姜黄素促进高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化的作用及机制研究

目的研究姜黄素对高糖环境下骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化的影响及可能机制。方法原代分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,分为正常组、高糖组和高糖+姜黄素组。CCK-8检测细胞增殖;免疫荧光染色检测细胞NF-κB p65核转位; Western blot检测NF-κB p65核蛋白表达。成骨能力检测分为正常糖浓度成骨诱导组、高糖浓度成骨诱导组、高糖+姜黄素成骨诱导组,其中成骨诱导培养为每100 m Lα-MEM培养基中加入2 mmol/L谷氨酰胺、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸。茜素红染色检测细胞钙结节形成,荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2和OCN mRNA表达。结果接种培养7 d,倒置显微镜下可见骨髓间充质干细胞集落,呈克隆性生长;传代培养以后细胞伸展为长梭形。CCK-8结果表明,与正常组比较,高糖组细胞1 d、3 d时增殖能力无显著性差异(P0.05); 5 d时与正常组比较,高糖组细胞增殖能力显著降低(P0.05); 1 d、3 d、5 d时姜黄素组与高糖组比较细胞增殖能力差异均无统计学意义(P0.05)。与正常组比较,高糖组细胞NF-κB p65活化入核增多,姜黄素组则抑制高糖浓度下细胞NF-κB p65核转位,Western blot显示姜黄素可抑制NF-κB p65核蛋白表达。各组细胞成骨诱导14 d后茜素红染色,正常组可见大量矿化结节,高糖组仅见少量矿化结节,而姜黄素处理可以明显促进高糖浓度下钙结节形成。PCR结果显示,各组细胞成骨诱导14 d后,与正常组比较,高糖组成骨分化相关基因Runx2、OCN mRNA表达显著降低,差异有统计学意义(P0.05);高糖+姜黄素组则可以促进高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化相关基因Runx2、OCN mRNA表达,差异有统计学意义(P0.05)。结论姜黄素能促进高糖环境下骨髓间充质干细胞成骨分化,其机制可能与抑制高糖浓度下细胞NF-κB p65活化相关。     

老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞成骨分化相关基因表达的影响

目的:观察老鹳草素对小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化的影响,并对成骨分化过程中相关基因表达进行检测。方法:分离、培养小鼠BMSCs,加入不同浓度老鹳草素(1×10-9,1×10-8,1×10-7mol·L-1)培养,另设空白组,分别于成骨诱导第7,14天采用碱性磷酸酶(ALP),骨钙素(OCN)试剂盒测定ALP活性及OCN含量,并进行ALP染色。于成骨诱导第21天时采用茜素红染色检测成骨分化过程中钙结节形成数量,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)检测BMSCs成骨分化过程中OCN,ALP,骨涎蛋白(BSP),Runt相关转录因子2(Runx2)mRNA和蛋白表达的变化。结果:与空白组比较,成骨诱导后第7,14天时,老鹳草素各剂量组ALP活性,OCN含量及ALP染色强度均明显升高(P0.05),成骨诱导第21天时,老鹳草素各剂量组矿化结节数量及OCN,ALP,BSP,Runx2 mRNA和蛋白表达均明显升高(P0.05)。结论:老鹳草素能够明显促进BMSCs向成骨方向分化,成骨相关基因OCN,ALP,BSP,Runx2均参与这一过程。     

刘氏正骨方2号对过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs促成骨分化的影响

目的探究刘氏正骨方2号对过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs中Wnt信号通路及成骨相关因子的影响。方法分别用刘氏正骨方2号含药血清、BMP-2干预BMSCs,并分为对照组、中药组、BMP-2组,采用CCK-8法检测细胞活性,ALP染色、茜素红染色检测成骨诱导28 d后各组细胞ALP活性和矿化情况,荧光定量PCR、Western Blot法检测各组细胞中Col1A2、OCN、OPN、Sclerostin表达。采用腺病毒转染技术过表达BMSCs中Sclerostin基因,分为空白对照组、过表达Sclerostin组,再分别用空白血清、中药血清体外干预3 d后,检测Wnt信号通路相关分子(LRP5、β-catenin)和成骨相关因子Runx2的表达情况。结果与空白对照组比较,中药组BMSCs细胞活性及成骨分化程度增强,BMP-2组成骨分化程度高于中药组,但BMP-2组细胞活性最低(P0.05);在Sclerostin基因表达方面,中药组出现表达抑制,而BMP-2组呈上调趋势(P0.05)。腺病毒转染BMSCs可抑制BMSCs细胞活性,上调Sclerostin mRNA和蛋白表达。与NT比较,Ad-SOST组细胞活性降低,LRP5、β-catenin、Runx2表达下调(P0.05);与空白血清比较,中药血清干预后NT组、Ad-SOST组细胞活性不同程度增强,而LRP5、β-catenin、Runx2表达上调(P0.05)。结论刘氏正骨方2号具有增强BMSCs细胞活性、促进成骨分化作用,可影响过表达Sclerostin腺病毒转染后BMSCs的LRP5、β-catenin、Runx2表达。     

补肾活血汤含药血清对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

【目的】探讨补肾活血汤促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外成骨细胞分化的能力。【方法】用不同浓度的补肾活血汤含药血清干预BMSCs,7d后应用4-硝基苯基磷酸二钠盐（PNPP）偶氮法测定碱性磷酸酶（ALP）活性,21d后行茜素红染色（ARS）观察钙盐沉积情况判定成骨能力,实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测Runx相关转录因子2（Runx2）、骨钙素（OCN）、骨桥蛋白（OPN）的基因表达以评估成骨能力。【结果】与空白血清组比较,补肾活血汤低、中、高剂量血清组BMSCs的ALP活性、茜素红染色面积及Runx2、OCN、OPN基因表达水平均升高（P<0.05或P<0.01）。【结论】补肾活血汤可促进BMSCs向成骨细胞分化,其机制可能与上调Runx-2、OCN、OPN表达有关。     

刘氏正骨方对BMSCs成骨分化中Wnt信号通路及Sclerostin基因的影响

目的探究刘氏正骨方对骨髓间充质干细胞成骨分化中Wnt信号通路的影响。方法使用刘氏正骨方含药血清或BMP-2对骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行28 d成骨诱导后,检测BMSCs的细胞活性、ALP活性及细胞矿化情况;采用RT-PCR和Western blotting法检测细胞中Col 1A2、OCN、OPN和Sclerostin基因表达情况。使用含2.5%、5%、10%中药血清对BMSCs进行14 d体外干预,检测Wnt信号通路关键因子LRP5、Sclerostin及成骨关键转录因子Runx2的表达情况。结果1)中药组和BMP-2组中BMSCs中ALP活性及细胞矿化现象明显强于对照组,且中药组明显高于BMP-2组(P<0.05);Col1A2、OCN、OPN的表达也呈现相同趋势改变(P<0.05),但Sclerostin基因呈现明显表达下调(P<0.05)。2)高浓度中药血清可上调LRP5和Runx2表达(P<0.05),下调Sclerostin基因表达(P<0.05)。结论刘氏正骨方可以促进BMSCs体外成骨分化,其作用机制可能与下调Sclerostin基因表达、激活Wnt信号通路有关。     

基于Hippo-YAP信号通路探讨桃红四物汤对BMSCs增殖与成骨分化的影响

目的 分离培养大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）,运用桃红四物汤含药血清和Hippo信号通路抑制剂Verteporfin干预,进而观察BMSCs增殖和成骨分化的能力。方法 采用全骨髓贴壁法体外培养BMSCs,选用10倍等效剂量的桃红四物汤灌服大鼠制备桃红四物汤含药血清,采取0.9%氯化钠注射液灌胃大鼠制取空白组对照血清,将BMSCs分为3组：空白血清组、桃红四物汤含药血清组（THSWT组）以及桃红四物汤含药血清+Verteporfin组（THSWT+V组）,使用CCK-8分析法分析4个时相点0、1、3、7 d细胞增殖活力;干预7 d后,进行ALP测定,观察骨向分化程度;处理21 d后,进行茜素红染色,观察钙积累,Western blotting法检测各组细胞成骨关键因子及Hippo通路关键蛋白表达。结果 THSWT组BMSCs细胞增殖能力明显高于THSWT+V组及空白血清组（P <0.01）;THSWT组BMSCs成骨分化能力及钙盐沉积程度高于THSWT+V组及空白血清组;THSWT组中YAP蛋白表达低于空白血清组、TAZ蛋白表达高于空白血清组（P <0.05）;THSWT...     

黄芪多糖对骨髓间充质干细胞向肿瘤相关成纤维细胞分化中IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路的影响

目的观察黄芪多糖(APS)在骨髓间充质干细胞(BMSCs)向肿瘤相关成纤维细胞(TAFs)分化中对IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路的影响,探讨其可能的调控机制。方法以白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导BMSCs,建立向TAFs方向分化的炎性微环境模型;采用CCK-8法分别检测不同浓度IL-6/STAT3通路阻断剂AG490和TNF-α/NF-κB通路阻断剂BMS345541对BMSCs和诱导后BMSCs增殖能力的影响,Western blot检测阻断剂所对应的靶向蛋白JAK2和IKKβ的表达。将BMSCs分为空白组、模型组、模型+AG490组、模型+BMS345541组、模型+APS组,检测各组TAFs标记分子α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)和IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路关键蛋白STAT3、p65的表达。结果与空白组比较,模型组BMSCs增殖水平明显增强(P0.05);10μmol/L AG490和5μmol/L BMS345541较模型组BMSCs抑制作用明显增强(P0.05)。10μmol/L AG490对应的靶蛋白JAK2较其他各组表达减弱,5μmol/L BMS345541对应的靶蛋白IKKβ较其他各组表达减弱,故选为最佳作用浓度。通路阻断剂干预结果表明,与空白组比较,模型组TAFs标记分子α-SMA、FAP和通路关键蛋白STAT3、p65表达均明显升高(P0.05);与模型组比较,各干预组TAFs标记分子α-SMA、FAP和通路蛋白STAT3、p65表达均明显下降(P0.05)。结论 APS对IL-6、TNF-α诱导的BMSCs向TAFs方向分化有抑制作用,其机制可能与调控IL-6/STAT3、TNF-α/NF-κB通路有关。     

黄芪散对高糖作用下成骨细胞相关功能的影响

目的:观察黄芪散含药血清对高糖条件下成骨细胞功能的影响及与糖尿病性骨质疏松发病机制相关基因的影响,探讨黄芪散(HQS)对糖尿病性骨质疏松症的疗效机制。方法:选用健康清洁级5周龄Wistar大鼠10只,随机分为正常组和药物组。制备黄芪散含药血清和空白血清,选用健康清洁级新生大鼠乳鼠4只,体外以酶消化法分离培养新生乳鼠颅骨成骨细胞(Ob),行细胞计数(CCK-8)法测定高糖条件下(25.5 mmol·L~(-1))5%,10%,20%,30%含药血清对细胞增殖的影响,选取增殖活性最佳血清浓度,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)法检测黄芪散对成骨功能相关基因骨桥蛋白(OPN),骨钙素(OC),碱性磷酸酶(ALP)和胰腺-骨骼相关基因骨保护素(OPG),叉头转录因子1(Fox O1)表达的影响。结果:10%和30%血清浓度组细胞增殖较空白组有明显升高(P0.05);20%血清浓度组较空白组有显著升高(P0.01)。与空白组比较,5%浓度条件下,OPN,OPG mRNA表达明显下调(P0.05);10%浓度条件下,OC,ALP,OPN mRNA表达明显上调(P0.05,P0.01);OPG,Fox O1 mRNA较空白组表达显著下调(P0.01)。20%浓度和10%浓度条件差异性一致,OPN,OPG,Fox O1 mRNA影响趋势较10%浓度药物血清组更明显。20%浓度血清条件下,与空白组比较,OC和OPN蛋白表达显著上调(P0.01),OPG蛋白表达显著下调(P0.01)。结论:黄芪散对糖尿病性骨质疏松的疗效机制可能与其促进高糖作用下成骨细胞增殖作用有关,与下调胰腺-骨骼相关基因OPG,Fox O1表达有关。     

脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞及其鉴定

目的:探讨将脂肪干细胞定向诱导分化为成骨细胞的方法并对所诱导细胞的成骨特性进行鉴定。方法:取行脂肪抽吸术患者的脂肪组织,I型胶原酶消化进行培养,贴壁细胞传代,取第2代细胞进行诱导,培养基中添加成骨诱导剂地塞米松(0.01μM)、β-磷酸甘油钠(10mM)、2-磷酸抗坏血酸(50μM)和1,25-(OH)2VitD3(10mM)。鉴定诱导细胞的成骨特性:碱性磷酸酶(AKP)定量检测,免疫荧光化学检测骨钙素(OCN)、骨桥素(OPN)、I型胶原表达,Alizarn Red染色检测钙结节形成,RT-PCR检测AKP和OPN表达。结果:第2代脂肪干细胞诱导后AKP表达自第3天起各个检测点(第3、7、14、21、28天)诱导组与对照组差异皆具有统计学意义(P<0.05),免疫荧光检测OCN、OPN及I型胶原表达阳性,Alizarn Red染色可见钙结节形成,RT-PCR检测诱导组AKP和OPN表达阳性。结论:人ADSCs能够向成骨细胞表型诱导分化。     

健骨益痹方含药血清对骨髓间充质干细胞体外增殖及成骨分化的影响

目的观察健骨益痹含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化的影响。方法分离BMSCs分为空白对照组(A组)、低浓度组(B组)、中浓度组(C组)、高浓度组(D组)、阳性对照组(E组),通过MTT法检测健骨益痹含药血清对BMSCs活性的影响,于干预后的第3、6、9、12天分别测定细胞碱性磷酸酶(ALP)活性;茜素红染色法染色并观察钙结节密度;RT-PCR法检测ColⅠ、BGP、RUNX2mRNA转录表达。结果与对照组比较,实验组经定向成骨诱导后BMSCs增殖增强,ALP水平升高,钙结节密度显著增大,成骨相关转录因子ColⅠ、BGP、RUNX2的表达量亦增加(P0.05)。结论健骨益痹复方含药血清能促进BMSCs体外增殖并诱导其成骨分化。     

黄芪含药血清对衰老骨髓间充质干细胞CYP24A1，CYP27B1 mRNA和蛋白的影响

目的:通过探讨不同浓度黄芪含药血清对衰老骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化过程中24-羟基化酶(CYP24A1),1α羟化酶(CYP27B1)mRNA及蛋白表达的影响,初步探讨其治疗原发性骨质疏松症作用机制。方法:将SD大鼠随机分为6组,正常组、模型组、黄芪含药血清低、中、高质量分数组(20%,40%,60%),维生素D组。细胞增殖毒性检测(CCK-8)法检测不同浓度黄芪含药血清对衰老BMSCs成骨分化细胞存活率的影响;实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR),蛋白免疫印迹法(Western blot)检测不同浓度黄芪含药血清对衰老BMSCs成骨分化细胞CYP24A1,CYP27B1 mRNA和蛋白的表达情况。结果:CCK-8法显示,与正常组比较,模型组BMSCs成骨分化细胞经D-半乳糖诱导后细胞增殖存活率显著降低(P0.01);与模型组比较,黄芪含药血清中、高质量分数组及维生素D组均可在不同程度上提高衰老BMSCs成骨分化细胞增殖存活率(P0.01);Real-time PCR和Western blot结果显示,与正常组比较,模型组CYP27B1 mRNA和蛋白相对表达量显著降低,CYP24A1 mRNA和蛋白相对表达量显著升高(P0.01);与模型组比较,黄芪高质量分数组均可升高CYP27B1 mRNA和蛋白相对表达量(P0.01),降低CYP24A1 mRNA和蛋白相对表达量(P0.01),呈质量分数依赖性。结论:不同浓度黄芪含药血清可治疗骨质疏松症,其机制可能与调节衰老骨髓间充质干细胞成骨分化过程中CYP24A1,CYP27B1 mRNA及蛋白表达水平有关。     

复叶耳蕨总黄酮通过BMP信号通路促进MSC成骨分化

目的:研究复叶耳蕨总黄酮(total flavonoids from Arachniodes exilis,TFA)对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的作用及其分子机制。方法:通过茜素红染色、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性考查BMSCs成骨情况;RT-PCR检测Ⅰ型胶原酶α1(collagen typeⅠα1,COL1A1)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、骨桥蛋白(osteopotin,OPN)、BMP2、BMP4、Runx2、Osterix转录水平;ELISA检测骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)信号通路相关蛋白BMP2、BMP4、Runx2表达情况。结果:TFA能显著增加BMSCs碱钙结节的形成、ALP活性,上调COL1A1、OCN、OPN的表达,促进BMSCs成骨分化,而Noggin能抑制该作用;TFA能显著上调BMP2、BMP4、Runx2、Osterix的表达。结论:TFA可能通过BMP信号通路促进大鼠BMSCs成骨分化。     

不同浓度麝香含药血清对骨髓间充质干细胞增殖、分化的影响

目的探讨不同浓度麝香对骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖和定向成骨、成脂诱导分化的影响。方法 60只SD大鼠随机分为麝香高、中、低剂量组及空白对照组,每组15只。麝香高、中、低剂量组分别给予麝香16. 8、8. 4、4. 2μl/100 g灌胃,每日1次,连续8天,分别制备不同浓度麝香含药血清及空白血清。另取15只SD大鼠利用全骨髓贴壁筛选法分离BMSCs,培养至第3代,通过细胞形态学观察、细胞表型鉴定、成骨及成脂诱导分化方法鉴定BMSCs。利用不同浓度麝香含药血清和空白血清干预BMSCs,检测各组细胞不同时间细胞增殖率、碱性磷酸酶(ALP)活性、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、钙化结节数及脂肪细胞转化率。结果与空白血清组同时间比较,麝香低剂量血清组在第2、3、4、5、7天,麝香中剂量血清组在第1、5天细胞增殖率均升高;麝香低剂量血清组在第2、4、6、8天,麝香中剂量血清组在第4、8天,麝香高剂量血清组在第2、8天ALP活性升高;除麝香高剂量血清组钙化结节数外,各组钙化结节数和脂肪细胞转化率亦升高(P 0. 05或P 0. 01)。与麝香低剂量血清组比较,麝香高剂量血清组在第1、3、5、7天,麝香中剂量血清组在第1、5天细胞增殖率降低,在第6、8天ALP活性降低,钙化结节数及脂肪细胞转化率亦降低(P 0. 05)。麝香高、中、低剂量血清组Ⅰ型胶原细胞阳性表达依次增强,空白血清组细胞阳性表达很弱或几乎未见。结论麝香可以促进BMSCs增殖并诱导其定向分化,以4. 2μl/100 g浓度效果最好。     

半夏泻心汤调控Shh信号通路对BMSCs外泌体诱导的人胃癌细胞BGC-823增殖的影响

目的观察半夏泻心汤对骨髓间充质干细胞(BMSCs)外泌体诱导的人胃癌细胞BGC-823增殖的影响,探讨其相关作用机制。方法利用Transwell小室将BMSCs外泌体与BGC-823细胞进行非接触共培养,实验分为空白组、模型组、阳性对照组和半夏泻心汤高、中、低剂量组,荧光染料Dil标记BMSCs外泌体,激光共聚焦显微镜观察BGC-823细胞对BMSCs外泌体的摄取,计算平均光密度(MOD);实时无标记细胞分析技术检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期;RT-q PCR检测Shh、Ptch1、Smo、Gli1及C-myc m RNA的表达。结果与空白组比较,模型组细胞内可见大量红色荧光标记,MOD值显著增加(P0.05);模型组20~50 h细胞指数(CI)显著增加(P0.05),G_1、G2期细胞比例降低,S期细胞比例升高(P0.05),Shh、Smo、Ptch1、Gli1及C-myc mRNA表达显著升高(P0.05);与模型组比较,半夏泻心汤各剂量组红色荧光标记减弱,其中半夏泻心汤高、中剂量组MOD值明显减少(P0.05),半夏泻心汤各剂量组20~50hCI显著减少(P0.05),G_1、G2期细胞比例升高,S期细胞比例降低(P0.05),Shh、Smo、Ptch1、Gli1及C-myc mRNA表达显著降低(P0.05)。结论半夏泻心汤可抑制BMSCs外泌体诱导的BGC-823细胞增殖,其机制可能与下调Shh、Smo、Ptch1、Gli1及C-myc mRNA表达,抑制Shh信号通路有关。     

老鹳草素通过Wnt/β-catenin信号通路影响小鼠骨髓基质干细胞的增殖和成骨分化

目的:观察Wnt/β-catenin信号通路在老鹳草素诱导小鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)增殖和成骨分化中的作用机制。方法:分离、培养小鼠BMSCs,分为对照组(DMEM/F12完全培养基)、老鹳草素低剂量组(10-9mol·L-1老鹳草素+DMEM/F12完全培养基)、老鹳草素中剂量组(10-8mol·L-1老鹳草素+DMEM/F12完全培养基)、老鹳草素高剂量组(10-7mol·L-1老鹳草素+DMEM/F12完全培养基)、老鹳草素高剂量+DKK1(Wnt/β-catenin信号通路特异性阻断剂)组和DKK1组。成骨诱导第7天时,采用CCK-8法检测细胞增殖,碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OCN)试剂盒测定ALP活性及OCN含量。成骨诱导48 h时,采用Real time-PCR和Western-blot检测各组Wnt/β-catenin信号通路的关键信号分子Wnt3a、β-catenin、GSK-3β、Axin2、Runx2 mRNA和蛋白表达。结果:成骨诱导第7天时,老鹳草素各剂量组明显促进BMSCs的增殖,呈剂量依赖性(均P<0.05);同时ALP活性及OCN含量较对照组显著升高,呈剂量依赖性(均P<0.05)。成骨诱导48 h时,老鹳草素各剂量组Wnt3a、β-catenin、Axin2、Runx2 mRNA和蛋白表达较对照组显著上调,GSK-3βmRNA和蛋白表达较对照组显著下调,呈剂量依赖性(均P<0.05)。加入DKK1后,细胞增殖受到显著抑制,ALP活性及OCN含量显著降低(均P<0.05);同时Wnt3a、β-catenin、Axin2、Runx2 mRNA和蛋白表达显著下调,GSK-3βmRNA和蛋白表达显著上调(均P<0.05)。结论:老鹳草素能够明显促进BMSCs的增殖及向成骨方向分化,其机制与Wnt/β-catenin信号通路的激活有关。     

定坤丹联合西药对损伤性大鼠子宫内膜β-catenin,VEGF,MMP-9 mRNA表达的影响

探讨定坤丹对多重损伤性大鼠子宫内膜容受性的影响。选取性周期规律的40只SD雌性大鼠,按随机数字表法分为空白组、模型组、补佳乐组、定坤丹组、联合用药组。除空白组外,其余各组建立肾阳虚薄型子宫内膜模型。空白组自由饮水摄食,模型组予蒸馏水灌胃,其余各治疗组分别给予补佳乐、定坤丹、补佳乐+定坤丹灌胃。15 d后,ELISA法检测血清骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteina-ses-9,MMP-9)水平。HE染色、免疫组织化学法、RT-PCR法分析子宫内膜形态、内膜厚度以及定坤丹的治疗机制。与空白组比较,模型组OPN,VEGF,MMP-9水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,定坤丹组OPN和MMP-9水平降低(P0.05,P0.01)。与空白组比较,模型组子宫内膜层基质细胞减少,腺体、血管稀疏,内膜明显变薄(P0.01);与模型组比较,各治疗组腺体、血管增多,基质细胞密集,内膜均明显增厚(P0.01)。与空白组比较,模型组CK19表达面积明显减少(P0.01);与模型组比较,各治疗组CK19表达面积增多(P0.05)。与空白组比较,模型组大鼠子宫内膜β-catenin和MMP-9 mRNA升高(P0.05),而VEGF mRNA降低(P0.05)。与模型组比较,补佳乐组及联合用药组MMP-9 mRNA明显降低(P0.05);定坤丹联合补佳乐通过上调多重损伤性大鼠子宫内膜β-catenin和VEGF mRNA表达,下调MMP-9 mRNA的表达,提高子宫内膜容受性。     

补肾通络方通过抑制chemerin及炎性因子干预骨质疏松症的机制研究

目的评价补肾通络方对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨、成脂分化以及小鼠单核巨噬细胞RAW264.7破骨分化模型的干预作用,并探究其调节骨形成及骨吸收的相关机制。方法分别给予补肾方、通络方和补肾通络方进行干预,采用茜素红染色法鉴定BMSCs成骨分化后各组钙结节形成情况;采用油红O染色鉴定BMSCs成脂分化后各组脂滴形成情况;采用q RT-PCR法检测BMSCs成骨、成脂分化后各组成骨、成脂分化标志基因m RNA表达,成骨、成脂分化过程和炎症模型中chemerinm RNA表达;采用ELISA法检测BMSCs成骨、成脂分化过程和炎症模型中各组chemerin分泌量。采用抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant alkaline phosphatase,TRAP)染色鉴定各组RAW264.7细胞破骨分化程度,并测定各组TRAP活性;采用Westernblotting法检测RAW264.7细胞破骨分化中各组TRAP蛋白表达情况;采用q RT-PCR法及ELISA法检测RAW264.7细胞破骨分化后各组chemerin、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)及肿瘤坏死因子-α(tumornecrosisfactor-α,TNF-α)mRNA表达及分泌。结果与对照组比较,补肾通络方组钙结节显著增多(P0.01),脂滴显著减少(P0.01),成骨分化标志基因表达显著升高(P0.01),成脂分化标志基因表达显著下降(P0.05),chemerin分泌及基因表达在成骨分化第3天及成脂分化第3、7天显著下降(P0.05、0.01)。与对照组比较,BMSCs炎症模型chemerin分泌及基因表达显著升高(P0.01);与BMSCs炎症模型比较,补肾通络方组chemerin分泌及基因表达显著下降(P0.01)。与对照组比较,RAW264.7细胞破骨分化中TRAP阳性细胞、活力、蛋白表达以及IL-6、TNF-α分泌与基因表达均显著升高(P0.05、0.01);与模型组比较,补肾通络方组TRAP阳性细胞、活力、蛋白表达以及IL-6、TNF-α分泌与基因表达显著降低(P0.01)。结论补肾通络方可通过抑制chemerin及炎症因子来调节成骨、成脂分化及破骨细胞分化,从而促进骨形成、抑制骨吸收、改善骨质疏松症。     

左归丸含药血清对BMSCs成骨分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响

目的:研究左归丸含药血清对培养大鼠BMSCs成骨向诱导分化过程中Cx43表达及GJIC功能的影响。方法:密度梯度离心法制取BMSCs培养传代,通过血清药理学方法,设立正常对照A组、左归丸含药血清B组、缝隙连接阻滞C组。培养过程中进行细胞形态学观察;第14天分别采用RT-PCR、FRAP技术检测Cx43、β-catenin、BGPmRNA表达及细胞GJIC功能;第21天茜素红染色检测矿化结节形成情况。结果:左归丸含药血清能明显促进Cx43、β-catenin、BGPmRNA表达,与A组比较,P0.05;加用AGA后,Cx43、β-cateninmRNA表达无明显影响,而BGPmRNA明显下降,与B组比较,P0.05。FRAP检测镜下观察B组细胞内荧光恢复明显,其平均荧光恢复率与A、C组比较差异显著,P0.01。钙结节相对面积定量分析,B组显著高于A、C组,P0.05。结论:左归丸含药血清能增强BMSCs成骨向诱导分化过程中Cx43表达及GJIC功能,并与β-catenin、BGP基因在此过程中发挥协同作用。这可能是其促进BMSCs成骨分化成熟的重要机制。     

牛膝甾酮对小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化和增殖的影响

目的研究牛膝甾酮(IS)对小鼠成骨细胞系(MC3T3-E1细胞)增殖、分化的影响及其可能的分子机制。方法将MC3T3-E1细胞分为对照组及IS不同浓度组(10~(-4)～10~(-1)ng/μL),24、48 h后采用细胞计数(CCK8)试剂盒检测细胞增殖,7、14天后采用碱性磷酸酶(ALP)活性试剂盒检测ALP活性,茜素红染色检测矿化结节,原位末端标记(TUNEL)试剂盒检测细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测成骨分化相关标志物Ⅰ型胶原(CollagenⅠ)、骨保护素(OPG)、骨桥蛋白(OPN)、骨钙素(OCN)、ALP以及雌激素受体alpha(ERα)、雌激素受体beta(ERβ) mRNA的表达水平。结果与对照组比较,在干预48 h后,10~(-3)、10~(-2)、10~(-1)ng/μL IS能抑制细胞的增殖(P0.05),但对细胞凋亡无明显影响。10~(-4)、10~(-3)、10~(-2)、10~(-1)ng/μL IS均能够促进ALP活性及矿化结节的形成(P0.05),亦能促进ERα、OPG、CollagenⅠ、ALP mRNA表达(P0.05);10~(-3)、10~(-2)、10~(-1)ng/μL IS均能促进OPN、OCN mRNA表达(P0.05),10~(-1)ng/μL IS能够促进ERβmRNA表达(P0.05)。结论 IS能促进MC3T3-E1细胞的成骨分化,其可能机制与上调成骨分化标志物及提高ERαmRNA表达有关。