细胞因子体外诱导慢性髓细胞性白血病树突状细胞分化的研究

本研究探讨干扰素（IFN）治疗慢性粒细胞性白血病（CML）的可能新机制，为临床治疗CML提供新的思路。用Ficoll密度离心法分离骨髓单个核细胞（BMMNC），用不同细胞因子组合体外诱导培养树突状细胞（DC），在倒置显微镜及光镜下观察DC形态，应用流式细胞术检测其表面标志（CD1a，CD83，CD86，HIA-ABC，HIA-DR，CD54）。MTT法检测其混合淋巴细胞反应（MLR）能力。结果表明：经不同细胞因子组合所诱导出的DC，其特征性表面分子表达率均高于培养前的DC（P〈0．01）；IFN-α＋GM-CSF组DC表达HLA—ABC、HLA-DR明显高于IL-4＋GM-CSF培养组（P〈0．05）；而IFN-α＋GM-CSF4-IL-4组DC的CD86表达率及MLR水平均高于其它细胞因子组合组（P〈0．05）。干扰素耐药组DC表面分子表达率及MLR水平较新诊断组和干扰素治疗有效组均明显减低（P〈0．05），但A、B、C各组的CD86表达率及MLR水平在IFN-α＋GM-CSF4-IL-4因子组合条件下无明显差异。结论：CML骨髓单个核细胞在含有IFN-α的细胞因子组合条件下可分化为具有形态和免疫表型特征的DC，且表达较高的Ⅰ类和Ⅱ类分子、共刺激分子、黏附分子及MLR，表明干扰素治疗CML的机理可能与DC有关，这一结果提示通过增强内源性DC功能可能提高CML临床疗效。     

慢性髓系白血病细胞来源的树突状细胞

慢性髓系白血病（ＣＭＬ）细胞起源于ＣＭＬ多能造血干细胞,树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ,ＤＣ）是功能强大的抗原提呈细胞。ＣＭＬ细胞在ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－４、ＴＮＦ－α等细胞因子的共同作用下,在体外可以诱导生成ＣＭＬ－ＤＣ,在自体或异体条件下均能刺激Ｔ细胞的显增殖,发挥特异性的抗ＣＭＬ细胞毒效应。     

慢性髓系白血病细胞来源的树突状细胞

慢性髓系白血病(CML)细胞起源于CML多能造血干细胞,树突状细胞(dendritic cell,DC)是功能强大的抗原提呈细胞。CML细胞在GM-CSF、IL-4、TNF-α等细胞因子的共同作用下,在体外可以诱导生成CML-DC,在自体或异体条件下均能刺激T细胞的显著增殖,发挥特异性的抗CML细胞毒效应。     

树突状细胞与慢性髓系白血病的免疫治疗

树突状细胞(DC)的生物学特性及其在免疫应答中的重要作用,使之成为当前肿瘤免疫治疗研究的热点。它是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞,可在体内外活化CD4+、CD8+T细胞,从而激发一系列的特异性免疫应答。本文就其特性及其在抗肿瘤免疫特别是抗慢性髓系白血病免疫治疗中的作用作一综述。     

细胞因子体外诱导急性髓系白血病细胞分化为树突状细胞

目的　研究细胞因子组合体外诱导急性髓系白血病 (AML)细胞分化为树突状细胞 (DC)的可行性及AML细胞衍生DC(AML DC)的生物学特性。方法　AML细胞分别在GM CSF +IL 4、GM CSF +TNF α或GM CSF +IL 4 +TNF α 3种细胞因子组合以及不含细胞因子的培养液中培养。通过细胞形态动态观察、细胞化学染色和细胞免疫表型鉴定DC。用混合淋巴细胞培养 (MLC)、FITC标记的葡聚糖摄入实验和LDH释放实验检测DC功能。RT PCR和FISH检测AML DC的特异融合基因。结果　15例AML细胞在 3种细胞因子作用下发生典型的DC形态变化。AML DC的DC相关表面分子CD1a、CD80 、CD86 、CD1 0 6 、CD83和HLA DR等较未培养或不加细胞因子培养的AML细胞表达明显上调 (P <0 0 5 )。AML DC的异基因刺激能力明显高于未培养或不加细胞因子培养的AML细胞 (P <0 .0 5 )。只有用GM CSF +IL 4培养的AML DC有吞噬能力。AML DC与未培养AML细胞致敏的疾病初发时分离的T细胞比较 ,对自体AML细胞无明显的杀伤活性。AML DC仍具有未培养AML细胞的特异融合基因。结论　体外细胞因子可诱导各型AML细胞分化为DC ,细胞因子组合不同 ,AML DC的成熟状态可有一定的差异。AML DC不但起源于AML细胞 ,而且具有正常DC的典型形态、表型和功能。AML细胞可导致自体T细胞失能     

PD-L1阻断对慢性髓系白血病源性树突状细胞的功能影响

程序性死亡-1配体-1(PD-L1)作为近年来发现的B7家族新的成员,已被证实有免疫负调节作用,白血病源性树突状细胞(DC)高表达PD-L1可能是影响其功能的原因之一,本研究试图阻断PD-L1在DC上的表达以增强白血病源性DC的免疫刺激功能。应用人rhGM-CSF、rhIL-4及TNF-α细胞因子组合诱导慢性髓系白血病细胞(CML)分化DC,观察给予加或不加PD-L1单克隆抗体对DC的影响。应用流式细胞术检测DC免疫表型及PD-L1,MTT法检测DC刺激自体T淋巴细胞的增殖能力,ELISA法测定上清液中IFN-γ、IL-2和IL-10的水平。结果显示,负性调节分子PD-L1随着慢性髓系白血病源性树突状细胞(CML-DC)成熟表达不断升高,阻断PD-L1能增强CML-DC刺激自体T淋巴细胞增殖的能力,促进T细胞分泌IFN-γ和IL-2并抑制IL-10的产生(p<0.05)。结论:阻断PD-L1可增强白血病源性DC的功能,为白血病DC瘤苗治疗技术提供了新的方法。     

急性髓系白血病患者树突状细胞诱导抗自身白血病T细胞免疫的实验研究

目的　探讨自体白血病细胞裂解物 (ACL)冲击的完全缓解期的急性髓系白血病 (AML CR)患者骨髓细胞衍生的树突状细胞 (DC)体外能否刺激自体T细胞产生特异性抗AML细胞的细胞毒活性。方法　应用羊红细胞玫瑰花结程序从AML CR患者的骨髓中分离出去T细胞的骨髓单个核细胞 (TD BMNC) ,并培养在含联合细胞因子 (GM CSF、IL 4、SCF或TNF α)的条件下以产生DC ,并在培养的第 5天用ACL进行冲击。培养 7d后收获细胞 ,用流式细胞仪测定其成熟DC表型。同时 ,这些细胞与经抗CD3抗体激活过的自体T细胞在低浓度IL 2条件下共培养 7d ,以产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。用乳酸脱氢酶释放实验测定溶细胞活性。结果　 1 2例AML CR患者培养的骨髓单个核细胞均分化为成熟DC。其中 6例完成CTL活性实验。当效∶靶 =2 0∶1时 ,ACL冲击的DC致敏的自体T细胞与单纯IL 2或IL 2加无抗原冲击的DC组比较对自体AML细胞有明显的杀伤活性 ,而对K562细胞均无明显影响 (P <0 .0 1 )。结论　用AML CR患者白细胞裂解物冲击的骨髓细胞衍生的DC体外致敏自体T细胞可以产生AML细胞相关抗原特异性的CTL。     

组合性细胞因子与钙离子载体诱导急性髓系白血病细胞向树突状细胞分化中的作用

目的：探讨钙离子载体能否诱导急性髓系白血病细胞分化为树突状细胞及其抗肿瘤免疫。方法：选择2004-01／09解放军广州军区广州总医院血液科住院的初诊或复发的急性髓系白血病患者7例。分离急性髓系白血病患者的急性髓系白血病细胞，在体外给予钙离子载体100μg/L培养3-5d（钙离子载体组），或1000U／mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、1000U／mL白细胞介素4和500U／mL肿瘤坏死因子α培养7-10d（组合细胞因子组）。通过细胞形态的观察及细胞免疫表型的检测鉴定树突状细胞，用同种异体混合淋巴细胞实验及细胞毒实验检测树突状细胞的功能。结果：①形态学观察和免疫表型变化：钙离子载体组及组合细胞因子组诱导急性髓系白血病细胞均可获得具有典型树突状细胞形态及免疫表型的成熟树突状细胞，但钙离子载体组诱导的树突状细胞表面CD80，CD86，CD83，CD40，CD54等分子的表达较组合细胞因子组明显增高。②混合淋巴细胞反应和胞毒性T淋巴细胞活性：钙离子载体组所诱导的急性髓系白血病细胞刺激同种异体混合淋巴细胞反应的能力及激发细胞毒性T淋巴细胞的活力比组合细胞因子组强。结论：钙离子载体能高效诱导急性髓系白血病细胞分化成树突状细胞，比组合细胞因子诱导分化的树突状细胞功能更强。     

急性髓细胞白血病细胞来源的树突状细胞的诱导及功能研究

为了研究急性髓细胞白血病(AML)细胞诱导成树突状细胞(DC)的方法及其DC的功能，分离25例AML患者骨髓或外周血单个核细胞，在含有细胞因子rhGM—CSF，rhIL-4，rhTNF—α的IMDM完全培养基中培养8—12天，进行细胞形态学、表型、遗传学及功能测定。结果表明：20／25例自诱导培养的第3天起，在倒置显微镜下可观察到部分细胞体积增大，形态由圆形变得不规则，可见驼峰样或细刺状胞浆突起；在第8—9天，该类细胞所占的比例达到峰值。至第12天，细胞总数及上述形态的细胞数量明显减少。诱导培养结束时收集细胞，应用流式细胞术检测11／20例诱导前后细胞表面标志的表达，结果表明诱导前细胞不表达CD1a、CD80及CD83，低表达CD86、CD54和HLA—DR；诱导后细胞CD1a、CD80、CD83、CD86、CD54及HLA—DR的表达明显上调。在同种异体混合淋巴细胞反应(Allo-MLR)中，该类细胞刺激同种异体淋巴细胞增殖一对^3H-TdR的摄取能力明显高于AML细胞。FISH证实诱导生成的具有DC特征细胞的AML起源。结论：体外联合应用细胞因子可将AML细胞诱导成具有DC形态、表型及功能特征的细胞(AML—DC)。     

树突状细胞与慢性髓系白血病的免疫治疗

树突状细胞（ＤＣ）的生物学特性及共在免疫应答中的重要作用,使之成为当前肿瘤免疫治疗研究的热点。它是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞,可在体内外活化ＣＤ４＋、ＣＤ８＋细胞,从而激发一系列的特异特性免疫应答。本语文就其科技司及其在抗肿瘤免疫特别是抗慢性髓系白血病免疫治疗中的作用作一综述。     

慢性髓性白血病人源树突状细胞的细胞毒作用及其体外扩增

本研究观察来源于慢性髓性白血病患者的CD34 细胞经两步培养扩增后产生的树突状细胞的抗白血病 免疫功能。从慢性髓性白血病患者骨髓或外周血中分离出CD34 细胞或外周血单个核细胞分别进行两步培养。 首先将其与rhFlt3-L和rhTPO共育7天,再与rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4共同培养14天,以诱导树突状细胞产 生:同时以rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4直接诱导体系作对照。获得的DC通过流式细胞仪检测免疫表型,电镜分 析细胞超微结构及G显带法进行的染色体分析后,并用MTT法检测DC刺激T细胞增殖能力及T细胞对CML细 胞的杀伤作用.结果表明:慢性髓性白血病的CD34 细胞经过rhFlt3-L和rhTPO的初始扩增培养7天后,CD34 细 胞总数扩增77±5倍。用rhGM-CSF、rhTNF-α及rhIL-4诱导培养14天,DC产率达到(39±8)％,细胞扩增倍数及 DC比例均明显高于直接诱导产生的培养方法(P<0.01),且此DC能刺激自体或异体T细胞增殖,进而杀伤CML 细胞。结论:两步法体外扩增培养可明显提高DC前体总数及产率,优于直接诱导培养;CML细胞来源的DC可诱 导产生抗白血病免疫反应。     

干扰素α对慢性髓系白血病来源的树突状细胞表达Fas／FasL的影响

本研究探讨干扰素α对慢性髓系白血病（CML）来源的树突状细胞（DC）表达Fas／FasL的影响。在CML—DCs的培养液中除加入SCF，GM—CSF，TNF—α及IL-4外，还加入IFN—α。培养10-14天，除了鉴定细胞免疫表型和Ph^1染色体比例外，还应用流式细胞仪检测细胞表达Fas／FasL比例，用PI染色分析细胞凋亡，ELISA法检测上清液sFas含量。结果表明：加入IFN-α后，CML—DC共刺激分子的表达显著改善，Ph^1（＋）细胞比例随IFN—α浓度增加而减低；培养细胞Fas的表达上调，sFas含量却下降，FasL表达阴性，细胞凋亡比例增加。结论：IFN—α在改善CML-DC表型同时，可通过Fas途径促进Ph^1（＋）细胞凋亡，使Ph^1（-）细胞数量相对增加。     

干扰素α对慢性髓系白血病来源树突状细胞表达Th细胞因子和CCR7的影响

本研究探讨干扰素α（IFN-α）对慢性髓系白血病（CML）来源树突状细胞（DC）表达趋化因子CCR7及分泌IL-10、IL-12P70的影响。在诱导CML-DCs的无血清条件培养基中，除加入SCF、GM-CSF、TNF-α及IL-4外．还加入不同浓度IFN-α。培养10—14天后，用流式细胞术检测共刺激分子及CCR7表达。G显带法显示Ph1染色体，噻唑蓝（MTT）法检测CML-DC刺激正常人外周血淋巴细胞增殖状况，ELISA法检测培养上清IL-10及IL-12P70含量。结果显示：IFN-α（300U／ml）组与无IFN-α组比较其CML—DC的CD40、CD83、CD86及CCR7的表达均升高1倍，异体混合淋巴细胞反应（MLR）中OD值增加1倍，Ph1染色体阳性比例及IL-10和IL-12P70浓度均减低。结论：IFN-α能够部分纠正CML-DC免疫表型及功能缺陷，这同其上调DC共刺激分子和CCR7表达及解除了CML血清中IL-10对CML—DC分化的抑制有关。     

慢性髓性白血病来源的树突状细胞的功能研究

为研究慢性髓性白血病（ＣＭＬ）来源的树突状细胞（ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ,ＤＣ）的功能,将ＣＭＬ骨髓和外周血单个核细胞在含ＧＭ－ＣＳＦ,ＩＬ－４,ＴＮＦ－α的培养基中培养７－１４天。利用流式细胞术对培养细胞进行表型鉴定,通过ＦＩＴＣ－ＤＸ（ＦＩＴＣ标记的葡聚糖）摄入实验,＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入和ＭＴＴ实验,以及ＬＤＨ释放试验,分别检测不成熟ＤＣ对外源抗原的摄入能力,成熟ＤＣ对外源和内源抗原的呈递能     

依托泊苷对伊马替尼体内清除慢性髓性白血病干细胞的作用研究

目的:探讨依托泊苷(ETO)对伊马替尼体内清除慢性髓性白血病干细胞的作用.方法:以SCL-tTA/ BCR-ABL小鼠为慢性髓性白血病动物模型,采用流式细胞术检测ETO单独或联合伊马替尼治疗慢性髓性白血病小鼠和正常FVB小鼠后,对小鼠骨髓和脾脏中白血病干细胞和外周血中性粒细胞数目的影响.结果:ETO和伊马替尼联合治疗后...     

急性髓细胞白血病树突状细胞的体外定向诱导及鉴定

目的 :从急性髓细胞白血病 (AML)外周血细胞诱导产生树突状细胞。方法 :将AML外周血细胞做原代培养 ,培养过程中加入GM -CSF、IL - 4和TNF -α等三种细胞因子诱导细胞向DC分化 ,并运用形态和免疫表型特点鉴定细胞。结果 :通过形态和免疫表型鉴定均证实 ,培养后多数细胞均符合DC特点 ,培养后细胞CD83和CD86共同表达的阳性率为 5 2 7% ,CD1a和HLA -DR共同表达阳性率为 17 1% ,外周血 1× 10 6个MNC经培养后可产生约 (6～ 11)× 10 4个DC。结论 :体外培养的AML患者外周血单个核细胞可诱导分化出大量DC     

自体树突状细胞活化的骨髓细胞对慢性粒细胞白血病骨髓的净化

为考察慢性粒细胞白血病(CML)患者自体树突状细胞(DCs)活化骨髓细胞、净化骨髓的作用,采用免疫磁珠从2例血液学缓解的CML骨髓单个核细胞(BMMNCs)分离DCs,另取BMMNCs置T-25塑料培养瓶建立Dexter培养体系,分为3份,第1份为对照,第2份加rhIL-2,第3份加自体DCs.每周取半量非贴壁细胞、计数、行CFU-GM检测,然后加等量新鲜培养基继续培养.当非贴壁细胞总数＜2×105时终止培养,收集贴壁细胞做CFU-GM集落形成试验并检测CD34和P210表达.取贴壁细胞形成的CFU-GM集落,抽提RNA,用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测BCR/ABL的表达.结果发现,在DCs加入CML骨髓Dexter培养体系培养后1-2周,非贴壁细胞的CFU-GM产量明显下降,与rhIL-2的体系基本平行,同时体系中的P210阳性细胞显著减少.不过,培养3周后含DCs的体系CFU-GM产量下降减缓,而含rh-IL-2的体系CFU-GM产量持续下降.在含自体DCs的Dexter体系,贴壁细胞中CD34+细胞和P210+细胞比例最低,只是贴壁细胞产生的CFU-GM集落中,BCR/ABL(+)的集落比例与不合DCs的体系比较无明显差别.这些结果说明自体DCs加入CML骨髓Dexter培养体系能减少白血病的祖细胞,包括成熟的祖细胞和原始的祖细胞,自体DCs有可能用于CML骨髓的体外净化.     

慢性髓系白血病骨髓间充质干细胞整联蛋白表达变化研究

为研究慢性期慢性髓系白血病（CML）患者骨髓间充质干细胞（BMMSC）的生长活性及其整联蛋白（integrins）的表达水平，并探讨BMMSC在CML发病中的作用，以慢性期CML患者为实验组，健康人为对照组，抽取骨髓液分离单个核细胞行BMMSC体外培养，动态观察细胞形态并进行计数、绘制生长曲线；取第3、4代BMMSC提取总RNA，逆转录，real—timePCR法检测integrin mRNA表达水平。结果表明：慢性期CML患者BMMSC生长活性较健康人无明显差异；实验组BMMSC表达integrin mRNA水平较对照组显著升高（P〈0．05）。结论：BMMSCs中integrin高表达影响CML发病。     

急性髓系白血病患者骨髓中树突状细胞亚群的定量分析

本研究探讨初诊急性髓系白血病（AML）患者骨髓中树突状细胞（dendritic cells,DC）亚群数量的变化特点。采用直接免疫荧光标记法,对30例健康志愿者和77例初诊AML患者的骨髓进行髓样Dc（myeloid DC,mDC）和浆细胞样DC（plasmacytoid DC,pDC）标记,用流式细胞仪进行检测,并用4色与传统3色两种设门方法进行分析。结果表明：与正常人骨髓中mDC与pDC的数量相比,4色设门方法分析显示,在77例初诊AML患者中：mDC数量减低、正常与增高的患者分别占74．0％（57例）、6．5％（5例）和19．5％（15例）,pDC数量减低、正常与增高的患者分别占90．9％（70例）、7．8％（6例）与1．3％（1例）;3色设门方法分析显示,mDC数量减低、正常与增高的患者分别占58．4％（45例）、19．5％（15例）和22．1％（17例）;pDC数量减低、正常与增高的患者分别占46．8％（36例）、26．0％（20例）与27．3％（21例）。两种设门方法所得结果,有统计学差异（p〈0．05）。在AML—M2、M3与M4／M5几个亚型中,4色设门方法分析显示：mDC数量减低患者所占比例分别为81．4％、100％与42．1％;pDC数量减低患者所占比例分别为88．4％、100％与89．5％。M4／M5型与M2、M3型相比,mDC数量正常或增高的患者较多,差异有统计学意义（P〈0．05）;pDC在各亚型中的数量变化无统计学差异（P〉0．05）。结论：4色设门方法比传统3色设门方法更适用于初诊AML患者骨髓中mDC与pDC数量的研究;大部分初诊AML患者表现为mDC与pDC数量的减低;M4／M5型与M2、M3型相比,mDC数量正常或增高的患者较多,而pDC在各亚型之间未见明显差别。