分枝杆菌rpoB基因突变检测平台，32株利福平耐药株均在rpoB基因片段上检测到突变，22株利福平敏感株未检测到突变，检测结果与直接测序符合率达100％。结论本方法可快速、准确、高通量检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。     

用PCR—SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的突变

目的：了解本地区结核分枝杆菌对利福平（RFP）耐药基因的突变情况，探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的试验方法。方法：针对rpoB基因设计一对引物（扩增产物为189bp)，采用聚合链酶反应－单链构象多态性银染（PCR－SSCP）方法，以标准结核分枝杆菌H38Rv为对照，检测临床分离的35株结核分枝杆菌rpoB基因突变情况并以药敏试验结果做对照分析。结果：以药敏试验结果为对照，35株临床分离株中有9株RFP敏感株的SSCP带与结核分枝杆菌标准株（H37Rv)相同，26株RFP耐药株中有24检测到突变图谱，与药敏试验结果对照阳性率为92．3％，特异性为100％，结论：RpoB基因是一种高度保守序列，结核分枝杆菌耐RFP是由于rpoB基因突变所致。本研究针对其高突变区域设计一对引物，运用PCR－SSCP法具有简便，快速、准确的特点，可以对临床标本中结构分枝杆菌进行检测，以满足临床早期诊治的需要。     

聚合酶链反应-单链构象多态性技术快速筛选结核杆菌的利福平耐药性

目的：探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）药物敏感性的可行性。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）技术分别检测了40株RFP药物敏感及耐药的结核分枝杆菌临床分离株。先用PCR扩增rpoB基因，随后用SSCP方法鉴定其扩增产物有无突变，并与药敏试验结果作对照分析。结果：所有临床分离株均观察到rpoB基因PCR扩增产物。40株RFP敏感的临床分离株SSCP带谱与结核分枝杆菌H37RV标准株相同，40株RFP耐药株中37株检测到突变图谱。与Bactec结果对照，用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性的敏感性为93％，特异性为100％。结论：结核分枝杆菌耐RFP是其rpoB基因突变所致。PCR-SSCP技术可用于结核分枝杆菌RFP药物敏感性的直接快速检测。     

利福平耐药性结核杆菌的直接、自动检测

结核杆菌多耐药性菌株的出现已经对公共健康构成威胁。利福平是结核病治疗体系中的一个重要组分，且多耐药结核菌株中出现最多的是利福平耐药，故利福平耐药的直接检测将成为确认多重耐药性结核病的一个有效工具。关于利福平耐药结核杆菌检测的一种快速筛选方法最近已经确立，利福平耐药的基因（rpoB）位点已被确认，这个检查方法包括利福平耐药区域的PCR（多聚酶链反应）扩增及对扩增产物进行SSCP（DNA单性多态构象分析）确认突变。     

耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因序列研究

目的 研究杭州地区结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）对利福平（RFP）的耐受与rpoB基因突变的关系。方法 随机挑选了90例结核杆菌感染的病例。选择了利福平作为主要的药物进行药敏实验，PCR扩增39株耐RFP结核分支杆菌的rpoB基因片段（580bp）；测定扩增片段的序列。并与美国国立生物信息中心（www．ncbi．nlm．nih．gov／nucleotide）检索获得结核杆菌野生株（利福平敏感株）序列（登陆号：AJ749948）作对比分析。结果 结果显示PCR结核测序方法得到了39例结核杆菌耐药株。51例敏感株，与药敏实验的方法检测的结果完全一致。测定的11株临床分离的耐药株中，526位或531位有突变，其中526位有突变的有7株，占耐药测定株63．6%，531位突变的有4株。占耐药测定株36．4％。未见两位点同时突变。检测的11株敏感株，未见526位或531位有突变。结论 杭州地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的526位或531位突变密切相关，与国外的报告基本相似。但526位突变占耐药测定株高达63．6％。如此高比例目前国内外未见相似报道。PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法。     

实时荧光PCR分子信标检测耐利福平结核分枝杆菌印rpoB基因

目的 应用实时荧光PCR分子信标技术,建立快速检测临床标本中结核分枝杆菌利福平rpoB相关耐药突变点方法,探讨其缩短耐药实验报告时间的临床应用价值.方法 以分枝杆菌药物敏感性实验绝对浓度法为标准,12株非结核分枝杆菌、4株非分枝杆菌作对照,对174例结核患者临床分离株应用实时荧光PCR分子信标方法,检测利福平rpoB核心区域的耐药突变点并将结果与直接测序进行比较.结果 (1)实时荧光PCR分子信标方法:82例结核分枝杆菌利福平敏感菌株中,3例发生rpoB基因突变,特异度为96.3%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,82例检出耐药突变,敏感度为89.1%;准确性为92.5%.(2)DNA直接测序分析:82例结核分枝杆菌利福平敏感株中,1例发生rpoB基因突变,特异度为98.8%;92例结核分枝杆菌利福平耐药菌株中,83例发生:rpoB基因突变,敏感度为90.2%;准确性为94.2%.检测174株结核分枝杆菌临床分离菌株,与实时荧光PCR分子信标方法检测一致性为98.3%(171/174).结论 实时荧光PCR分子信标方法检测耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变点可作为结核患者快速耐药检测的初筛方法之一.     

用PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的突变

目的了解本地区结核分枝杆菌对利福平(RFP)耐药基因的突变情况,探讨利用分子生物学方法直接快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的试验方法.方法针对rpoB基因设计一对引物(扩增产物为189bp),采用聚合链酶反应-单链构象多态性银染(PCR-SSCP)方法,以标准结核分枝杆菌H38Rv为对照,检测临床分离的35株结核分枝杆菌rpoB基因突变情况并以药敏试验结果做对照分析.结果以药敏试验结果为对照,35株临床分离株中有9株RFP敏感株的SSCP带与结核分枝杆菌标准株(H37Rv)相同,26株RFP耐药株中有24检测到突变图谱,与药敏试验结果对照阳性率为92.3%,特异性为100%.结论 RpoB基因是一种高度保守序列,结核分枝杆菌耐RFP是由于rpoB基因突变所致.本研究针对其高突变区域设计一对引物,运用PCR-SSCP法具有简便、快速、准确的特点,可以对临床标本中结核分枝杆菌进行检测,以满足临床早期诊治的需要.     

耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因序列研究

目的研究杭州地区结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)对利福平(RFP)的耐受与rpoB基因突变的关系.方法随机挑选了90例结核杆菌感染的病例,选择了利福平作为主要的药物进行药敏实验,PCR扩增39株耐RFP结核分支杆菌的rpoB基因片段(580bp);测定扩增片段的序列,并与美国国立生物信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide)检索获得结核杆菌野生株(利福平敏感株)序列(登陆号:AJ749948)作对比分析.结果结果显示PCR结核测序方法得到了39例结核杆菌耐药株,51例敏感株,与药敏实验的方法检测的结果完全一致.测定的11株临床分离的耐药株中,526位或531位有突变,其中526位有突变的有7株,占耐药测定株63.6%,531位突变的有4株,占耐药测定株36.4%,未见两位点同时突变.检测的11株敏感株,未见526位或531位有突变.结论杭州地区结核分支杆菌耐利福平的发生与rpoB基因的526位或531位突变密切相关,与国外的报告基本相似.但526位突变占耐药测定株高达63.6%,如此高比例目前国内外未见相似报道.PCR扩增和产物测序将是临床检测结核分支杆菌耐利福平和耐多药的一种迅速、准确的方法.     

PCR-DS利福平耐药结核分枝杆菌发现rpoB545点突变分析

利福平（rifampin，RFP）的长期与广泛使用，已造成结核分枝杆菌利福平耐药性菌株的广泛存在，对结核病的治疗产生了重要的影响。现已证实结核分枝杆菌的利福平耐药性，同药物作用的靶分子RNA聚合酶β亚基的编码基因rpoB突变有关。本文采用套式PCR技术，对获自女性盆腔结核患者及肺结核患者的结核菌株进行PCR扩增及其产物的序列分析，发现rpoB基因545位点突变，现将结果报告如下。     

PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

PCR—SSCP快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的研究

目的探讨PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因作为新的分子药敏试验方法的价值。方法应用PCR—SSCP技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因核心区的突变，同时对片段长度为215bp的PCR扩增产物进行测序分析。受试菌为23株利福平敏感结核分枝杆菌以72．35株利福平抗性结核分枝杆菌。结果23株利福平敏感结核分枝杆菌分别用PCR—SSCP和PCR扩增片段测序均没有检测到巾0B碱基突变。而在35株利福平抗性菌株中，PCR—SSCP检测到31株与H37Rv标准株不同的带谱，PCR—SSCP检测基因突变的敏感度和特异度分别为88．6％（31／35）和100％（23／23）。对35株利福平抗性菌株PCR扩增产物进行测序分析，在其中32株中检出了基因突变。测序分析检测基因突变的敏感度和特异度分别为91．4％（32／35）和100％（23／23）。卡方检验，PCR—SSCP和PCR扩增片段测序两种方法的敏感度之间没有显著性差异（P〉0．05）。若以DNA测序为标准，则PCR—SSCP检测基因突变的准确度、敏感度和特异度分别为93．1％（54／58），96．9％（31／32）和100％（23／23）。结论PCR—SSCP检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变可用于利福平药物敏感度的快速测定。     

检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的研究

目的：建立聚合酶链反应－单链构象多态性（PCR－SSCP）检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，并评价共临床应用的价值。方法：依据结核分枝杆菌rpoB基因的耐利福平决定区设计引物，用PCR从临床分离株和直接从痰标本中扩增rpoB基因片段；对扩得的rpoB基因片段做DNA SSCP分析，并随机测定rpoB片段的序列。结果：PCR从所有212株结核分枝杆菌中均扩得230bp片段135份抗酸染色阳性的痰标本中，有113份扩得阳性片段（83．7％），在SSCP分析中，140份经L－J药敏试验检测为利福平耐受的结核分枝杆菌，有130份有rpoB基因突变（符合率为92．9％），72份经L－J药敏试验检测为利福平敏感的菌，有67份的rpoB基因无突变（符合率为93．1％），测序分析发现57份经SSCP检测为突变的rpoB片段均有序列改变，10份经SSCP分析为无突变的有8份无序列改变，SSCP与测序结果的符合率为94．0％，在本研究的菌株中，耐多药结核病（MDR－TB）占76．4％（107／140），有92．5％（99／107）耐多药菌株经SSCP检测有rpoB突变。结论：建立的PCR－SSCP分析方法，是一种较准确和稳定的检测结核分枝杆菌rpoB基因突变的方法，可用于临床快速分析患者结核分枝杆菌对利福平的耐药性，并可作为MDR－TB判断的一个重要指标。     

突变受阻性扩增系统快速检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的初步研究

利福平 (RFP)是结核化疗方案中的一个关键药物 ,它的应用可明显缩短结核病的疗程。因此 ,创建快速、简便的检测方法一直是基础研究中的一个重要课题。突变受阻性扩增系统 (amplificationrefractorymutationsystem ,ARMS) [1] 是一种可以检测任何已知点突变或小基因片段缺失的扩增技术 ,简便、可靠、无放射性核污染。我们选择与结核分枝杆菌 (结核菌 )RFP耐药相关的rpoB基因中突变频率最高的 3种突变形式 :5 31TCG→TTG ,5 2 6CAC→TAC ,5 16GAC→GTC来设计ARMS特异性突变引物 ,ARMS 聚合酶链反应 (PCR)扩增后结合微孔板探针…     

结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药的分子机制及其快速鉴定

目的：了解结核分枝杆菌乙胺丁醇(EMB)耐药的临床分离株embB基因突变的情况，并探索快速检测结核分枝杆菌EMB耐药性的实验方法。方法：应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术和PCR扩增产物测序方法。分析结核分枝杆菌EMB耐药和敏感各30株的embB基因。结果：以结核分枝杆菌H37RV标准株为对照。发现30株EMB耐药株中有11株(36．7％)embB基因扩增产物SSCP泳动异常，部分耐药菌株测序分析证实为306位密码子突变；而30株敏感株的embB基因扩增产物SSCP泳动均无异常。结论：embB基因突变是结核分枝杆菌EMB耐药的重要机制之一；PCR-SSCP技术可能成为一种检测结核分枝杆菌EMB耐药性的准确和快速的实验方法。     

耐药结核分枝杆菌链霉素耐药基因的分子流行病学研究及其快速检测

目的探讨结核分枝杆菌对链霉素的耐药分子机制，建立基于焦磷酸测序（pyrosequencing）技术的快速检测结核分枝杆菌链霉素耐药性的方法。方法用扩增后直接测序的方法检测了150株结核分枝杆菌链霉素耐药株的rpsL基因，并用pyrosequencing技术对其中20株的rpsL基因43位密码子进行了检测。结果150株链霉素耐药株中2株rpsL基因缺失，115株rpsL基因存在突变，突变率为77．7％，最主要的突变形式是43位密码子突变，pyrosequencing的检测结果与测序结果相符。结论rpsL基因突变是产生链霉素耐药的重要分子机制，pyrosequencing技术具有快速、准确等特点，适用于对耐链霉素结核分枝杆菌进行快速高通量的检测。     

结核分支杆菌利福平和异烟肼耐药基因的快速检测

近年来，全球结核病呈现死灰复燃的趋势，其主要原因是耐药（DR-TB）和耐多药（MDR-TB）结核病的广泛分布和迅速传播。作为一线抗结核药物，INH和RFP结核病的预防、治疗方面起着重要作用。但由于单药化疗和不规则化疗，其耐药情况越来越严重。有研究表明结核分杆菌耐异烟肼的产生与过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因KatG基因的缺失和突变有关；而利福平耐药则与RNA聚合酶的p亚基的编码基因rpoB突变有关。我们在用PCR-SSCP方法单独检测KatG和rpoB基因突变时，发现在非变性聚丙烯酰胺凝胶中，这两种基因的迁移率不同，且差异很大。因此，我们在一个反应中同时扩增KatG和rpoB基因。再根据其SSCP图谱进行分析，这样就可以同时检测异烟肼和利福平耐药性。我们采用PCR-SSCP银染法直接检测临床分离株和临床痰标本中结核分支杆菌rpoB基因和KatG基因突变，现将结果报告如下：     

病原生物学检验与临床

下呼吸道感染患者临床分离病原菌的分析；539例尿路感染的实验室检查分析；耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌mecA基因检测分析；结核分枝杆菌ropB基因突变特征的初步探讨；实时荧光定量PCR检测血浆结核分枝杆菌DNA的初步临床应用；rpoB基因点突变与结核分枝杆菌对利福平耐药相关性的研究；PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分枝杆菌耐药基因的检测；     

肺结核与结核性脑膜炎病例中结核分枝杆菌耐利福平相关基因突变分布分析

目的分析结核性脑膜炎与肺结核病例中,导致结核分枝杆菌利福平耐药的rpoB基因突变分布规律及差异。方法对包含利福平耐药决定区81bp的102株结核分枝杆菌临床分离株的PCR产物进行测序分析。结果 102株利福平耐药的结核分枝杆菌的rpoB基因测序发现,63株导致肺结核的结核分枝杆菌的rpoB基因突变常见位点为:531(53.97%),526(20.63%),516(6.45%)。39株导致结核性脑脑膜炎的rpoB基因突变最常见位点为:531(61.54%),526(20.51%),533(7.69%)。结论导致结核性脑膜炎与导致肺结核的结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因的最常见两个突变位点(531和526)无显著差异。其中531位密码子的Ser-Leu突变率占明显优势。     

耐药结核分枝杆菌基因突变分析

目的 探讨结核分枝杆菌耐药表型与基因突变位点之间的相互关系.方法 采用序列特异性引物分别扩增92株结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB,异烟肼耐药基因katG、inhA、ahpC,链霉素耐药基因rrs、rpsL,乙胺丁醇耐药基因embB及喹诺酮耐药基因gyrA,SSCP筛选出突变序列,DNA测序分析突变性质.结果 59株利福平耐药株rpoB基因突变检出率94.9%(56/59),以Ser450Trp突变最多;90株异烟肼耐药株中,katG基因突变检出率38.9%(35/90),以Ser315Thr最多,3株检出inhA基因突变,ahpC基因无突变检出;34株喹诺酮耐药株中gyrA基因突变检出率82.4%(28/34),主要为Asp94Gly,其次为Ala90Val;31株链霉素耐药株中,15株检出rrs突变,最常见为A514C和A1041G,10株发生rpsL Lys88Arg突变,总的链霉素基因突变检出率为77.4%(24/31);31株乙胺丁醇耐药株中embB 基因突变检出率19.4%(6/31),主要为Met306Val.结论 耐药结核分枝杆菌耐药情况较为严重,以DNA测序为基础的基因突变分析能快速有效地检测结核分枝杆菌的rpoB、katG、gyrA、rrs、rpsL、embB 等耐药分子标识,显示了西安地区耐药性结核分枝杆菌的突变特点,为结核病的临床诊断和合理用药提供了实验依据.     

DNA芯片快速检测结核分枝杆菌利福平耐药rpoB基因突变

目的建立快速检测结核分枝杆菌利福平（RFP）耐药rpoB基因突变的DNA芯片。方法从34株临床痰样本中提取结核分枝杆菌的基因组DNA，采用聚合酶链反应（PCR）扩增含有rpoB基因突变位点的特异DNA片段，荧光标记后与芯片上含有特异突变位点的寡核苷酸探针进行杂交，同时与DNA测序法比较。结果用DNA芯片检测出19株耐药株和15株敏感株，且结果与DNA测序相同，准确率可达88．2％，敏感性为78．9％，特异性为100．0％。结论DNA芯片快速检测结核分枝杆菌对RFP的耐药rpoB基因突变是一种操作简便、准确性、敏感性和特异性较高，且易于开展的方法。