人血管生成素-1真核表达载体的构建与表达

目的构建人血管生成素-1的真核表达载体,真核表达人血管生成素-1蛋白并进行纯化。方法通过聚合酶链反应（PCR）将人血管生成素-1基因片段插入B7载体中构建真核表达载体,通过转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞进行真核表达。结果成功构建了B7Ang-1真核表达载体,在CHO细胞中进行了稳定表达,获得了纯化的人血管生成素-1蛋白。结论真核系统表达的人血管生成素-1蛋白具有良好的抗原性,为进一步的生物活性研究和临床应用奠定了基础。     

人血管生成素-1基因的克隆及原核、真核表达载体的构建

血管生成素（angiopoietin）是近年来发现的与血管生成、抑制密切相关的分子。为研究其在肿瘤血管生成及转移中的作用，利用PCR技术从人胎盘组织中得到血管生成素-1基因，并亚克隆至pRSET C原核表达载体及pcDNA3.1-V5-HisC真核表达载体，成功地构建了原核及正反义真核表达载体，为下一步研究其对消化道肿瘤血管生成的影响打下了基础。     

人血管生成素-1基因cDNA的克隆及结构分析

 目的 克隆人血管生成素-1基因,并分析其结构特征,为研究生理及病理性血管生成奠定基础。方法 提取人胎盘组织总RNA,用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术扩增逆转录产物,经克隆及序列测定获得人血管生成素-1 cD-NA;用计算机软件分析基因序列及编码蛋白质结构。结果 获得高质量的胎盘组织总RNA。RT-PCR扩增出—1.5 kb的cD-NA片段,将PCR产物的阳性克隆测序,显示含1534 bp的插入片段,可编码503个氨基酸的蛋白质,与小鼠的血管生成素-1氨基酸高度同源。编码的氨基酸中含3个功能结构域。结论 为从基因及蛋白质水平研究人血管生成素-1与生理、病理性血管生成奠定了基础。     

重构型人caspase-8基因原核表达载体的构建及其表达

目的：构建三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体，转染大肠杆菌并诱导其表达。方法：将人caspase—8催化结构域基因及两种大、小亚基基因次序颠倒的重构型人caspase—8基因克隆人原核表达载体pBV220，转染大肠杆菌并诱导表达。结果：成功构建了三种重构型人caspase—8基因的原核表达载体。转染大肠杆菌后，经温度诱导，重构型人caspase—8基因获得了高效的表达。结论：在大肠杆菌中成功表达了三种重构型人caspase—8基因。     

人NR1靶片段的原核表达

目的 :克隆人N_甲基_D_门冬氨酸受体 (NMDAR ,NR)靶片段cDNA ,构建其原核表达载体并建立相应的表达体系。方法 :用常规RT_PCR法从脑肿瘤切除组织中克隆人NR1靶片段cDNA ,测序鉴定后构建其原核表达载体 ,并在大肠杆菌DH5α中升温诱导表达 ,表达产物通过SDS_PAGE分析及免疫印迹分析进行鉴定。结果 :成功克隆了人NR1靶片段 4 89bp长cDNA ,测序结果与文献报道一致 ,原核表达载体在宿主菌中诱导表达后得到了NR1蛋白靶片段的高效表达产物 ,占全菌体 15 %～ 30 %。SDS_PAGE及免疫印迹分析与预计相同。结论 :人NR1靶片段可通过改构设计在原核体系中获得高效表达     

重组人血管能抑制素分泌型表达载体的构建及其生物学效应研究

目的　构建表达分泌型人血管能抑制素 (canstatin)蛋白的真核表达载体 ,观察其生物学效应。方法　以SOEPCR法将canstatin及癌胚抗原 (CEA)引导肽cDNA体外连接 ,并定向克隆到真核蛋白表达载体pCMV Script上 ,脂质体介导转染HUVEC及A5 4 9细胞 ,荧光定量PCR法检测转染细胞canstatin基因表达量 ,并采用多种方法检测该重组载体的生物学活性。结果　成功构建canstatin分泌型载体 ,在其转染的肿瘤细胞和人脐静脉内皮细胞中均检测到不同拷贝数的表达。转染后HUVEC生长增殖缓慢 ,出现G0 ～G1期阻滞并伴有大量凋亡 ,与空载体转染组相比差异有统计学意义 (P <0 0 5 ) ;而A5 4 9细胞转染后与空载体转染组在以上几个方面差异均无统计学意义 (P >0 0 5 )。重组载体转染A5 4 9细胞上清液干预的鸡胚绒毛尿囊膜血管生成明显减少 ,且颜色苍白、轮廓模糊 ,空载体转染组和未干预组血管生长旺盛、脉络清晰。结论　SOE法构建的含有CEA引导肽的canstatin分泌型表达载体能在转染的内皮细胞及肺癌细胞中稳定表达 ,可有效抑制内皮细胞生长增殖并诱导凋亡。重组载体转染的细胞可分泌有生物学活性的canstatin。     

马疱疹病毒1型ORF30基因原核表达载体的构建

马疱疹病毒1型(Equid herpesvirus 1,EHV-1)是引起孕马流产的主要病原体之一,也与死胎、新生幼驹死亡、青年马鼻肺炎以及一种名为马疱疹病毒性脑脊髓病(Equine herpesvirus myeloencephalopathy,EHM)的神经系统疾病有关。近些年来,EHM出现的频率越来越高,对养马业和赛马业的危害很大。最新研究结果显示,神经致病性毒株与编码病毒DNA聚合酶催化亚基的ORF30基因单核苷酸点突变有着很高的相关性。为了获得马疱疹病毒1型DNA聚合酶,并制备DNA聚合酶的多克隆抗体,本研究以EHV-1-XJ2015毒株基因组DNA为模板,扩增ORF30基因编码区,并连接于pMD19-T载体上,用BamHI和HindIII双酶切后,将酶切产物插入表达pET-28a(+)中,转化入大肠杆菌DH5感受态细胞,构建ORF30基因的原核表达载体pET-28a(+)-ORF30。通过酶切、PCR扩增和测序等方法对阳性重组质粒进行了鉴定。结果表明,构建的重组质粒pET-28a(+)-ORF30经BamhⅠ和HindⅢ双酶切后,经1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与预期相符,表明目的片段成功插入载体pET28a(+)中。通过采用特异性引物对重组质粒pET28a(+)-ORF30进行PCR鉴定,产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察,得到一条大小约1074bp的清晰条带,与目的基因大小相符,表明重组质粒pET28a(+)-ORF30构建成功。本研究为进一步探讨马疱疹病毒1型ORF30基因遗传变异对DNA聚合酶功能的影响奠定了基础。     

蜘蛛牵引丝蛋白MaSp1原核表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达与纯化

目的通过基因工程手段实现牵引丝关键组成蛋白MaSp1在大肠杆菌中的异源表达,并对其进行分离纯化,从而建立基因工程蜘蛛丝基因序列串联拼接、载体构建以及原核表达与纯化的关键技术体系。方法利用同尾酶连接法对合成的基因工程蜘蛛丝基因单体序列进行串联拼接,获得多倍串联体克隆重组子,将鉴定正确的多倍串联体克隆重组子与原核表达载体pET28a（＋）连接,转化至大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导其表达,表达产物通过SDS-PAGE和Western印迹进行鉴定。在此基础上对工程菌进行高密度发酵,所获蛋白通过硫酸铵分级分离方法进行纯化。结果与结论成功构建了基因工程蜘蛛丝MaSp1多串联体的表达载体,原核表达蛋白的相对分子质量与预期一致,且纯化的目的蛋白纯度达80%以上。上述研究工作为开展基因工程蜘蛛丝蛋白的规模化制备建立了关键技术方法,并为后续基因工程蜘蛛丝的人工纺丝提供必要的前提和工作基础。     

促血管生成素-2在胃肠道恶性肿瘤检测中的应用

目的：探讨血．清中促血管生成素-2（angiopoietin-2,Ang-2）在胃肠道恶性肿瘤检测中的意义。方法：应用ELISA法检测56例临床已诊断为胃肠道恶性肿瘤的实验组和12例健康对照血清中Ang-2的含量。SPSS 11.0统计软件行数据统计分析。结果：胃肠道恶性肿瘤患抒肌清中Ang-2表达水平显著高于正常对照组（P〈0．05）,胃癌与肠道恶性肿瘤患者血清中Ang-2表达水平无显著筹异（P〉0．05）。结论：血清Ang-2含量在胃肠道恶性肿瘤检测中具有一定应用价值。     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

人α-磷酸丙酮酸水合酶原核表达载体的构建及蛋白纯化

目的 构建带PET-28a标签的人ENO1基因原核表达产物,观察其表达并纯化出带PET-28a标签的ENO1融合蛋白,为研究肿瘤糖酵解的相关机制奠定实验基础.方法 以人乳腺文库为模板,利用PCR技术扩增出ENO1基因编码片段,将其插入到PET-28a载体中,鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌Rossate,小量诱导表达后,利用PET-28a-琼脂糖凝胶4B亲和珠纯化PET-28a-ENO1融合蛋白,经SDS-PAGE电泳和Western印迹检测,获得纯度较好的PET-28a-ENO1蛋白.结果 利用PCR技术从乳腺文库中扩增得到大小约1300 bp的目的基因片段,插入PET-28a载体中,经双酶切鉴定及测序,结果表明PET-28a-ENO1质粒构建成功;转化Rossate菌并小量诱导,表达鉴定成功后纯化得到相对分子质量(Mr)约为57×103的目的蛋白.结论 成功获得了人糖酵解相关基因ENO1的原核表达产物,为进一步研究ENO1在糖酵解过程中的作用机制奠定基础.     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达

目的克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因,构建其原核表达载体并鉴定其表达。方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因;采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒,并经酶切和序列测定后,获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中,以构建pET28b-OprH重组表达质粒,并在表达宿主菌E.Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功:重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物,为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。     

人载脂蛋白A～Ⅰ的基因克隆﹑原核表达及多克隆抗体的制备

目的获取人载脂蛋白A～Ⅰ(ApoA～Ⅰ)的重组蛋白,并用于多克隆抗体的制备。方法从人肝细胞(LO2)中提取总RNA后,经RT～PCR法得到人ApoA～Ⅰ基因片段,用以构建融合表达载体pGEX～6P～1～ApoA～Ⅰ的重组质粒;将该重组质粒转化至大肠埃希菌BL21中,用异丙基硫代～β～D～半乳糖苷(IPTG)诱导表达GST～ApoA～Ⅰ包涵体蛋白,通过蛋白复性和纯化后免疫小鼠得到多克隆抗体,并用ELISA法检查其效价。结果经PCR扩增出的ApoA～Ⅰ基因片段(746bp)与理论值大小基本一致。SDS～PAGE(十二烷基磺酸钠～聚丙烯凝胶电泳)以及West-ern blotting(蛋白印迹分析)验证纯化后的蛋白质分子量与质谱分析数据相符。免疫小鼠所得的免疫血清通过ELISA显示其抗体效价也具有高度特异性。结论成功地在大肠埃希菌中诱导表达出了ApoA～Ⅰ,蛋白质通过纯化免疫小鼠,得到了特异性的多克隆抗体。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活基因1的原核表达及多克隆抗体制备

目的构建丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的反式激活蛋白1(NS5ATP1)基因的原核表达载体并诱导其表达,纯化表达的融合蛋白并制备多克隆抗体。方法从pGBKT7-NS5ATP1质粒上切取NS5ATP1基因,克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP1表达载体,IPTG诱导融合蛋白表达。亲和镍柱层析纯化该融合蛋白后,免疫新西兰兔,获得多克隆抗体,ELISA法检测多抗效价。结果以pET32a( )-NS5ATP1表达载体分别转化DH5α、BL21菌后,经IPTG诱导,成功获得分子量为56kD左右的重组蛋白。SDS-PAGE分析显示,IPTG诱导4.5h时重组蛋白的表达量最高。Western blot证实其具有良好的抗原性。用该蛋白成功免疫新西兰白兔,获得了该蛋白的多克隆抗体,ELISA检测其效价>1∶512000。结论成功构建原核表达载体pET32a( )-NS5ATP1,表达纯化NS5ATP1融合蛋白并制备了该蛋白的多克隆抗体,为进一步的研究奠定了基础。     

人斯钙素1在大肠杆菌中的重组表达与活性鉴定

目的：通过原核表达的方法得到有活性的斯钙素1（ STC1）重组蛋白。方法将优化合成的STC1 DNA片段克隆到表达载体pET-32 b（＋）上,重组质粒转入大肠杆菌诱导表达,在变性条件下纯化包涵体,经透析复性得到可溶的斯钙素1融合蛋白,凝血酶酶切后用高亲和镍离子树脂吸附多余多肽获得目的蛋白。 Western印迹分析验证目的蛋白免疫活性。动物实验检测目的蛋白的生物学活性。结果构建了pET-32b（＋）-STC1表达载体,表达并纯化了STC1融合蛋白包涵体,经复性、凝血酶切和纯化后获得可溶的目的蛋白。 Western印迹分析验证正确。生物学活性检测表明重组STC1能增加大鼠排泄系统对磷酸盐的重吸收。结论获得了具有生物学活性的斯钙素1重组蛋白,为制备STC1单克隆抗体和进一步研究STC1与肿瘤治疗的关系奠定了基础。     

肠出血性大肠杆菌O157∶H7毒力蛋白NleB1的表达、纯化及多克隆抗体的制备与鉴定

目的：构建肠出血性大肠杆菌（ EHEC） O157∶H7毒力蛋白nleB1基因的原核表达载体,诱导表达重组蛋白,制备NleB1的抗血清。方法从EHEC O157∶H7 EDL933株的全基因组中PCR扩增出编码nleB1的990个碱基序列,构建原核表达载体pET24a-nleB1,将构建的重组表达载体的质粒pET24a-nleB1转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,利用异丙硫半乳糖苷（IPTG）诱导融合蛋白His-NleB1表达,并利用镍柱进行亲和层析纯化和切胶纯化,以纯化后的融合蛋白His-NleB1为抗原免疫BALB/c小鼠,获得抗血清。 Western印迹和ELISA法鉴定获得的抗血清。结果成功构建了pET24a-nleB1原核表达载体,纯化得到融合蛋白His-NleB1,进而免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,Western印迹和ELISA法证实多克隆抗体制备成功。结论成功获得了EHEC O157∶H7的毒力蛋白NleB1的多克隆抗体,为研究EHEC O157∶H7毒力蛋白NleB1的功能奠定了基础。     

IL-1Ra和IL-10真核表达质粒载体的构建及其表达检测

目的:构建人IL-1Ra和人IL-10真核表达质粒载体并检测其表达。方法:用双酶切方法切取PCDI-IL-1Ra和PCDI-IL-10质粒中包含人IL-1Ra和人IL-10 CDS全长序列的cD-NA片段,并分别连接到真核表达质粒pcDNA3.1上,然后用壳聚糖转染上述质粒到原代软骨细胞,RT-PCR检测其mRNA水平的表达。结果:成功将人IL-1Ra和IL-10 CDS全长序列的cDNA片段克隆到真核表达载体,mRNA水平检测到目的基因的表达明显提高。结论:真核表达质粒可以用于外源基因的原代软骨细胞导入和表达,为进一步的基因治疗研究提供依据。