多重巢式聚合酶链反应在β地中海贫血植入前遗传学诊断中的应用

目的探讨应用多重巢式聚合酶链反应(PCR)技术在β地中海贫血(简称β地贫)植入前遗传学诊断(PGD)中的应用。方法获取β地贫基因携带者单个淋巴细胞,建立了稳定的单细胞多重巢式PCR检测技术,可同时检测β珠蛋白基因及与β珠蛋白基因紧密连锁的HumTH01基因,并对4例已出生的重型β地贫患儿及双方均为β地贫基因携带者的夫妇应用多重巢式PCR进行了β地贫的PGD。结果利用单细胞多重巢式PCR,可以同时检测中国人常见的16种β地贫突变类型,单个淋巴细胞平均扩增效率为91．3％,平均等位基因脱扣(ADO)率为17．0％。对4对夫妇进行4个周期PGD,共活检33个胚胎,获得33个卵裂球,其中30个卵裂球扩增成功,扩增效率为90．9％,ADO率为13．3％。26个胚胎经PCR分析后获得明确诊断,移植了8个胚胎,获得1例临床妊娠。孕17周时经脐带血穿刺,证实为完全正常胚胎,现已出生1名正常女婴。结论应用单细胞多重巢式PCR技术可对β地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生目的。     

TaqMan-MGB探针实时荧光PCR在β地中海贫血植入前诊断中的应用研究

目的建立单细胞MGB探针荧光PCR检测β地贫的方法以及在β地贫PGD中的应用研究。方法获取β地贫基因携带者单个淋巴细胞,建立稳定的单细胞MGB探针荧光PCR检测技术,并对2例双方均为β地贫基因携带者的夫妇应用MGB探针荧光PCR进行了β地贫的PGD。结果利用单细胞MGB探针荧光PCR检测了β地贫基因携带者的200个单个淋巴细胞的基因型,平均扩增效率为94%,平均等位基因脱扣(ADO)率为2.5%。对两对夫妇进行4个周期PGD,共活检16个胚胎,获得16个卵裂球,其中15个卵裂球扩增成功,扩增效率为93.8%,ADO率为6.2%。14个胚胎经PCR分析后获得明确诊断,移植了4个胚胎,获得1例临床妊娠。孕11周时经腹吸取绒毛,证实为完全正常胚胎,最终分娩了一正常女婴。结论应用单细胞MGB探针荧光PCR技术可对β地贫以及其它单基因遗传病进行植入前遗传学诊断,达到优生目的。     

应用荧光聚合酶链反应对α地中海贫血进行植入前遗传学诊断

目的探讨应用跨越断裂点荧光聚合酶链反应（PCR）技术在α地中海贫血（简称α地贫）植入前遗传学诊断（PGD）中的应用。方法获取Ot地贫东南亚缺失型携带者单个淋巴细胞,建立了稳定的单细胞跨越断裂点荧光PCR检测技术,并对4对夫妇双方均为α地贫——SEA缺失型杂合子应用荧光PCR进行了α地贫的PGD。结果单个淋巴细胞平均扩增效率为90．0％（72／80）,平均等位基因脱扣（ADO）率为8．3％（6／72）。对4对夫妇进行4个周期PGO,共检测38个胚胎,获得38个卵裂球,其中34个卵裂球扩增成功,扩增效率为89．5％（34／38）,ADO率为5．9％（2／34）。经PCR分析,共获得11个正常胚胎,8个杂合子胚胎,15个重型地贫胚胎。移植了11个胚胎,获得2例临床妊娠。孕17周时经脐带血穿刺,分别证实为完全正常胚胎和杂合子胚胎,现已出生两名健康男婴。结论应用单细胞荧光PCR技术可对α地贫进行植入前遗传学诊断,达到优生的目的。     

运用单细胞聚合酶链式反应进行植入前诊断的性别鉴定

目的：建立一种高效、快速、可靠的植入前诊断的性别鉴定方法。方法：取成人外血血单个淋巴细胞和人胚胎单卵裂球，采用多重荧光PCR和多重巢式PCR同时扩增性别识别位点Amelogenin和5号染色体上的基因IL－3。结果：男性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为72％，巢式PCR扩增效率为64.7%；女性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为76％，巢式PCR扩增效率为65％，两者与供体外周血gDNA扩增结果的一致性均达100％。单卵裂球荧光PCR扩增效率为86.9%，巢式PCR扩增效率为85.7%，来源于同一胚胎的不同单卵裂球扩增结果的一致性达100%。巢式PCR与荧光PCR的扩增效率比较无显著性差异（P＞0.05）。结论：巢式PCR和荧光PCR各有优劣。但荧光PCR操作简便、耗时短、灵敏度高，为今后的发展方向。     

运用单细胞聚合酶链式反应进行植入前诊断的性别鉴定

目的 :建立一种高效、快速、可靠的植入前诊断的性别鉴定方法。方法 :取成人外周血单个淋巴细胞和人胚胎单卵裂球 ,采用多重荧光PCR和多重巢式PCR同时扩增性别识别位点Amelogenin和 5号染色体上的基因IL 3。结果 :男性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为 72 % ,巢式PCR扩增效率为 6 4 .7% ;女性单个淋巴细胞荧光PCR扩增效率为 76 % ,巢式PCR扩增效率为 6 5 % ,两者与供体外周血gDNA扩增结果的一致性均达 10 0 %。单卵裂球荧光PCR扩增效率为 86 .9% ,巢式PCR扩增效率为 85 .7% ,来源于同一胚胎的不同单卵裂球扩增结果的一致性达 10 0 %。巢式PCR与荧光PCR的扩增效率比较无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :巢式PCR和荧光PCR各有优劣 ,但荧光PCR操作简便 ,耗时短、灵敏度高 ,为今后的发展方向     

染色体和遗传

应用巢式PCR对单细胞进行性别诊断的初步研究/焦泽旭…//中华医学遗传学杂志一2003,20(1).一币4一65 目的:应用巢式PCR技术对人类植人前胚胎进行性别诊断。方法:收集单个或两个淋巴细胞和卵裂球(50个/组),按不同的方法处理单细胞(纯水法、冻融法、碱法),而后行巢式PCR扩增牙釉质基因。结果:纯水法、冻融法、碱法处理后,扩增率分别为83%、94%、95%。后两种处理方法的扩增效率明显高于纯水法(P<0.01),通过检测正常男性单淋巴细胞基因型发现3种方法等位基因脱失率分别为24%、12%、4%,差异有显著性(P<0.05)。两个淋巴细胞或卵裂球的扩增率…     

单细胞扩增前引物延伸多基因位点检测研究

目的：考察单细胞扩增前引物延伸（PEP）全基因组扩增，后续巢式PCR同步检测β地中海贫血突变基因CD17、nt-28及连锁基因（ATTTT）、18和21号染色体短串联重复序列D18S51、D21S11和D21S1411、囊性纤维病CF△F508及连锁基因（GATT）、杜氏肌营养不良症DMD基因外显子17种48以及Y染色体性别决定基因SRY的可行性。方法：显微操作获取单个淋巴细胞和胚胎细胞，PEP全基因组扩增，后续特异性巢式PCR，检测上述10个基因位点的单细胞扩增成功率、假阳性率、假阴性率。结果：上述10个位点的单个淋巴细胞扩增成功率、假阳性率和假阴性主分别为89．5％、0．48％和2．50％，单个胚胎细胞扩增成功率和假阳性率分别为85．56％和3．0％。结论：单细胞PEP后续巢式PCR同步检测上述10个基因位点有较高的扩增成功率和很低的假阳性率和假阴性率，具有应用于植入前遗传学诊断的实际可行性。     

单细胞水平β地中海贫血诊断膜芯片检测技术的探讨

目的 对在单细胞水平β地中海贫血诊断膜芯片检测技术进行探讨。方法 采用15个碱基的随机引物对单个细胞的基因组进行引物延伸预扩增(Primer extension preamplification,PEP)，取其产物5μl分别对β地中海贫血的目的基因片段进行巢式或半巢式扩增，然后来用反向斑点杂交(Reverse dot blot,RDB)技术检测β地贫突变型。结果 将这些技术应用于4例已经确定突变基因型的β地贫患者及1例正常女性，检测结果与预料的相符。结论 结合我们的实验结果，提示在单个细胞或微量DNA模板水平运用基因芯片技术进行遗传病检测是可行的，而且将来在胚胎植入前基因诊断和无创性产前诊断领域可能有一定的实用价值。     

激光捕获显微切割-单细胞PCR技术的应用研究

目的 建立一套优化的激光捕获显微切割-单细胞聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术,应用于分子组织学研究中单细胞基因的检测.方法 从淋巴结反应性增生冷冻组织切片中,应用激光捕获显微切割获取1-10个淋巴细胞,采用优化的单细胞PCR反应体系和条件进行β-珠蛋白基因检测.结果 单轮常规 PCR 各组多细胞的扩增阳性率比较无显著性差异(P>0.05),而单细胞的扩增阳性率低于各组多细胞,有显著性筹异(P<0.01);半巢式降落式PCR的单细胞扩增阳性率高于单轮常规PCR,有显著性差异(P<0.01).结论 联合应用优化的激光捕获显微切割及半巢式降落式PCR技术,显著提高了单细胞PCR的敏感性、特异性和稳定性.     

应用荧光PCR技术对单个体细胞进行多囊肾病的基因诊断

目的建立单细胞水平的荧光PCR技术,探讨该技术对临床开展着床前遗传学诊断的可行性。方法分离单个颊黏膜细胞,利用荧光PCR技术扩增微卫星D16S423位点,扩增产物在ABI3730上电泳,结果用Genemarker软件分析。结果单个颊黏膜细胞的PCR扩增成功率为93.3%,等位基因脱扣率为10.7%,诊断正确率为89.3%。结论利用单细胞荧光PCR技术进行着床前遗传学诊断是可行的。     

多重置换扩增结合短串联重复序列在植入前遗传学诊断中的应用

目的:探讨多重置换扩增(multiple displacement amplification,MDA)结合短串联重复序列多态性在植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis,PGD)中的应用。方法:采用多重置换扩增对单细胞进行全基因组扩增,针对单基因疾病和人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)配型选择位于致病基因内部或两侧的短串联重复序列位点进行单体型分析,同时对致病基因进行直接检测;针对染色体数量及结构异常或非整倍体筛查,选择位于相关染色体上的短串联重复序列位点进行等位基因数分析。结果:进行了以下5类12种类型植入前遗传学诊断的临床应用:(1)单基因疾病:脊髓性肌萎缩症、杜氏肌营养不良、X-连锁慢性肉芽肿、石骨症、骨软骨发育不全、X-连锁免疫缺陷综合征;(2)同时合并两种单基因疾病:α-和β-双重地中海贫血;(3)染色体罗氏易位;(4)单基因疾病结合HLA配型:β-地中海贫血、杜氏肌营养不良;(5)单基因疾病合并染色体异常:α-地中海贫血合并染色体罗氏易位、α-地中海贫血合并性染色体数目异常。对35个家系共进行了44个周期的PGD,共47个移植周期。MDA扩增成功率为96.4%(374/388),后续PCR扩增效率为97.1%,等位基因脱扣(allele drop out,ADO)率为12.6%(波动于0~47.5%),总体诊断效率为94.6%(367/388)。47个移植周期共移植91个胚胎,种植率为30.7%(28/91)。临床妊娠率为47.7%/PGD周期(21/44),共诞生了20个健康婴儿(12例单胎,4例双胎),5例继续妊娠。结论:采用多重置换扩增结合短串联重复序列多态性可建立一个通用的植入前遗传学诊断平台,其很大程度上缩短了新病种植入前遗传学诊断体系的研发时间,而且可同时进行两种或两种以上遗传学状态的诊断,也提高了诊断效率,有利于进一步拓宽植入前遗传学诊断的适应征。     

染色体和遗传

一地中海贫血病人或携带者的289个淋巴细胞和人体外受精一胚胎移植志愿者剩余的胚胎分离137个单细胞用荧光定量PCR方法进行分析。结果:用单个淋巴细胞诊断p一地中海贫血扩增效率达%%,准确率达99%一100%,等位基因丢失(ALK))率仅0一5%。单个胚胎细胞扩增效率86%。结论:荧光定量PCR技术是一种敏感、快速、可靠和准确的技术,适合包括日一地中海贫血在内的单基因疾病的种植前诊断。表1参6(原文摘要)040080第一极体形态学与人类卵细胞非整倍体相关关系的研究/陈雯…//现代妇产科进展一2003,12(5)一321一323 探讨第一极体的形态学和卵细胞染色…     

胚胎植入前遗传性疾病筛查的方法学研究

目的探索一种准确可行的胚胎植入前用性别检测方法来筛查X-连锁遗传性疾病.方法采用巢式PCR和引物延伸预扩增后续PCR检测单个淋巴细胞和单个胚胎细胞的性别决定基因(sex determining region on Y,SRY).结果两种方法在检测单个淋巴细胞和单个胚胎细胞的性别决定基因时都具有较高的特异性和敏感性,统计学分析无显著性差异.结论上述两种检测方法均可用于临床胚胎植入前遗传学诊断的性别检测.     

单细胞二重巢式PCR扩增影响因素初探

目的: 对影响单细胞二重巢式PCR扩增的因素进行初步探讨.方法:针对β-珠蛋白基因CD41-42、IVS-Ⅱ654突变位点区域采用二重巢式PCR,分别以不同的引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液、PCR反应前采用或不采用98 ℃预变性扩增单个淋巴细胞和/或单卵裂球,了解这些因素对PCR扩增效率的影响.结果: 不同的引物浓度组中,终浓度为0.25 μmol/L R1 F1引物对与 0.3 μmol/L R2 F2引物对配对扩增效率最高;不同的Taq DNA聚合酶中TaKaRa EX Taq的扩增效率最高;中和缓冲液-1(200 mmol/L Tricine)的扩增效率显著高于中和缓冲液-2(900 mmol/L Tris·HCl, pH 8.3/300 mmol/L KCl/200 mmol/L HCl)的扩增效率(P<0.05);单细胞PCR反应前采用98 ℃预变性与不采用98 ℃预变性的扩增效率间差异无统计学意义.结论:不同引物浓度组合、不同的Taq DNA聚合酶、不同的中和缓冲液对单细胞的二重巢式PCR的扩增效率存在明显差异,而PCR反应前采用98 ℃预变性不能提高PCR扩增效率.     

细胞裂解法对植入前诊断中聚合酶链反应扩增效率的影响

目的 :探讨优化细胞裂解条件 ,提高植入前诊断中聚合酶链反应的扩增效率。方法 :吸取单个淋巴细胞或人胚胎单卵裂球 ,用碱裂解液、蛋白酶K裂解液和改良的蛋白酶K裂解液进行处理 ,随后以巢式 -聚合酶链反应扩增人肾上腺脑白质营养不良基因 (ALD基因 )的 3号外显子 ,比较其扩增效率。结果 :三种裂解液组对人淋巴细胞的扩增效率分别为 90 % ,74 % ,87% ,对人单卵裂球的扩增效率分别为 98% ,77% ,96 %。结论 :在植入前诊断中 ,采用碱裂解液及改良的蛋白酶K裂解液优于蛋白酶K裂解液     

多重置换扩增在植入前胚胎性别诊断中的应用

目的 用多重置换扩增(MDA)方法,对植入前胚胎的单个卵裂球全基因组扩增后进行植入前胚胎性别的遗传学诊断.方法 用单细胞多重置换扩增方法对20个胚胎共20个单卵裂球进行全基因组扩增,用荧光PCR检测SRY、AMEL、XHPRT及X22 4个性别相关的基因座,检测胚胎性别,同时用同一胚胎另一卵裂球FISH结果作为对照.结果 20个卵裂球MDA均扩增成功,扩增成功率100％.20个胚胎均得到诊断,性别诊断成功率100％,其中12例为男性胚胎,8例为女性胚胎,与FISH结果一致率100％,诊断准确率100％.结论 可以用单卵裂球MDA后荧光PCR检测多个基因座的方法对胚胎性别进行快速、准确的植入前诊断.     

对β-地中海贫血携带者进行胚胎植入前遗传学诊断

目的 探讨对β-地中海贫血进行胚胎植入前遗传学诊断的方法。方法 对4例β-地中海贫血携带者进行超排卵和体外受精-胚胎移植治疗,胚胎活检后应用全基因组扩增技术,巢式-PCR及反向点杂交进行胚胎植入前遗传学诊断,根据诊断结果选择健康的胚胎移植入子宫。结果 4例患者共获卵97个,受精率为83%,可供活检的胚胎47个,总扩增效率为84.8%。平均等位基因脱扣发生率为14.9%。共移植10个健康胚胎,获得1例三胎妊娠（其中1个为空囊）,现已分娩健康双胎。结论 对β-地中海贫血进行植入前遗传学诊断可使β-地中海贫血患者实现生育健康后代的愿望,达到优生的目的。     

半重叠式多重引物PCR和基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中的应用

[目的]探讨半重叠式多重荧光多重引物PCR和基因扫描技术在T细胞淋巴瘤诊断中的应用.[方法]从普通石蜡切片组织标本中提取基因组DNA,用半重叠式多重荧光多重引物PCR扩增,利用DNA测序仪对其产物进行基因扫描分析.[结果]37例T细胞淋巴瘤中27例检测出有克隆性重排;25例B细胞淋巴瘤中2例呈阳性;10例何杰金氏淋巴瘤和7例反应性增生病例均呈阴性.[结论]在T细胞受体γ基因重排克隆性检测中,半重叠式多重荧光多重引物PCR及基因扫描技术具有样本来源便利,灵敏度高,特异性强,耗时短等优点,可作为T细胞淋巴瘤的诊断及鉴别诊断的辅助检测手段.     

荧光实时定量PCR检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体基因mRNA表达

目的建立荧光实时定量PCR法检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2肾上腺素能受体（AR）基因mRNA表达。方法随机选择ASAⅠ-Ⅱ级老年患者30例,分离外周静脉血淋巴细胞,采用荧光实时定量PCR法检测β1和β2-AR基因mRNA表达,并与半定量PCR检测结果进行比较。结果30例患者外周血淋巴细胞荧光实时定量PCR均检出β1和β2-ARmRNA表达,不同性别组同-基因表达量无显著差异（P〉0.05）;荧光实时定量PCR检测β2-AR mRNA表达量显著高于β1—AR mRNA（P〈0．001）,而半定量PCR随着循环次数增加,β1和β2-ARmRNA表达差异减小。结论所建立的荧光实时定量PCR成功检测老年人外周血淋巴细胞β1和β2-AR基因mRNA表达,有较高的灵敏性及特异性;半定量PCR扩增平台期影响试验结果判断。     

运用单细胞三重PCR对杜氏肌营养不良进行植入前遗传学诊断

目的:采用三重PCR技术检测缺失型杜氏肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)基因部分外显子和性别鉴定位点amelogenin基因,探讨该技术对DMD家系中致病基因携带者进行植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)的可行性.方法:显微操作取正常男性、正常女性和DMD基因8号、47号外显子缺失型DMD患者单个淋巴细胞及无DMD家族史夫妻行体外授精-胚胎移植(in vitro fertilization pre-embryo transfer,IVF-ET)术后废弃的单个卵裂球细胞,采用三重PCR技术扩增DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因.结果:64枚正常人单个淋巴细胞的DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为93.8%,93.8%和95.3%,假阳性率为2.8%;48枚8号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为3.3%;48枚47号外显子缺失型患者单个淋巴细胞的DMD基因8号外显子和amelogenin基因扩增阳性率均为95.8%,假阳性率为0;40枚单卵裂球细胞DMD基因8号、47号外显子和amelogenin基因扩增阳性率分别为82.5%,80.0%和77.5%,假阳性率为0.结论:本研究所建立的单细胞三重PCR技术具有较高的扩增阳性率和特异性,有望在缺失型DMD家系中进行PGD的临床应用.