氡染毒小鼠骨髓细胞差异表达cDNA文库的构建和初步鉴定

目的 构建氡染毒小鼠骨髓细胞差异表达基因的cDNA文库。方法 采用HD-3型多功能氡室对雄性BALB/c小鼠动态吸入染毒,建立实验动物模型。按照实验动物吸入氡及其子体的累积剂量分为实验组(105 WLM)和对照组(室内本底浓度,1 WLM)。取骨髓细胞提取总RNA,采用SMART和抑制性消减杂交技术,构建正、反向消减cDNA文库,消减cDNA片段插入pMD18-T载体转化大肠杆菌,以含差异表达cDNA片段的菌液为模板进行巢式PCR扩增。结果 获得了完整无降解的总RNA,得到高效率的消减cDNA文库;克隆了244个有插入片段和长度在100～1100bp之间的单克隆。结论 成功构建了氡暴露小鼠骨髓细胞差异表达的正、反向cDNA消减文库。     

氡染毒小鼠肺及支气管组织的基因表达

目的 构建氡染毒小鼠肺及支气管组织差异表达基因的cDNA文库,并对其进行初步鉴定和同源性分析。方法采用SR-NIM02型氡室对小鼠进行吸入染毒后,常规饲养3个月,分别提取和纯化染毒组(30工作水平月,WLM)与对照组(0.02 WLM)小鼠的肺及支气管组织的总RNA,采用Super SMART技术和抑制性差减杂交技术(SSH),构建氡染毒后肺及支气管组织的正、反向差减杂交的cDNA文库;常规连接pGEM-T-easy载体,转化DH5α感受态细胞,巢式PCR鉴定;对阳性克隆测序,并与GeneBank数据库进行BLAST同源性比对,进行初步功能分类。结果共获得克隆460个,其中含有插入片段的克隆146个,经BLAST同源性比对后有48个正向差减cDNA片段与61个反向差减cDNA片段与GeneBank中的序列有不同程度的同源性。结论成功构建了氡染毒小鼠肺支气管差异表达cDNA文库,染毒后小鼠肺及支气管组织中某些基因会发生差异表达,其中部分基因可能参与细胞凋亡和周期调控、机体免疫调节及细胞间信号传导等过程。     

氡及其子体暴露小鼠肺组织p53基因表达及突变研究

目的 观察氡及其子体暴露对小鼠肺组织P53蛋白表达及基因突变的影响。方法 建立氡染毒小鼠模型,使染毒累积剂量分别为30和60工作水平月(WLM);采用TUNEL法,检测小鼠肺组织细胞凋亡程度;采用免疫组化S-P法、Western-blot法及实时荧光定量PCR法,检测各组肺组织P53蛋白表达情况;采用PCR-SSCP法检测p53基因的突变情况。结果 与正常对照组相比,氡染毒30和60 WLM小鼠肺细胞凋亡指数均明显增加(t=18.11、-10.30,P<0.05);氡染毒30和60 WLM组P53蛋白亦明显增加(t=-11.08、-7.00,P<0.05)。但整个实验未观察到p53基因突变。结论 p53与氡染毒诱发小鼠肺损伤密切相关。     

氡诱发小鼠肺损伤与P53和Bcl-2、Bax蛋白表达的研究

目的 建立氡染毒小鼠肺损伤模型,观察不同剂量组小鼠肺组织损伤情况,分析氡对P53、Bcl-2、Bax在肺组织中表达的影响。方法 建立氡染毒小鼠模型,使染毒累积剂量分别达到30工作水平月(WLM)和60WLM;采用TUNEL法检测小鼠肺组织细胞凋亡程度;采用免疫组化SP法及Westernblot法,检测各组肺组织P53、Bcl-2、Bax蛋白表达情况。结果 与正常对照组相比,氡染毒30和60WLM小鼠肺细胞凋亡指数均明显增加(t=18.11、-10.30,P<0.05);氡染毒30WLM组P53蛋白明显增加(t=-11.08,P<0.05);60WLM组P53蛋白和Bax蛋白表达明显增加(t=-7.00、-2.52,P<0.05),Bcl-2蛋白表达明显下降(t=4.36,P<0.05);氡染毒30和60WLM与对照组相比,Bcl-2、Bax比值均明显下降(t=2.78、4.07,P<0.05)。结论 氡染毒可使小鼠肺损伤,出现肺细胞凋亡,P53、Bcl-2、Bax途径可能参与了肺细胞的凋亡调节。     

吸入氡致大鼠肺蛋白质组表达变化的分析

目的 从蛋白质组学角度分析氡染毒后大鼠肺组织蛋白质表达谱的变化。方法 雄性Wistar大鼠氡吸入染毒累积剂量分别达100、200、400工作水平月(WLM)后,取大鼠肺组织,裂解提取其总蛋白;双向电泳(2-DE)分离总蛋白,ImageMaster 2D Platinum软件分析差异表达蛋白,切取差异蛋白点,胶内酶解并进行质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定。结果 正常对照组和氡染毒组大鼠肺组织的2-DE图谱有明显差异,差异表达点中与氡染毒呈剂量变化关系的点有14个表达上调,9个表达下调,质谱鉴定出其中的15个差异蛋白点。结论 氡染毒组大鼠肺组织的蛋白表达谱发生了一定的差异性,氡吸入致靶器官肺损伤可能与多种蛋白相关。     

应用抑制性消减杂交技术筛选膦甲酸钠免疫调节基因

目的 应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建膦甲酸钠(PFA)处理的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆PFA免疫调节相关基因,阐明PFA免疫调节的分子生物学机制。方法 以PFA处理Jurkat细胞,同时以生理盐水处理的相同细胞作为对照;24h后制备细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa1酶切后,将实验组cDNA分成两组．分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性多聚酶链反应(PCR)扩增,将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建了PFA处理淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到46个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的14个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得11种已知基因序列和3个未知基因。结论 应用SSH技术成功构建了PFA处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明PFA的免疫调节机制及深入了解PFA防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

应用抑制性消减杂交技术研究甘草甜素免疫调节靶基因

目的应用抑制性消减杂交(SSH)技术构建甘草甜素刺激的人T淋巴细胞Jurkat差异表达基因的cDNA消减文库，筛选并克隆甘草甜素免疫调节靶基因，阐明甘草甜素免疫调节的分子生物学机制。方法以甘草甜素刺激Jurkat细胞，同时以生理盐水刺激的相同细胞作为对照；24h后提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交分析并构建cDNA消减文库，随机挑选文库克隆，PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果文库扩增后得到28个阳性克隆，进行菌落PCR分析，均得到200～1000bp插入片段。挑取含有插入片段的22个克隆进行测序，并通过生物信息学分析获得11种已知蛋白基因编码序列。主要包括IL-12、IL-18、胸腺素等免疫调节基因。结论应用SSH技术成功构建了甘草甜素处理的淋巴细胞差异表达基因的cDNA消减文库。为进一步阐明甘草甜素的免疫调节机制及深入了解甘草甜素用于防治病毒性肝炎的药理作用机制提供了依据。     

SSH方法分离大剂量照射后小鼠骨髓差异表达EST序列

目的 为探讨骨髓辐射损伤的分子机理，研究了整体照射条件下，辐射前后骨髓基因表达的变化。方法 小鼠7Gyγ射线照射后4h提取骨髓总RNA为实验方(tester)，对照组动物骨髓总RNA为驱动方(driver)；实验方、驱动方总RNA由SMART cDNA合成方法合成双链cDNA，进而由抑制消减杂交(SSH)方法获得消减杂交产物．消减杂交产物克隆到T载体建立消减文库；对部分克隆进行杂交筛选及序列比对。结果 消减杂交文库挑取800个克隆进行PCR扩增，阳性率约为86％；部分克隆经两轮杂交筛选获得14个差异片段；7个差异片段与鼠EST库已有序列高度相似，其余7个差异片段可能是新的EST序列。结论 大剂量照射后小鼠骨髓cDNA消减文库的建立以及部分差异表达EST的验证为进一步研究辐射相关差异表达基因奠定基础。     

人胃癌抑制消减cDNA文库的构建及文库质量分析

目的 :构建人胃癌抑制消减cDNA文库 ,为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定基础。方法 :从胃癌和癌旁正常组织分离poly(A) +RNA ,经反转录后 ,利用抑制消减杂交(SSH)方法 ,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库。结果与结论 :挑取 80 0个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段 ,结果显示其中 750个克隆有插入片段 ,片段大小范围为 2 50～ 70 0bp。为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定了基础。     

人胃癌印制消减cDNA文库的构建及文库质量分析

目的：构建人胃癌抑制消cDNA文库,为大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定基础。方法：从胃癌和癌旁正常组织分离poly（A）^ RNA,经反转录后,利用抑制消减杂交（SSH）方法,通过两轮杂交和两次抑制PCR构建了两种组织间差异表达基因的cDNA消减文库,结果与结论：挑取800个克隆进行PCR扩增检测是否有插入片段,结果显示其中750个克隆有插入片段,片段大小范围为250－700bp。为进一步大批量筛选、克隆胃癌特异性表达的基因奠定了基础。     

+10 Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因cDNA文库的构建

目的构建＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因的消减cDNA文库。方法本实验用SD大鼠，分别提取暴露组与对照组的总RNA，并分离纯化mRNA，应用抑制性消减杂交技术分离＋10GI重复暴露大鼠脑差异表达基因eDNA片段并建立消减eDNA文库；利用PCR对随机挑选的75个白色菌落进行插入片段的验证，对其中70个克隆进行eDNA斑点杂交验证。结果所构建的eDNA文库扩增后包含约400个白色克隆和100个兰色克隆，随机挑选75个白色克隆入质粒载体后共获得70个阳性克隆。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了＋10Gz重复暴露大鼠脑差异表达基因消减eDNA文库，为进一步筛选和克隆脑损伤相关基因奠定了基础。     

BEP2D细胞恶性转化不同时期差异表达基因的筛选

目的 筛选并鉴定α粒子辐射诱发永生化人支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化不同时期差异表达的基因。方法 抑制消减杂交(SSH)，cDNA芯片。结果 利用SSH构建了BEP2D细胞3个恶性转化不同时期差异表达基因的文库。BEP2D细胞的文库有416个克隆，R15H20细胞的文库有301个克隆，R15H35细胞的文库有586个克隆，经cDNA Microarray验证发现：BEP2D细胞文库来源的芯片与3代细胞探针杂交后的阳性信号率为90．4％、21．6％和19．7％；R15H20细胞文库来源的芯片的阳性信号率为8．6％、93．8％和31．6％：R15H35细胞文库来源的芯片的阳性信号率为23．5％、18．2％和90．7％。结论 联合应用SSH和cDNA Microarray是筛选和鉴定不同样本中差异表达基因的快速和有效方法；经cDNA Microarray鉴定出的3个文库中差异表达的cDNA可能代表了α粒子诱发人支气管上皮细胞恶性转化相关的基因。     

应用抑制消减杂交克隆内皮细胞内毒素刺激后相关基因

提取人脐静脉内皮细胞经内毒素刺激6h后的mRNA并合成cDNA，与对照组进行抑制消减杂交，经菌落斑点杂交筛选出阳性克隆，进行测序和同源性分析，并采用Northern杂交验证新的cDNA序列，共获得25条差异表达基因，涉及与编码炎症介质、胞内信号传导、细胞骨架、细胞凋亡和能量代谢相关的基因，其中3条为新基因序列。结果表明，抑制消减杂交技术有效地克隆了内皮细胞内毒素刺激后相关基因，有助于阐明内毒素激活血管内皮细胞的机制，并为临床防治内毒素损害寻找新的作用靶点提供了根据。     

Mortality from cancers of the extra-thoracic airways in relation to radon progeny in the Wismut cohort, 1946–2008

Abstract

Purpose: Inhalation of radon progeny can cause high lung and respiratory tract radiation doses. The aim of this paper was to examine the relationship between radon progeny and cancers of the extra-thoracic airways in the German uranium miner cohort for an extended follow-up through 2008.

Methods: The cohort included 58,690 workers employed between 1946 and 1989 at the Wismut company. Exposure to radon progeny in Working Level Months (WLM) was determined from a comprehensive job-exposure matrix. The mean (max) cumulative exposure to radon among exposed cohort members (86%) was 280 WLM (3,224 WLM). Internal Poisson regression models were applied to estimate the linear Excess Relative Risk (ERR) per unit of cumulative exposure to radon.

Results: A small increase in the mortality from all cancers of the extra-thoracic airways combined with increasing cumulative exposure to radon was found (ERR/100 WLM = 0.036, p = 0.12), based on 234 deaths. The estimated ERR per 100 WLM for relevant cancer sub-groups were: 0.017 (p > 0.5) larynx (n = 94); 0.077 (p = 0.20) pharynx (n = 74); and 0.030 (p > 0.5) tongue and mouth (n = 55).

Conclusion: Results indicated a small but not statistically significant increase in mortality from cancers of the extra-thoracic airways in relation to radon. Low statistical power and uncontrolled confounding were limitations of this study.     

小鼠胚胎成纤维细胞差异表达基因的筛选

应用微阵列杂交法对培养前，后的小鼠胚胎成纤维细胞（MFF）mRNA进行检测，找到24类差异表达的基因，为进一步筛选MEF可能表达的新基因，对培养前（driver)，后（tester)的MEF mRNA进行抑制性消减杂交，产物与pGEM-T载体连接构建cDNA削减文库并转染JM109大肠杆菌。随机挑取阳性克隆，PCR扩增后对所得的差异表达基因进行测序及生物信息学分析。在随机挑取的145个克隆中，测得了128条EST序列，经生物信息学分析，它们代表了42类不同基因和3条新基因序列。结果表明，培养后MEF相对于培养前胚胎成纤维细胞确实存在差异表达基因群。提示，进一步的实验研究可能找出对ES细胞增殖分化有重要调控作用的基因或基因群。     

氡染毒小鼠肺及支气管中JNK/SAPK表达的研究

目的 研究氡吸入染毒小鼠肺及支气管组织中JNK/SAPK信号通路的表达变化。方法 采用SR-NIM02型氡室对小鼠进行吸入染毒0.02、30和60工作水平月(WLM)),染毒结束后24h内处死;提取小鼠肺及支气管组织总RNA,利用Real-Time PCR定量分析JNK mRNA的表达水平;分别利用Western blot和免疫组织化学技术检测肺及支气管组织中JNK蛋白表达及其磷酸化水平。结果 Real-time PCR检测结果显示,染毒30与60WLM组的JNK mRNA水平分别是对照组的3.56倍和2.96倍(单因素方差分析,F=8.00,P<0.05);Western blot结果显示,染毒30和60WLM组的JNK蛋白相对表达量分别为对照组的1.21和1.35倍(单因素方差分析,F=5.76,P<0.05),JNK蛋白磷酸化水平分别为对照组的2.34和2.81倍(单因素方差分析,F=6.83,P<0.05);免疫组化结果显示,染毒后小鼠肺组织中JNK与胞核中磷酸化JNK蛋白表达增强。结论 氡吸入染毒后可激活细胞内的JNK/SAPK信号通路,使其表达增强,并且磷酸化激活进入胞核,进而引起组织细胞的一系列反应。