高通量测序分析人诱导性多能干细胞分化为神经干细胞后microRNAs的表达变化

目的 筛选出人诱导性多能干细胞(hiPSCs)分化为神经干细胞(NSCs)后差异表达的microRNAs,为采用microRNAs调节hiPSCs诱导分化为NSCs的实验研究提供依据.方法 采用添加TGF-β信号通路抑制剂的单层贴壁培养法,将hiPSCs向NSCs进行为期7 d的诱导分化,收集并提取未分化的hiPSCs及诱导第7天的hiPSCs源性NSCs的总RNA,进行microRNAs高通量测序,生物信息学分析法筛选出hiPSCs分化为hNSCs后差异表达的mi-croRNAs,qPCR验证microRNAs的差异表达结果.结果 经过为期7 d的神经方向诱导,hiPSCs能高比例的转化为巢蛋白Nestin阳性、底板细胞Foxa2阳性及PAX6阳性的神经干细胞,经microRNAs高通量测序差异表达分析发现:hiPSCs分化为NSCs后具有统计学差异表达的microRNAs有429个(P<0.05),具有显著差异表达的microRNAs有343个,其中表达上调的microRNAs有186个,下调的157个.与调节hiPSCs向NSCs分化的关键信号通路TGF-β进行相关性分析发现miR-1247-3P、miR-34b-5p及miR-210-5p等20余个差异表达的microRNAs.结论 抑制TGF-β信号通路可以促进hiPSCs向Nestin阳性的NSCs的诱导分化,分化后的NSCs的microRNAs表达谱较hiPSCs有明显差异,提示有望通过调节与TGF-β信号通路相关的microRNAs的表达促进hiPSCs向NSCs的诱导分化.     

MiR-125a-5p靶向APC激活经典WNT信号通路促进hiPSCs分化为多巴胺能神经前体细胞

目的通过调节miR-125a-5p的表达实现人诱导性多能干细胞(hiPSCs)向多巴胺(DA)能神经前体细胞及DA能神经元的高效转化。方法应用MicroRNAs高通量测序与分析,miR-125a-5p的筛选、靶基因(APC)的预测与验证;miR-125a-5p前体miR-125a慢病毒载体的构建与包装,miR-125a-5p过表达hiPSCs细胞株的构建、筛选及其向多DA能神经前体细胞与DA能神经元的诱导分化;免疫细胞化学、实时定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印迹(WB)法检测miR-125a-5p过表达hiPSCs与对照hiPSCs向DA能神经前体细胞及DA能神经元诱导分化过程中神经前体细胞标志物Nestin、底板细胞标志物Foxa2、DA能神经前体细胞标志物En1、DA能神经前体细胞分选标志物Corin、神经元标志物Tuj1及DA能神经元标志物TH的表达。结果 MiR-125a-5p在hiPSCs向DA能神经前体细胞及神经元诱导分化过程中的表达呈递增趋势,miR-125a-5p靶向调节经典WNT信号通路关键因子APC,稳定过表达miR-125a-5p的hiPSCs细胞株能向DA能神经前体细胞及DA能神经元分化,其诱导分化效率与对照hiPSCs相比在神经前体细胞(NPCs)阶段FOXA2、EN1、CORIN的表达明显增高,神经元阶段TH、DAT和Nurr1的表达明显增高,提示过表达miR-125a-5p的hiPSCs具有更好的向DA能神经前体细胞及DA能神经元的诱导分化潜能。结论 MiR-125a-5p能通过靶向下调APC的表达激活经典WNT信号通路活性,促进hiPSCs向DA能神经前体细胞及DA能神经元的诱导分化。     

定向诱导人尿液细胞源性多能干细胞向多巴胺能神经元的分化

目的探讨定向诱导人尿液来源诱导性多能干细胞(U-iPS)向多巴胺(DA)能神经元分化。方法单层贴壁法体外培养U-iPS,通过时向性添加TGF-β及BMP信号通路抑制剂,SHH细胞因子,GSK3β抑制剂Chir99021将U-iPS诱导为DA能神经前体细胞(NPCs),通过添加BDNF/GDNF等细胞因子将其进一步分化为DA能神经元。在诱导分化的4个时间点(第0天、7天、14天及25天)采用RT-qPCR和免疫荧光检测多能干细胞标志物Oct4与Nanog的表达;NPCs标志物Nestin、Pax6和Foxa2的表达;DA神经前体细胞标志物Lmx1a和En1的表达;神经元标志物Tuj1的表达以及DA能神经元标志物TH的表达情况。以人皮肤成纤维细胞来源的iPS(F-iPS)向DA能神经元的诱导分化作为对照进行分化效率的比较。结果 U-iPS在第0天表达多能干标志物Oct4和Nanog;诱导第7天能转化为Nestin、Pax6及Foxa2阳性的NPCs;第14天转化为Lmx1a和En1阳性的DA能神经前体细胞;第25天分化得到的神经元样细胞表达神经元标志物Tuj1,其中部分细胞表达DA能神经元标志物TH。各时间点神经类细胞标志物的表达与F-iPS诱导分化得到的神经类细胞标志物的表达差异无统计学意义(P0.05)。结论 U-iPS细胞具有向DA能神经元分化的潜力,能在体外经过诱导分化得到TH阳性的DA能神经元,且与F-iPS向DA能神经元分化的效率无明显差异。     

白藜芦醇对NIH3T3细胞Shh信号通路的影响

目的探讨白藜芦醇对NIH3T3细胞Shh信号通路的影响。方法实验分为对照组和白藜芦醇组。白藜芦醇处理NIH3T3细胞24 h。CCK-8法测定细胞活力,免疫荧光法检测初级纤毛蛋白(Ac-tu)、Smo和Gli-1的表达,Western blotting法检测Shh、Ptc、Smo、Gli-1蛋白的表达。结果 1.0.5和1μmol/L白藜芦醇组(0.679±0.047,0.774±0.054)细胞活力分别较对照组(0.585±0.039)明显增强(P<0.05),其中以1μmol/L白藜芦醇组最强。之后随白藜芦醇浓度(10、20、40、80μmol/L)的增高,细胞活力逐渐降低(0.428±0.043,0.395±0.031,0.373±0.017,0.361±0.016),且均较对照组明显减弱(P<0.05),而0.1μmol/L(0.602±0.065)和5μmol/L组(0.556±0.041)细胞活力与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。2.NIH3T3细胞表达Ac-tu、Shh、Ptc-1、Smo、Gli-1从蛋白,有1根初级纤毛,Smo和Gli-1蛋白位于细胞质。白藜芦醇处理24 h时,Gli-1从细胞质进入细胞核,Smo从细胞质进入初级纤毛,且Shh(0.756±0.659比0.441±0.769,P<0.05)、Ptc-1(0.655±0.347比0.351±0.026,P<0.05)、Smo(0.779±0.064比0.451±0.035,P<0.05)和Gli-1(0.856±0.044比0.560±0.058,P<0.05)蛋白表达较对照组高。结论白藜芦醇可能通过激活Shh信号通路增强NIH3T3细胞的活力。     

酰基缩肽1经SHH通路下调Gli和Bcl-2表达诱导肾癌细胞凋亡

目的探讨酰基缩肽1(ADEP1)对肾癌细胞凋亡及SHH信号通路相关蛋白Gli-1和Bcl-2表达的影响。方法 50μmol/L ADEP1处理肾癌ACHN细胞和769-P细胞48 h,采用光学显微镜观察细胞凋亡的细胞形态学和细胞核形态变化,MTT法检测细胞增殖,实时定量PCR(qRT-PCR)检测SHH信号通路SHH和Gli-1 mRNA的表达,Western blot法检测Gli-1和Bcl-2蛋白的表达。结果 ADEP1可诱导肾癌细胞发生凋亡,降低SHH和Gli-1 mRNA表达,以及Gli-1和Bcl-2蛋白的表达。结论ADEP1可通过抑制SHH信号通路相关蛋白表达,诱导肾癌细胞发生凋亡。     

低氧促进P19细胞向多巴胺能神经元分化

目的观察低氧对P19细胞神经分化的影响,针对其向多巴胺能神经元分化的现象及机制进行探讨。方法实验分为常氧组(20%O2)和低氧组(3%O2,每天低氧10 m in)。对诱导分化的神经元采用免疫细胞化学染色方法鉴定。用流式细胞术及W estern b lot检测多巴胺能神经元,高效液相色谱法测定分泌的多巴胺。用RT-PCR技术检测低氧诱导因子HIF-1αmRNA水平。结果①在分化的P19细胞中,低氧组神经元含量高于常氧组(P<0.05),低氧组多巴胺能神经元含量及所分泌的多巴胺显著高于常氧组(P<0.001);②低氧组诱导期HIF-1αmRNA表达水平明显高于常氧组。结论低氧可以促进P19细胞的神经分化,尤其促进P19细胞向多巴胺能神经元分化,HIF-1α可能在其中起了一定作用。     

SHH修饰聚多巴胺涂层纤维蛋白支架对大鼠神经干细胞的影响

目的:构建音猬因子(SHH)修饰的聚多巴胺(PD)涂层纤维蛋白胶(FG),并探究该支架对大鼠神经干细胞(NSCs)的生长及分化的影响。方法:按FG材料表面涂层情况,将实验分为3组:FG表面未处理组(control)、FG表面进行多巴胺涂层组(PD)和FG经多巴胺处理后表面涂有SHH组(PD-SHH)。采用扫描电子显微镜分别观察支架微观结构,用ELISA测量PD-SHH组SHH。分离并培养大鼠神经干细胞,并将神经干细胞分别与该3种支架复合培养,免疫荧光及Western Blot检测各组细胞中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、生长再生相关蛋白(GAP43)和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。结果:ELISA结果显示PD-SHH缓释支架可以持续释放SHH达到19 d;扫描电子显微镜可见纤维蛋白胶经冷冻干燥后呈海绵型网状结构,多巴胺及SHH微粒粘附在网状结构上;免疫荧光及Western Blot结果显示:PD-SHH组细胞高表达GAP43和MBP等神经细胞相关蛋白而低表达GFAP(P<0.05)。结论:制备的聚多巴胺涂层纤维蛋白支架具有良好的SHH缓释效果,该复合支架对大鼠NSCs分化有明显的促进作用。     

基质胶对人诱导多能干细胞与聚己内酯共培养形成细胞补片的影响

目的:通过将覆有基质胶的聚己内酯(PCL)与人诱导多能干细胞(hiPSCs)体外共培养,在组成和结构上模拟天然细胞外基质,探讨基质胶对hiPSCs在聚己内酯上黏附及增殖的影响。方法:复苏、培养hiPSCs后,分别将hiPSCs接种到覆有基质胶的传统培养皿组、PCL组和覆有基质胶的PCL组上。24 h后在荧光显微镜下通过4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光观察细胞生长情况,并通过hiPSCs干性标志物(OCT4)荧光进行hiPSCs干性鉴定,固定后进行电镜扫描观察细胞补片表面形态,培养的第1、3、5天通过CCK-8法测定细胞活力,并通过生长曲线观察细胞生长增殖情况。结果:OCT4荧光显示3组均发出绿色荧光,细胞补片形成后hiPSCs保持干性。DAPI荧光显示3组hiPSCs发出蓝色荧光,细胞呈克隆生长,细胞形态均一。扫描电镜显示hiPSCs在覆有基质胶的PCL上黏附生长,细胞轮廓清晰可见,形态正常。覆有基质胶的PCL组在共培养的第1天和第3天细胞活力大于PCL组(1.905±0.080比1.657±0.027 ,2.375±0.096比2.054±0.078,均 P<0.05),覆有基质胶的PCL组与PCL组在共培养的第5天相比差异无统计学意义,PCL组和覆有基质胶的PCL组第1、3、5天细胞活力均大于覆有基质胶的传统培养皿组,生长曲线结果表明覆有基质胶的PCL组细胞活力第3天已达平台期,和第5天差异并无统计学意义,与PCL组第5天的吸光度 A值接近,而PCL组细胞活力第5天高于第3天( P<0.05),表明覆有基质胶的PCL组细胞增殖速度最快。 结论:hiPSCs可以与PCL或覆有基质胶的PCL体外共培养制成细胞补片;覆有基质胶的PCL能提供更好的细胞生长、黏附和增殖环境;基质胶对人诱导多能干细胞与聚己内酯共培养形成细胞补片有明显促进作用。     

音猬因子对神经干细胞增殖与分化的影响

目的 探讨音猬因子(SHH)对神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响. 方法从大鼠胚胎端脑皮质及海马分离培养的NSCs分为SHH组、RA组和PBS组.分别用SHH、维甲酸(RA)及PBS条件培养液处理后,通过免疫细胞化学等方法检测NSCs的增殖及分化情况.结果体外培养的NSCs能快速增殖并形成神经球,其中的细胞均表达NSCs特异性标志物nestin.BrdU作用于NSCs 3 h后,SHH组的BrdU阳性率明显高于RA组和PBS组,而RA组和PBS组之间无显著差异.当NSCs在分化条件培养液中培养7d后,SHH组和RA组中的βⅢ-tubulin阳性率及Rip阳性率显著高于PBS组,SHH组又显著高于RA组和PBS组.结论 SHH可以促进NSCs增殖及其向神经元和少突胶质细胞的分化.     

Galectin-9调控SHH信号通路影响结直肠癌HT29细胞凋亡

目的:探讨半乳糖凝集素9(galectin-9)对结直肠癌细胞凋亡的影响及机制。方法:在结直肠癌细胞系HT29中分别转染galectin-9过表达载体pcDNA3.1-Galectin-9和对照载体pcDNA3.1,用real-time PCR和Western blot检测过表达效果。Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡变化,Western blot测定细胞中活化的caspase-3水平,以及SHH信号通路蛋白Smo、Gli1和SHH的表达变化。用SHH信号通路特异性抑制剂cyclopamine处理上调galectin-9表达的结直肠癌细胞,用上述方法检测细胞凋亡、细胞中活化的caspase-3水平,以及SHH信号通路蛋白Smo、Gli1和SHH的表达变化。结果:pcDNA3.1-Galectin-9可显著上调结直肠癌HT29细胞中galectin-9的mRNA和蛋白水平。上调galectin-9表达后的结直肠癌HT29细胞凋亡率升高,细胞中活化的caspase-3蛋白水平升高,同时细胞中SHH信号通路蛋白Smo、Gli1和SHH的表达水平降低(P0.05)。Cyclopamine处理可以进一步诱导上调galectin-9表达的结直肠癌HT29细胞凋亡,促进细胞中活化的caspase-3蛋白水平上调,降低细胞中SHH信号通路的激活水平(P0.05)。结论:Galectin-9通过抑制SHH信号通路诱导结直肠癌HT29细胞凋亡。     

干细胞：许旺细胞的新来源****△

背景：许旺细胞对神经系统损伤的修复与再生有着重要作用。然而,许旺细胞不易直接获取,使其在临床上的应用受到限制。 目的：综述神经损伤及修复过程、许旺细胞的作用以及各种干细胞分化为许旺细胞的潜能。 方法：使用计算机检索Pubmed数据库2000/2011有关许旺细胞参与神经损伤的修复、干细胞分化为许旺细胞验证及应用的文献,检索词为“Schwann cells,nervous system,stem cells”。排除重复性研究,对资料进行初审,并查看每篇文献及其引文。根据纳入标准,收集到29篇相关文献。 结果与结论：许旺细胞通过分泌各种细胞因子和营养因子为受损的神经营造了适于修复与再生的微环境,从而促进轴突再生;同时通过增殖及分化等机制围绕新生轴突形成髓鞘。神经修复需要大量许旺细胞的参与,而许旺细胞不易直接获取。研究表明,各种干细胞,包括胚胎干细胞、间充质干细胞、神经嵴干细胞和嗅鞘细胞,能在一定诱导条件下分化为许旺细胞样细胞,为神经系统损伤的治疗带来了新的希望。其中,间充质干细胞的研究备受关注。 关键词：许旺细胞;神经系统;再生;修复;干细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.10.040     

Isolation of germ cells from leukemic cells

Sir, We have read with great interest the article by Geens et al.(2007), titled ‘The efficiency of magnetic-activated cellsorting and fluorescence-activated cell sorting in the decontaminationof testicular cell suspensions in cancer patients' publishedon Hum Reprod. The authors concluded that fluorescence-activated cell sorting(FACS) was neither in a murine nor in a human model sufficientto completely deplete testicular tissue of malignant cells.Specifically, in the human model only     

抗原致敏DC与CIK共培养体外抗肾癌效应的研究

目的： 探讨肾癌(RCC)抗原致敏树突状细胞(DC)与同源细胞因子诱导杀伤细胞(CIK)共培养后的DC-CIK细胞对RCC的杀伤活性。 方法： 将健康成人外周血单个核细胞（PBMC）来源的DC经RCC(786-0细胞株)抗原致敏后与同源CIK细胞共培养，实验分3组：RCC抗原致敏DC与CIK共培养组（A组），未致敏DC与CIK共培养组（B组），单纯CIK组（C组）。流式细胞仪检测DC及CIK免疫表型。MTT法检测3组效应细胞对786-0细胞杀伤活性。 结果： 效靶比 20∶1 时，A、B、C组对786-0细胞杀伤活性分别为（70.64±8.26）%、（53.40±7.33）%、（46.64±6.01）%，各组比较差异显著（P<0.05）；以前列腺癌PC3细胞作靶细胞对照，A组对786-0及PC3细胞的杀伤活性有显著差异（P<0.05）。 结论： RCC抗原致敏DC与CIK共培养后的DC-CIK细胞可明显提高CIK细胞对RCC的杀伤特异性和杀伤活性。     

肝血窦壁细胞的研究进展

肝窦壁细胞是肝脏的非实质细胞 ,对于肝脏的生理和病理都具有非常重要的作用。本文就肝窦壁细胞的形态、功能及其与肝脏的病理生理的关系进行了简要的概述 ,并就肝窦壁细胞的研究进展作一综述 ,以期为这方面的研究提供一些线索     

体外诱导脂肪干细胞向内皮细胞及成血管的分化

背景：脂肪干细胞作为组织工程中种子细胞的选择,可以诱导为内皮细胞从而有效解决材料血管化困难的难题。 目的：体外观察脂肪干细胞经诱导向内皮细胞转分化的可能性、以及在立体培养基上的血管形成情况。 方法：切取人皮下脂肪,用酶消化法分离和培养脂肪干细胞,将传至第3代或第4代的脂肪干细胞用内皮细胞诱导液、同时在Matrigel三维培养基内诱导培养,观察细胞生长情况及变化。对脂肪干细胞和诱导细胞行免疫组织化学检查CD31的表达。 结果与结论：免疫组织化学检测脂肪干细胞的CD31表达阴性,诱导细胞CD31可见阳性表达。在三维立体培养基内诱导的细胞24 h逐渐迁徙成团,伸出伪足,诱导1周细胞形成网格样交叉,2周形成较长血管,后血管增粗,并出现分叉,CD31阳性表达。因此,脂肪干细胞体外可以被诱导向内皮细胞表型转分化,并形成血管,提示脂肪干细胞可以作为促进组织工程移植物血管化的种子细胞的理想选择。     

The identification of gastrin cells as G cells

Summary In the pyloric antrum of dog and pig it is possible to show, by direct re-staining of formaldehyde-fixed sections after localization of the gastrin cells by immunofluorescence, that these cells are identical with the argyrophilic, lead haematoxylin-positive G cells.Reports to the contrary must be ascribed to the use of inadequate or erroneous techniques.On leave from the Istituto di Anatomia e Istologia Patologica, University of Turin, supported by a Fellowship from the Accademia Nazionale dei Lincei.     

Recognition of infected cells by natural killer cells

Under the influence of cytokines associated with innate immunity, natural killer (NK) cells rapidly become activated and migrate to sites of infection. Upon contact with infected parenchyma they proliferate, release cytokines and/or kill cells harboring pathogens. Multiple stimulatory and inhibitory receptors can provide the integrated signals that trigger this contact-mediated NK-cell function. Recent work has begun to define the ligands for these receptors in the context of infection by certain well-studied viruses. These results, in addition to future work involving other pathogens, will provide an understanding of the molecules present on parasitized cells that mark them as targets of innate immunity.     

The relationship of antibody-forming cells to rosette-forming cells

Rosette-forming cells (RFC) increased in numbers in the spleens of mice following injection of sheep red blood cells (SRBC). Very sensitive assay system for detecting plaque-forming cells (PFC) showed that RFC and PFC were present in approximately equal numbers at the height of the immune response. Thereafter PFC numbers declined much more rapidly than RFC.

Two techniques were used to study the contribution of PFC to RFCs (a) velocity sedimentation through foetal calf serum gradients and (b) transfer of individual RFC by micromanipulator into the PFC assay gel containing complement and rabbit antimouse IgG antiserum to identify what proportion of RFC were secreting antibody.

It was shown that, when rosettes were prepared at 4°, <10 per cent were formed by PFC at 4 days after immunization, and <2 per cent at 6 days. Rosettes prepared at 37° contained up to 16 per cent PFC.

It was concluded that PFC had either no cell bound antigen-binding receptors or that the receptors were not demonstrable at 4° by the particular rosette preparation used in the study.

Rosettes prepared late in the immune response were more resistant to mechanical agitation than those prepared early in the response.

     

胚胎干细胞诱导发育为树突状细胞的研究

目的：探讨胚胎干细胞（ESC）诱导分化为树突状细胞（DC）的实验方法，实现体外大规模扩增高纯度DC用于临床免疫治疗。方法：E14小鼠胚胎干细胞系在GM-CSF与IL-3联合作用下经胚胎体（EB）诱导分化为DC。不成熟DC （im-DC）流式细胞仪检测CD11c、CD80、CD86、MHC II-DR表达。用磷酸脂多糖（LPS）促进DC的成熟，收获细胞后观察细胞形态及摄片并做扫描电镜检查，分析细胞表型并与不成熟DC细胞表型做对比，异体淋巴细胞增殖实验行功能检测。结果：ES细胞来源DC呈典型DC形态学表现。im-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II表达低,m-DC CD11c、CD80、CD86、MHC-II的表达均较前明显升高。功能检测发现，ES细胞来源的DC具有强烈的激发同种异体淋巴细胞增殖的作用，证实ES细胞来源的DC具备正常的免疫学功能。结论：使用GM-CSF联合IL-3能成功诱导E14胚胎干细胞发育为DC。故ES细胞可作为DC来源的一条新途径，对于体外大规模制备DC用于免疫过继治疗提供了一个较好的方法。