4型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因的 …

目的 构建缺失Ｅ３区７８．９－８６ｍｕ的４型腺病毒疫苗株载体。方法 从４型腺病毒疫苗株感染的人胚肺二倍体细胞２ＢＳ中提取病毒ＤＮＡ,经过多卡亚克隆构建成功缺失７８．９￣８６ｍｕ的载体。将含有ＣＭＶ早期启动子的β－半乳糖苷酶基因插入缺失部位,将这一重组质粒与Ａｄ４Ｂｃｌ１大片段共转染２９３细胞,铺含有Ｘ－Ｇａｌ的营养琼脂,经蓝色斑斑纯化三代,ＯＮＰＧ法测定β－半乳糖苷酶基因的表达量。结果 所构建的载     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β—半乳糖苷酶基因 …

目的 构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β－半乳糖苷酶基因。方法 从人二倍体细胞的Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８．８－８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β－半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲＩ酶切Ａｄ     

7型腺病毒疫苗株载体的构建及β-半乳糖苷酶基因的表达

目的构建Ｅ３区缺失的７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）载体并表达β半乳糖苷酶基因。方法从人二倍体细胞Ｗ１３８培养的Ａｄ７ｖ中分离病毒ＤＮＡ，利用Ａｄ７ｖＤＮＡ天然的酶切位点，经过多步亚克隆，克隆的同时将Ｅ３区７８８８７ｍｕ片段缺失，并将多克隆酶切位点带入Ａｄ７ｖ载体。为了验证载体的功能，将带有巨细胞病毒（ＣＭＶ）早期启动子β半乳糖苷酶基因插入缺失的Ｅ３区。将这一重组质粒和ＥｃｏＲⅠ酶切Ａｄ７ｖＤＮＡ共转染２９３细胞，获得表达β半乳糖苷酶重组病毒。结果构建了缺失部分Ｅ３区Ａｄ７ｖ载体，在ＣＭＶ启动子的作用下该载体能有效地表达外源基因。结论Ａｄ７ｖ载体的构建并成功表达外源基因为开发和应用这一载体打下了重要的基础     

7型腺病毒疫苗株基因克隆及其右侧末端Sma ⅠH片段的核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒（Ａｄ７）载体构建的基本元件，为构建Ａｄ７载体及阐明其基因组一级结构打下基础。方法用改良Ｈｉｒｔｓ法提取Ａｄ７ＤＮＡ，酶切后克隆于质粒载体，克隆了ＸｈｏⅠＡ＋Ｄ片段（１７０－７６５ｍｕ）、Ｄ片段（１７０－２２９ｍｕ）、Ｅ片段（１０８－１４１ｍｕ）、Ｆ＋Ｇ片段（１４１－１７０ｍｕ）、Ｇ片段（１５８－１７０），用ＥｃｏＲⅠ＋ＸｈｏⅠ双酶切，克隆了７６５－８７ｍｕ，用ＳａｍⅠ＋ＥｃｏＲⅠ双酶切，克隆了８７０－９７４ｍｕ。用腺病毒ＤＮＡ做为模板测定了Ａｄ７疫苗株右侧末端ＳｍａⅠＨ片段（９７４－１００ｍｕ）核酸苷序列，根据所测序列设计引物，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）获得右侧末端，并对其再次测序证实。结果建立了Ａｄ７疫苗株部分基因文库（１０８－１００ｍｕ），完成Ａｄ７疫苗株ＳｍａⅠＨ片段核苷酸序列。结论这一结果为阐明Ａｄ７基因组一级结构及构建Ａｄ７载体奠定了基础。     

4型腺病毒载体的构建和β－半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段（７０．５－８３．０基因图谱单位）克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４（７０．５－８３）质粒，质粒ｐＡｄ４（７０．５－８３）和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂＰ腺病毒晚期表达盒，在所构建的腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ３区编码分子量为１９３００糖蛋白基因的３种Ａｄ４载体。将ｌａｃＺ基因插入载体表达区，与Ｂｅｌｌ消化的Ａｄ４ＤＮＡＡ片段共转染Ａ５４９细胞，ＯＮＰＧ法检测证实所构建的载体和表达盒功能良好。本项工作对于在国内研究口服活疫苗及开展基因治疗均具有重要意义。     

7型腺病毒疫苗株87mu-97.4mu片段核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒（Ａｄ７）疫苗株８７ｍｕ－９７．４ｍｕ核苷酸序列，分析该区段的基因结构和功能。方法应用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法进行核苷酸序列分析。结果Ａｄ７疫苗株８７ｍｕ－９７．４ｍｕ全长３６９８个核苷酸，推测编码纤维蛋白（３２５个氨基酸）和Ｅ３区１５．４ｋＤ蛋白，Ｅ４区５个蛋白（ＯＲＦ１４．２，ＯＲＦ１５．７，ＯＲＦ８．１，ＯＲＦ４２．８和ＯＲＦ１０．３）。结论这一结果为阐明Ａｄ７的基因结构与功能及利用该病毒做为基因工程疫苗载体打下一定的基础     

4型腺病毒载体的构建和β—半乳糖苷酶基因的表达

以４型腺病毒疫苗株感染Ａ５４９细胞，提取病毒ＤＮＡ，将ＥｃｏＲＩ消化的Ｄ片段克隆入ｐＵＣ１８质粒，得ｐＡｄ４质粒，质粒ｐＡｄ４和ｐＡｄ４Ｃ１－２５经酶切、系列亚克隆、加接头等方法得到大部分和部分缺失Ｅ３区的重组质粒。聚合酶链反应（ＰＣＲ）法获得ｐｏｌｙ（Ａ），构建约８００ｂｐ腺病毒晚期表达盒，在所构宾腺病毒重组质粒Ｅ３缺失区或Ｅ４与ＩＴＲ间插入表达盒，得到可同时表达２个或２个以上外源基因和保留了Ｅ     

7型腺病毒疫苗株基因克隆及其右侧末端Sma I H片段 …

目的 获得７型腺病毒（Ａｄ７）载体构建的基本元件，为构建Ａｄ７载体及阐明其基因组一级结构打下基础。方法 用改良Ｈｉｒｔｓ法提取Ａｄ７ＤＮＡ，酶切后克隆于质粒载体，克隆了Ｘｈｏ Ｉ Ａ＋Ｄ片段（１７．０￣７６．５ｍｕ）、Ｄ片段（１７．０－２２．９ｍｕ）、Ｅ片段（１０．８－１４．１ｍｕ）、Ｆ＋Ｇ片段（１４．１￣１７．０ｍｕ）、Ｇ片段（１５．８￣１７．０），用ＥｃｏＲ Ｉ＋Ｘｈｏ Ｉ双酶切，克隆了７６．     

《细胞与分子免疫学杂志》（季刊）1996年第12卷目录索引

《细胞与分子免疫学杂志》（季刊）１９９６年第１２卷目录索引β－半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）载体的构建及其在哺乳类细胞中的表达（正文见第１１页）图１重组ＡＡＶ表达载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－）的构...     

人免疫缺陷病毒1(HIV-1)膜蛋白基因片段在酵母中的克隆表达

目的为获得足够量的膜糖蛋白,以便于对不同ＨＩＶ分离株膜糖蛋白的结构与功能进行进一步的研究。方法从人免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ－１）ＨＸＢ２分离株原病毒基因组的重组质粒ｐＨＸＢ２中克隆了两段膜糖蛋白基因（ＥＮＶ）片段。以酵母穿梭诱导表达质粒ｐＹＥＳ２为载体,构建了两个相应的重组表达质粒ｐＹＥＮＶ１和ｐＹＥＮＶ２;进一步利用大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因（β－ｌａｃＺ）构建了ＨＩＶ－１膜外糖蛋白ＤＮＡ片段与β－ｌａｃＺ基因的融合表达质粒。将此３种质粒分别转化单细胞真核生物酿酒酵母ＢＪ１９９１,得到的转化子经半乳糖诱导表达后进行菌体全蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。结果克隆的基因片段在酿酒酵母中产生了分子质量为５０×１０３的特异性诱导蛋白;对含此融合表达质粒的酵母转化子半乳糖诱导后表达产物的免疫检测表明,与对照菌株相比,融合表达产物具有和ＨＩＶ－１阳性血清抗体反应的抗原性。结论可通过β－半乳糖苷酶活性的测定直接指示抗原片段的表达;为表达的膜糖蛋白片段的进一步分离纯化打下了一定基础     

7型腺病毒疫苗株DNA左侧17.5mu片段克隆及4.8mu片？…

目的 获得７型腺病毒疫苗株ＤＮＡ左侧０－１７．５ｍｕ片段克隆,分析０－４．８ｍｕ片段（末端倒置重复序列,包装信号位点和Ｅｌａ区）核苷酸序列,。方法从Ａｄ７疫苗株感染的Ａ５４９细胞提取Ａｄ７ ＤＮＡ,将其０．３－１７．５ｍｕ片段克隆到质粒ｐＡｄ７Ｔ,并用自动和银染方法测序。结果 获得了Ａｄ７疫苗株左侧１７．５ｍｕ片段克隆,测定了左侧１７３７ｂｐ核苷酸序列,其中Ｅｌａ区所编码的６３００,２４０００,２     

7型腺病毒疫苗株DNA左侧17.5 mu片段克隆及4.8 mu片段核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒疫苗株ＤＮＡ左侧０～１７５ｍｕ片段克隆,分析０～４８ｍｕ片段（末端倒置重复序列、包装信号位点和Ｅｌａ区）核苷酸序列。方法从Ａｄ７疫苗株感染的Ａ５４９细胞提取Ａｄ７ＤＮＡ,将其０３～１７５ｍｕ片段克隆到质粒ｐＡｄ７Ｔ,并用自动和银染方法测序。结果获得了Ａｄ７疫苗株左侧１７５ｍｕ片段克隆,测定了左侧１７３７ｂｐ核苷酸序列,其中Ｅｌａ区所编码的６３００、２４０００、２８０００等３个蛋白的ＤＮＡ序列,与Ｇｏｍｅｎ株的同源性分别为９８９％、９７３％和９７５％,推导编码氨基酸的同源性分别为９６６％、９６５％和９６９％。这３个蛋白与Ｇｒｉｄｅｒ株的同源性分别为１００％、９９７％、和９９７％;推导编码氨基酸的同源性分别为１００％、９９１％和９９２％。结论Ａｄ７疫苗株左侧１７３８ｂｐ核苷酸与Ａｄ７Ｇｏｍｅｎ株和Ｇｒｉｄｅｒ株相应片段,具有高度的同源性。     

7型腺病毒疫苗株76.5～87mu核苷酸序列分析

目的获得７型腺病毒疫苗株（Ａｄ７ｖ）７６５－８７ｍｕ核苷酸序列，分析该区段的基因结构和功能。方法从Ａｄ７疫苗株克隆出６８－８７ｍｕ核苷酸片段，应用Ｓａｎｇｅｒ双脱氧法进行核苷酸序列分析。结果Ａｄ７ｖ７６５～８７ｍｕ核苷酸序列长度为３５５７ｂｐ，推测此片段编码Ｅ３区１２１ｋＤ、１９２ｋＤ、２０１ｋＤ、２０５ｋＤ、１０３ｋＤ和１５２ｋＤ蛋白的一部分。所编码的６个蛋白与Ａｄ７原型株（Ａｄ７ｐ）和Ａｄ７ｈ（１９８６年以来南美流行的毒株）核苷酸高度同源（大于９７２％）。１６１ｋＤ蛋白由于缺失一个核苷酸，造成移码突变，编码提前终止。编码７７ｋＤ蛋白的ＯＲＦ由于缺失一段核苷酸而提前终止编码。结论这一结果为阐明Ａｄ７的基因结构与功能并为构建Ａｄ７载体时对Ｅ３区缺失提供依据     

汉坦病毒A9株M基因片段全长cDNA克隆及其在痘苗病…

采取反转录－聚合酶链反应，分３个片段扩增Ⅰ型汉坦病毒（野鼠型）中国毒株Ａ９株Ｍ基因片段，分别克隆入ＰＧＥＭ－Ｔ载体中。选择个正向插入的ＴＡ９ＩＢ、ＴＡ９ＣＤ、ＴＡ９ＥＡ克隆，选用Ｃｌａ Ⅰ、ＥｃｏＲ Ｖ进行酶切、连接，获得了１个在ＰＧＥＭ－Ｔ载体中插入３．６ｋｂ的Ａ９株Ｍ基因片段ｃＤＮＡ克隆，酶切图谱分析证实插入片段正确。将Ａ９Ｍ片段在痘苗病毒／Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶瞬时表达系统中进行表达，用抗汉     

β—半乳糖苷酶基因的腺伴随病毒（AAV—2）载体的构建及其在…

以野生型２型人类腺伴随病毒（ＡＡＶ－２）全基因组载体（ｐＳＳＶ９和ｐＳＳＶ９－ｉｎｔ＾－）为基础，构建了重组ＡＡＶ载体ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋）和ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（－），制备ＡＡＶ重组病毒，感染宿主细胞后表达了β－半乳糖苷酶基因。此外，用脂质体转染法将载体导入２９３细胞和Ａ５４９细胞，进行了ＬａｃＺ基因瞬时表达研究。结果显示，重组ＡＡＶ载体（ｐＳＳＶ９／Ｐ４０－ＬａｃＺ（＋））     

β—半乳糖苷酶核酸免疫初探

将带有编码β－半乳糖苷酶基因片段的质粒ｐＳＶ－β－Ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ通过股四头肌接种小鼠，利用ＥＬＩＳＡ方法检测鼠体内β－半乳糖苷酶获得得表达后刺激机体产生抗β－半乳糖苷酶抗体的情况。     

复制缺陷型鼠IL-3重组腺病毒的构建和鉴定

构建以ＣＭＶ启动子控制鼠ＩＬ－３基因表达的复制缺陷型腺病毒（ＡｄＣＭＶＩＬ－３）。将含全部编码序列的鼠ＩＬ－３ｃＤＮＡ克隆于腺病毒穿梭质粒ｐＭＨ４的ＣＭＶ启动子下游,再与含腺病毒基因组的质粒ｐＢＨＧ１０共转染２９３细胞,经细胞内同源重组后产生７个病毒空斑,取其中４个空斑扩增后经双引物ＰＣＲ检测,结果均含有ＩＬ－３及腺病毒特有片段,表明成功地构建了携带鼠ＩＬ－３基因的复制缺陷型重组腺病毒。     

构建以痘苗病毒为载体的人用狂犬病基因工程疫苗株的研究

构建了一个可以适于人用的表达狂犬病病毒糖蛋白的重组痘菌病毒疫苗株。构建的方法是：先构建一个表达β－半乳糖苷酶基因（简称ｌａｃ基因）的不经传代细胞的重组痘苗病毒，以此为亲本株，再与载体ＰＴｋ１１ｋＲＧ（狂犬病病毒糖蛋白基因插在胸苷激酶Ｔｋ区，并置于痘苗病毒１１ｋ启动子下游，Ｔｋ侧冀序列和启动子均来自痘苗病毒天坛株），在鸡胚细胞中同源重组，以蓝色空斑中挑白斑的方法筛选阳性重组病毒，用免疫荧光方法和ＡＰＡＡＰ免疫酶法证明，该病毒能较好地表达狂犬病病毒糖蛋白。动物实验表明，该病毒能较好地诱导小鼠和狗的抗狂犬病毒的中和抗体，并对狂犬病病毒ＣＶＳ株和ＳＲＶ（街毒）的攻击有保护作用。     

人免疫缺陷病毒1（HIV—1）膜蛋白基因片段在酵母中的克 …

目的 为获得足够量的膜糖蛋白，以便于对不同ＨＩＶ分离株膜糖蛋白的结构与功能进一步的研究。方法 从人免疫缺陷病毒１（ＨＩＶ－１）ＨＸＢ２分离株原病毒基因组的重组质粒ｐＨＸＢ２中克隆了两段膜糖蛋白基因（ＥＮＶ）片段。以酵母穿梭诱导表达质粒ｐＹＥＳ２为载体。构建了两个相应的重组表达质粒ｐＹＥＮＶ１和ｐＹＥＮＶ２；进一步利用大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因（β－ｌａｃＺ）构建了ＨＩＶ－１膜外糖蛋白ＤＮＡ片段与β     

大鼠颈动脉气囊损伤后腺病毒载体介导的在体基因转录

０６３大鼠颈动脉气囊损伤后腺病毒载体介导的在体基因转录［英］／ＬｅｅＳＷ…／／ＣｉｒＲｅｓ，一Ｒｅｓ。一１９９３，７３（５）．一７９７～８０７首先构建一个表达以细胞核为靶位的β－半乳糖苷酶的重组腺病毒载体（ＡＶ１ＬａｃＺ４），然后将其注入到大鼠气囊损...