抗人ClqMcAb轻链可变区基因结构特点

运用计算机进行基因序列分析在分子生物学研究中起重要作用，已被越来赵多地用于研究大量累积的序列数据，获得许多重要发现。对抗人Ｃｌｑ轻链可变基因的分析结果表明：ＣｌｑＶＬ属鼠ＩｇＶＫ基因家族，但与其它种属的Ｉｇ基因也显示较高同源性。     

抗人C1q轻链可变区的序列结构分析

将抗人Ｃ１ｑ轻链可变区（ｐＣ１ｑＶＬ）氨基酸序列与Ｓｗｉｓｓ蛋白质库的序列进行同源性检索及与已知的ＩｇＶ功能区相关分子进行对准比较，检索了同源性积分子的统计学意义，结果表明ｐＣ１ｑＶＬ归属鼠ＩｇＶＫ，符合Ｉｇｋ轻链可变区的基本特征。同时进行了亲水性、可及性分析及二级结构预测，这为利用构象分析方法研究ｐＣ１ｑＶＬ构象特点打下了基础。     

宫颈癌组织中人乳头瘤病毒16型L1基因的克隆及序列分析

目的人乳头瘤病毒１６型（ＨＰＶ１６）晚期基因区（Ｌ１）编码病毒的主要衣壳蛋白,且ＨＰＶ１６感染与宫颈癌发生、发展关系密切,故对中国妇女感染的ＨＰＶ１６基因进行克隆及序列分析有重要实际意义。方法采用聚合酶链反应技术（ＰＣＲ）扩增了３例中国妇女宫颈癌组织中ＨＰＶ１６的Ｌ１基因片段,并对其进行了克隆及全序列分析。结果发现３个ＨＰＶ１６Ｌ１基因核苷酸序列有４处均与最初报道的ＨＰＶ１６Ｌ１ＤＮＡ序列不同,并由此引起所编码的氨基酸亦发生变化。结论中国妇女宫颈癌组织中ＨＰＶ１６Ｌ１核苷酸有一定程度变异。     

抗人C1q McAb轻链可变区基因结构特点

运用计算机进行基因序列分析在分子生物学研究中起重要作用，已被越来越多地用于研究大量累积的序列数据，获得许多重要发现。对抗人Ｃ１ｑ轻链可变基因（Ｃ１ｑＶ_Ｌ）的分析结果表明：Ｃ１ｑＶＬ属鼠ＩｇＶＫ基因家族，但与其它种属的Ｉｇ基因也显示较高同源性。它的另─个显著特点是与自身抗体编码基因高度同源。研究结果对我们进─步认识抗－Ｃ１ｑ抗体生理、病理作用具有─定价值。     

人乳头瘤病毒16型转换基因的序列分析

为了解中国地区宫颈癌病人中人乳头瘤病毒１６型Ｅ６Ｅ７基因结构特点,从中国山东地区宫颈癌活检组织中提取组织ＤＮＡ,经ＨＰＶ多重引物ＰＣＲ法鉴定标本中感染ＨＰＶ型别,选单纯感染ＨＰＶ１６两例标本ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增,获得ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７基因后,重组入ｐＡＬＴＥＲ－１载体,进行双向测序、分析。ＤＮＡ序列分析表明：两例标本的ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７序列全长均为７７６ｂｐ,与已发表的德国标准株长度相等,两     

人乳头瘤病毒16型结构基因L1在昆虫细胞中的表达及其生物学活性

目的 研究与宫颈癌及人类其它多种组织癌症密切相关的人乳头瘤病毒16型（HPV16）的晚期基因L1的表达及其生物学活性。方法 采用PCR法从pBSSK-B/16L1扩增了来自中国妇女鲍温病组织标本的HPV16晚期基因L1,装入杆状病毒转移载体;在DH10Bac内通过转座子Tn7的介导,使携带有杆状病毒多角体蛋白基因启动子Ppolh的HPV16 L1基因整合入杆状病毒,形成重组杆状病毒;转染昆虫细胞Sf9进行表达;将感染72h的Sf9细胞包埋、切片、染色后,电镜观察。提取L1蛋白,免疫BALB／ c小鼠。结果 重组杆状病毒在Sf9细胞内高效表达出L1蛋白,经Western blot发现能与L1抗体特异地结合;薄层扫描显示所表达的L1蛋白占Sf9细胞总蛋白的比例高达31％。经透射电镜观察表明,在细胞核里有大量的重组杆状病毒形成;并且产生了大量的由HPV16 L1蛋白单体自组装的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP)。小鼠免疫实验结果表明,所表达的HPV16 L1蛋白单体自组装的病毒样颗粒（virus-like particles,VLP)。小鼠免疫实验结果表明,所表达的HPV16 L1蛋白具有强免疫原性。结论 此研究为今后L1基因分子流行病学检查、L1蛋白的结构生物学研究、疫苗研制以及HPV相关基础性研究提供了有用的资料。     

人乳头瘤病毒16型中国株L1基因的体外真核表达

目的 构建人类乳头瘤病毒16型(HPV16)中国株晚期基因L1的真核表达系统.方法 将HPV16中国株L1基因从pCR2.1/HPV16L1定向亚克隆至pTacer-CMV载体,构建重组质粒pTaeer-CMV/HPV16L1,将重组质粒用脂质体转染N1H3T3、HeLa细胞,用透射电镜、SDS-PAGE、蛋白印迹等方法观察HPV16 L1蛋白的表达.结果 NIH3T3、HeLa细胞经pTacer-CMV/HPV16L1转染后,SDS-PAGE、蛋白印迹等实验显示可表达HPV16 L1蛋白,电镜下可见病毒样颗粒(VLP).结论 pTacer-CMV/HPV16L1构建成功,可在体外表达HPV16中国株L1蛋白.     

人乳头瘤病毒16型晚期蛋白L1的表达及病毒样颗粒的装配

目的　在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )哈尔滨地区分离株的晚期蛋白L1,并分离纯化由L1蛋白在细胞中自主组装成的病毒样颗粒 ,为HPV16预防性疫苗的研制奠定基础。方法　获得含有HPV16L1基因的重组杆状病毒并使目的蛋白L1在昆虫细胞中表达 ;对重组杆状病毒的扩增条件及L1蛋白的表达水平进行优化 ;电镜下观察昆虫细胞中晚期蛋白装配成病毒样颗粒的情况 ,经氯化铯密度梯度纯化病毒样颗粒 ,并经Westernblot进行验证。结果　获得了稳定表达L1蛋白的重组杆状病毒 ;以MOI值为 0 .2感染昆虫细胞可获得较高滴度的重组病毒 ,以MOI值为 10感染昆虫细胞可获得较高水平的L1蛋白表达 ;电镜下可观察到昆虫细胞核内直径为 5 5nm的病毒样颗粒 ;病毒样颗粒可通过氯化铯密度梯度离心获得。结论　获得人乳头瘤病毒哈尔滨地区分离株L1蛋白可在昆虫细胞中自主装配的病毒样颗粒并成功分离纯化。     

抗人C1q轻链可变区基因在E.coli中的表达

应用基因工程技术，将抗人Ｃ１ｑ轻链可变区基因的重组质粒ｐＧＥＭ－Ｃ１ｑＶＬ中分离，克隆进表达载体ｐＪＬＡ５０２。该表达截体含ＣＩＴｓ８５７抑制子基因，通过开温诱导法，重组表达子在宿主菌ＨＢ１０１中表达，获得抗人Ｃ１ｑ轻链可变区片段，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ表明其分子量范围为１２－１３ＫＤ。这为进一步抗人Ｃ１ｑ小抗体的表达积累了经验，有利于用于抗原－抗体结构功能的研究。     

人乳头瘤病毒16L1原核表达质粒的构建

目的：构建人乳头瘤病毒16L1的原核表达质粒,为下一步探讨蛋白的表达以及蛋白的功能研究作准备。方法：以临床HPV16阳性标本为模板,PCR扩增L1的片段,L1片段经EcoRI和SalⅠ双酶切后,插入载体pGEX4T-1,转化JM109感受态细胞,平板筛选获得pGEX4T-1／HPV L1的阳性质粒。通过酶切、测序验证质粒的正确性。结果：构建了原核表达质粒pGEX4T-1／HPV16L1,并通过酶切、测序等方法验证其完全正确。结论：成功构建的pGEX4T-1／HPVL1为今后的蛋白的表达和功能研究打好了坚实的基础,为HPV16的疫苗研究提供了有益的支持。     

抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体可变区基因的克隆和序列分析

目的: 克隆并分析抗溶藻弧菌独特型单克隆抗体(mAb)VH及VL基因。方法: 从分泌抗溶藻弧菌独特型mAb的杂交瘤细胞株 (AL1 )中提取总RNA。利用RT- PCR技术,克隆抗溶藻弧菌独特型mAbVH 和VL基因, 并将其重组入PMD18 Tvector中进行测序分析。结果: VH基因序列全长为369bp, 编码 123个氨基酸; VL基因序列全长为 339bp, 编码113个氨基酸。通过国际联机检索及Kabat库分析, 二者均符合小鼠IgGV区基因的特征, 含有 4个框架区 (FR), 3个抗原互补决定区 (CDR)及两个抗体特征性的半胱氨酸残基。结论: 抗溶藻弧菌独特型mAb的VH和VL基因的克隆成功,为抗溶藻弧菌独特型mAb基因工程疫苗的构建奠定了基础。     

抗人CD16单克隆抗体可变区基因的克隆和表达

目的：克隆抗人CD16单克隆抗体重，轻链可变区（VH，VL）基因并合成单链抗体（ScFv)基因。方法：从分泌抗人CD16单克隆抗体的杂交瘤细胞B88－9中提取总RNA，应用RT－PCR技术获得抗CD16单克隆抗体的VH，VL基因，用连接肽（Linker)肽VH和VL连接成具有VH－Linker-VL结构的ScFv基因，将其克隆到表达载体pcDNA3.1( )，并转杂COS－7细胞。结果：VH基因长度为354bp，属于鼠抗体可变区重链基因家族I（B）亚群，VL基因长度为333bp，属于鼠抗体可变区kappa轻链基因家族Ⅲ亚群，采用夹心ELISA方法检测到ScFv的表达。结论：抗人CD16单克隆抗体VH与VL基因的克隆和ScFv基因的构建为基于CD16的导向免疫治疗奠定了基础。     

Nucleotide sequence analysis of a human monoclonal antibody 22-13 reactive with lung tumor-associated antigen

A human monoclonal antibody (HuMAb) 22-13 (IgG1, κ) recognizes a cytoplasmic antigen associated primarily with human lung tumors. This study reports the primary nucleotide and deduced amino acid sequences of the rearranged heavy and light chains of the HuMAb 22-13. This HuMAb uses a V_H gene member of the V_HIa gene family, 51P1 and is productively rearranged with a D–D fusion product of the D_LR2 and D_XP2 germ line D_H genes and the germ line J_H3 gene. HuMAb 22-13 V_κ belongs to the κ light chain variable subgroup IIIb family and appears to be derived from the Humkv325 germ line gene and is rearranged with a germ line J_κ5 gene. The results reveal that production of a HuMAb 22-13 is achieved by rearrangement of the 51P1/Humkv325 germ line variable region gene combination, associated with the autoimmune repertoire and that HuMAb 22-13 has a striking sequence homology to rheumatoid factors (RFs) of the Wa idiotypic family. HuMAb 22-13 and Wa RFs have in common V_HIa and V_κIIIb gene segments, but use different D_H, J_H and J_κ gene segments. However, in spite of this structural similarity, HuMAb 22-13 does not display rheumatoid factor activity. Taken together with the reported findings, these data indicate the representation of the shared usage of highly homologous variable region genes in entirely different humoral immune responses in the human system.     

带有引导序列的抗-D抗体可变区基因的扩增和序列分析

目的:从引导区扩增获得高度特异性和亲和力的抗-D抗体的可变区基因, 并进行序列分析。方法:提取1株分泌抗-D抗体的人B淋巴细胞株的总RNA, 从引导区设计引物, RT-PCR扩增抗-D抗体的可变区基因, 分别对扩增产物进行分子克隆和测序。结果:用重链引物和轻链引物分别扩增出440bp和410bp的特异带。序列分析表明, 其核苷酸及其所推导的氨基酸(AA)序列符合人Ig可变区基因的序列特征。结论:获得了抗-D抗体可变区基因, 为基因工程抗-D的研制及Rh新生儿溶血病的预防提供物质基础。     

Detection of capsid antigen of human papillomavirus (HPV) in benign lesions of female genital tract using anti-HPV monoclonal antibody.

We established a murine monoclonal antibody (K1H8) to human papillomavirus (HPV) using alkaline-disrupted virions of HPV type 1 (HPV-1) as the immunogen. K1H8 recognized a 57 kD capsid protein of HPV-1 and detected the antigen in paraffin sections of formalin-fixed tissue. With K1H8, we examined immunohistochemically 68 biopsy specimens obtained from the female genital tract. The specimens were histologically condyloma acuminatum or koilocytotic lesions with or without dysplasia and each specimen was found to harbour a single type of genital HPV, such as types 6, 11, 16, 18, 31, 33, 42, 51, 52, 56, and 58, by Southern blot hybridization analysis. The antigen was localized in the nuclei and occasionally in the cytoplasm of squamous cells showing koilocytotic changes. Eighty-four per cent of the specimens (57 cases) showed positivity for the antigen, indicating that K1H8 is a broadly-reactive antibody to various genital HPVs. The results suggest that benign mucosal lesions of the female genital tract are more frequently associated with viral production and are a potential source of transmission.     

人乳头瘤病毒16型修饰后E6E7基因免疫原性增强

利用突变修饰后消除转化活性并保留抗原性的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(human papillomavirus type 16,HPVl6)E6E7融合基因(fmE6E7)，研制治疗HPVl6相关疾病的DNA疫苗。用PCR扩增fmE6E7基因后，插人真核表达质粒获得pVRl012-fmE6E7，瞬时转染Cos-7细胞，免疫荧光法检测证实其表达后，在C57BL／6小鼠后腿肌肉进行裸DNA免疫，5lCr释放法体外分析免疫鼠的细胞毒性T淋巴细胞活性Cytotoxic T lymphocyte，CTL)，间接ELISA法检测免疫鼠血清中E7特异性抗体。研究表明修饰后的中国地方株E6E7融合基因可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应，与单独野生型E7基因免疫相比，E6E7融和基因可更好的活化CTT反应。表明修饰后消除转化活性的中国地方株E6E7融合基因可作为HPVl6治疗性DNA疫苗的靶基因。     

稳定表达人乳头瘤病毒(HPV)58型E6E7融合基因的B16细胞系的建立

目的:构建pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,稳定转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,建立稳定表达HPV58E6E7基因的B16细胞系。方法:采用PCR方法扩增出HPV58E6E7融合基因的全长序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pIRES-neo中,并加入酶切位点和6×his标签,构建重组真核表达质粒pIRES-neo-HPV58E6E7。利用阳离子脂质体介导法将其转染入小鼠黑色素瘤B16细胞,经G418加压筛选出稳定转染的阳性克隆。利用Western blot、流式细胞术、免疫荧光等检测方法验证HPV58E6E7融合基因在稳定转染的B16细胞株中的表达。结果:经PCR、限制性内切酶鉴定及测序分析,pIRES-neo-HPV58E6E7重组质粒构建正确,转染B16细胞株后,经过Western blot、流式细胞术和免疫荧光等检测显示B16细胞株能够稳定、高效表达HPV58E6E7融合基因,表明B16-HPV58E6E7稳定转染细胞系构建成功。结论:成功构建了pIRES-neo-HPV58E6E7真核表达载体,建立了可以高效、稳定表达HPV58E6E7融合基因的B16细胞系。该稳定转染细胞系的建立为进一步研究HPV58治疗性基因疫苗的功能提供了良好的靶细胞,为其在肿瘤免疫治疗中的应用奠定了研究基础。