伊马替尼联合高三尖杉酯碱或阿糖胞苷对K562细胞作用的研究

伊马替尼是一种ber／abl酪氨酸激酶活性抑制剂^[1]。近年来研究表明，伊马替尼能够选择性地抑制K562细胞的增殖、诱导K652细胞凋亡。临床和实验研究揭示高三尖杉酯碱治疗慢性粒细胞白血病（CML）有确切的疗效，可以明显地抑制K562细胞增殖、诱导K562细胞凋亡。阿糖胞苷是治疗CML的常用药物，对K562细胞的增殖有一定的抑制作用，亦可诱导K562细胞的凋亡。我们在本研究中探索伊马替尼与高三尖杉酯碱或阿糖胞苷联合应用是否有协同和增强抑制K562细胞增殖、影响K562细胞凋亡的作用，以及对ber／ablmRNA水平的作用。     

高三尖杉酯碱联合伊马替尼对K562细胞诱导凋亡及BCL6表达的影响

目的:探讨高三尖杉酯碱(homoharringtonine,HHT)联合伊马替尼(Imatinib,IM)对K562细胞增殖、凋亡及BCL6蛋白和mRNA表达的影响。方法:应用CCK-8法检测HHT和IM单用及联用对K562细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot分析BCL6蛋白表达水平,RT-PCR检测BCL6 mRNA表达水平。结果:单用HHT对K562细胞增殖具有抑制作用,且呈浓度依赖性(r=0.820),诱导K562细胞凋亡;联合用药组细胞增殖抑制率及细胞凋亡率均明显升高(P0.05);单用HHT作用后BCL6蛋白表达下调,IM作用后BCL6蛋白表达明显上调,联合用药与IM单药相比,BCL6蛋白表达出现下调,差异均有统计学意义(P0.05);与对照组相比,HHT和IM单药处理后BCL6 mRNA表达均出现下调,联合用药组较单用组下调更显著(P0.05)。结论:HHT可抑制K562细胞增殖,促进细胞凋亡,且与IM有协同作用。HHT可能通过抑制BCL6表达增强K562细胞对IM的敏感性。     

硼替佐米与高三尖杉酯碱在K562细胞中的联合作用及机制研究

目的:探讨硼替佐米(bortezomib,BTZ)与高三尖杉酯碱(homoharringonine,HHT)两药联合对K562细胞增殖和凋亡的影响及其联合作用机制与BCL-2、BAX、MCL-1蛋白的关系。方法:通过将K562细胞株按不同处理分为对照、BTZ 20 nmol/L、HHT 40 ng/ml、BTZ 20 nmol/L+HHT 40 ng/ml共4组。采用MTT方法检测各处理组细胞增殖抑制率。采用Annexin V-FITC/PI双染色法流式细胞术检测各处理组细胞早期凋亡率,采用Western blot法测定各处理组中BCL-2、BAX、MCL-1蛋白相对表达量。结果:BTZ+HHT联合组作用于K562细胞24、48和72h后的增殖抑制率(%)高于BTZ及HHT单药组(P0.01)。联合组K562细胞的早期凋亡率(%)高于BTZ及HHT 2个单药组(P0.05)。联合组K562细胞的BCL-2蛋白相对表达量明显低于BTZ及HHT单药组(P0.05)。联合组BAX蛋白相对表达量明显高于BTZ及HHT单药组(P0.05)。M CL-1蛋白相对表达量高低:BTZ组对照组BTZ+HHT联合组HHT组(组间比较P0.05)。结论:BTZ与HHT联合可起协同抑制细胞增殖、诱导凋亡效应,其机制与明显下调BCL-2蛋白、上调BAX蛋白有关。此外,HHT可通过下调MCL-1蛋白表达增加K562细胞对BTZ作用的敏感性。     

汉防己甲素联合伊马替尼对K562／G01细胞诱导凋亡作用及其相关机制

本研究探讨伊马替尼（imatinib,IM）和汉防己甲素（tetrandrine,Tet）单用和联合应用对K562／G01细胞的凋亡诱导作用及其可能机制。应用M1fr法检测IM和Tet单用及联合用药对细胞增殖抑制的作用,用流式细胞术（FCM）检测细胞周期和凋亡率,用实时荧光定量PCR检测caspase-3、BCL-2mRNA的表达,应用Westernblot分析caspase-3、BCL-2蛋白的表达情况。结果表明,1．0μmol／LIM和／或1．5μmol／L Tet单用及联合作用于K562／G01细胞48h后,对细胞增殖的抑制率分别是（22．74±0．05）％、（20．34±0．57）％、（44．28±0．60）％,两药联合应用较单药抑制作用明显。流式细胞术检测显示,Tet作用后细胞向G,／s期转化;Tet1．5μmol／L、3μmol／L与1．0μmol／LIM联合应用48h的早期凋亡率分别为（7．81±0．16）％、（14．10±0．28）％,诱导凋亡作用比单药组明显增加。FQ—PCR和Westernblot检测均显示单独应用Tet和IM后caspase-3表达上调,BCL-2表达下调,联合用药组作用更显著。结论：单独应用Tet对K562／G01细胞有诱导凋亡的作用,两药联合应用具有明显的协同效应,且具有时间和剂量依赖性,其机制可能与上调caspase-3mRNA及其蛋白表达和下调BCL-2mRNA及其蛋白的表达有关。     

细胞自噬对高三尖杉酯碱作用K562细胞的影响

目的:探讨高三尖杉酯碱(HHT)单用或与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联用对K562细胞凋亡及自噬的影响。方法:K562细胞在HHT(10 ng/ml)作用下1-8 d,采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用RT-PCR法、Western blot法和透射电子显微镜检测细胞自噬。结果:在HHT作用前期K562细胞凋亡率逐渐升高,而在后期则下降。HHT作用后,K562细胞的Beclin1表达及LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白比值先下降后升高。HHT单用时,激活型caspase-3蛋白表达前期逐渐上升,而在后期下降。与自噬抑制剂3-MA联用组的K562细胞的Beclin1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ的比值持续下降,而激活型caspase-3蛋白表达则逐渐升高。结论:HHT可诱导K562细胞凋亡,但HHT持续作用可诱导K562细胞发生自噬,与3-MA联用则增强HHT的细胞毒作用。     

高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的实验研究

高三尖杉酯碱（ＨＨＴ）是从三尖杉属植物中分离出来的一种生物碱，临床上广泛地用于急性粒细胞白血病、急性单核细胞白血病等的治疗。我们以Ｋ５６２细胞为材料，观察ＨＨＴ对白血病细胞的杀伤模式及其引发的细胞死亡形式，以进一步研究ＨＨＴ对白血病细胞损伤的机制。材...     

硼替佐米对伊马替尼耐药细胞系K562/G01药物敏感性的影响

目的 探讨蛋白酶体抑制剂硼替佐米对伊马替尼耐药细胞系(K562/G01)药物敏感性的影响及作用机制.方法 采用MTT法观察伊马替尼单用与联用硼替佐米对K562/G01细胞增殖的影响.流式细胞技术检测细胞周期的变化.实时荧光定量PCR检测COX-2、多药耐药(mdr1)基因的表达.结果 联合10、20 nmol/L硼替佐米能明显增强K562/G01细胞的伊马替尼药物敏感性,逆转倍数分别为1.83、2.72倍,进一步计算表明两药联合具有协同作用.流式细胞技术检测显示硼替佐米作用后细胞周期向G2/M期转化.实时荧光定量PCR检测显示K562/G01细胞高表达的COX-2和mdr1基因,硼替佐米作用后均表达下调.结论 硼替佐米能增强K562/G01细胞对伊马替尼的敏感性,其机制可能与细胞周期的G2/M期阻滞,抑制COX-2和mdr1的表达有关.

Abstract：

Objective To explore the effect of bortezomib ( BOR) on the drug sensitivity of imatinibresistant chronic myeloid leukemia cell line K562/G01 cell and its mechanism. Methods MTT assay was used to detect the inhibition effect of cell growth, flow cytometry to cell cycle, and real time-PCR to the expression of COX-2 and mdrl mRNA. Results Combination of 10 and 20 nmol/L BOR with imatinib could significantly enhance the sensitivity of K562/G01 to imatinib, the reverse factor was 1. 83 and 2.72-fold respectively. Cell cycle arrested at G2/M phase could be observed by flow cytometry on BOR treatment. The over-expression of COX-2 and mdrl could be down-regulated by BOR. Conclusions BOR can enhance the imatinib sensitivity of imatinib resistant K562/G01 cell. The mechanism may be related to cell cycle phase arrested at G2/M and down-regulation of COX-2 and mdrl expression.     

雷公藤内酯醇对伊马替尼耐药的K562/G01细胞增殖抑制及诱导凋亡作用的研究

本研究旨在探讨雷公藤内酯醇对K562/G01细胞增殖抑制和诱导凋亡作用的影响及其可能的机制.MTT法检测伊马替尼、雷公藤内酯醇单药及联合用药对K562/G01增殖的影响;流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡率和P-gp蛋白表达的变化;Western blot分析P-gp蛋白的表达情况;实时荧光定量PCR检测BCR/ABL基因的表达.结果表明：雷公藤内酯醇能增强伊马替尼对K562/G01细胞的增殖抑制和诱导凋亡作用;雷公藤内酯醇能将细胞阻滞在G1期,下调P-gp蛋白和BCR/ABL基因表达.结论：雷公藤内酯醇对K562/G01细胞有增殖抑制和诱导凋亡作用,其机制可能与细胞周期的G1期阻滞、降低P-gp蛋白表达和抑制BCR/ABL基因表达有关.     

伊马替尼联合槲皮素对K562细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼联合槲皮素诱导K562细胞凋亡的机制。方法:将250 nmol/L的伊马替尼、25μmol/L的槲皮素单药及联合作用于K562细胞,通过细胞计数检测细胞增殖,流式细胞仪分析细胞凋亡,蛋白印迹法检测相关蛋白的表达。结果:250 nmol/L伊马替尼联合25μmol/L槲皮素对K562细胞有明显的协同诱导凋亡作用,两药联合较单药处理能明显协同下调p-BCR/ABL、p-Crkl蛋白的表达。结论:伊马替尼和槲皮素协同诱导K562细胞凋亡,其机制可能是主要通过协同抑制BCR/ABL蛋白磷酸化水平,从而抑制下游信号通路的激活,导致细胞凋亡。     

吲哚美辛显著增强伊马替尼对KCL22和K562/G01细胞的增殖抑制作用

目的:研究吲哚美辛联合伊马替尼对KCL22和K562/G01细胞增殖的抑制作用,并从Wnt/β-Catenin信号通路角度探讨其抗增殖作用的分子机制。方法:采用MTT法明确吲哚美辛在各细胞中的最佳作用浓度及时间;采用MTT法和甲基纤维素集落形成实验检测伊马替尼、吲哚美辛以及两者联合对各细胞增殖能力的影响;采用流式细胞术鉴定细胞周期及细胞凋亡的变化;Western blot检测经两种药物处理的细胞内pβ-catenin(S33/37/T41)、p GSK-3β(Ser9)和C-M YC蛋白的表达情况。结果:吲哚美辛抑制细胞增殖的最佳作用浓度和时间分别为80μmol/L和48 h;吲哚美辛联合伊马替尼对细胞的增殖抑制作用明显优于单一药物处理;在KCL22和K562/G01细胞株中联合用药组的细胞周期均被阻制在G0/G1期;联合用药组的细胞凋亡数目明显高于单一药物处理组;与对照组或单一药物处理组相比,联合用药组细胞内pβ-catenin、β-catenin、p GSK-3β(Ser9)和C-MYC蛋白表达明显下调。结论:吲哚美辛可显著增强伊马替尼对KCL22和K562/G01细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡,并通过抑制Wnt/β-Catenin信号通路调控细胞的增殖。     

p16基因克隆联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病K562细胞作用的研究

目的：探讨p16基因克隆联合伊马替尼对慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞的增殖、周期及凋亡等的调控作用。方法：RT-PCR扩增p16基因，胶纯化回收后连接到T载体测序，序列正确后构建p16-pcDNA3．1载体．将p16-pcDNA3、1与空载体分别以脂质体转染入p16基因缺失的K562细胞。经筛选得到G418抗性的K562细胞株．Westernblot证实转染后有p16蛋白表达。MTT法检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果：反复测序发现，从K562细胞中扩增的DNA片段属于非特异性扩增。证实K562细胞中p16基因缺失。转染p16基因后表达外源性p16蛋白的p16-pcDNA3、1-K562细胞株生长速度明显减慢；伊马替尼作用于已转染p16-pcDNA3、1的K562细胞．其细胞存活率与伊马替尼作用未转染K562细胞及单纯转染p16-pcDNA3．1的K562细胞相比均明显降低。转染p16基因后G0／G1期细胞增多，S期细胞明显减少，p16．pcDNA3．1-K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升。结论：p16基因抑制K562细胞增殖并调节其周期，外源p16联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

高三尖杉酯碱与伊马替尼联合及单用治疗慢性期慢性粒细胞白血病的疗效

目的：以小剂量高三尖杉酯碱（HHT）与伊马替尼联合及单用治疗慢性期慢性粒细胞白血病（CML-CP）．观察血液学缓解率及慢性期变化。为不能全量接受伊马替尼治疗的CML—CP患者探索新的治疗途径。方法：联合治疗组服用伊马替尼100mg／d，HHT2mg／d，连续用药3～4周，间歇4～5周重复。单药组服用HHT2 mg／d，4～8周为1个疗程。结果：2002年2月至2007年2月间可供评估病例45例，超过5年无疾病进展率联合治疗组为94％．单药组为93％。仍保持完全血液学缓解者联合治疗组76％，单药组57％。结论：改变HHT用量及用法，与伊马替尼联合或单用．均能明显提高CML—CP患者的完全血液学缓解率。联合用药疗效优于单药治疗。[著者文摘]     

伊马替尼联合P27基因克隆对慢性粒细胞白血病K562细胞的作用

目的:探讨伊马替尼和P27基因克隆联合作用对K562细胞的细胞增殖、细胞周期及凋亡等的调控作用。方法:RT-PCR扩增P27基因,胶纯化回收后连接到T载体测序,序列正确后构建P27-pcDNA3.1载体,将P27-pcDNA3.1与空载体分别以脂质体转染入P27基因缺失的K562细胞,经筛选得到G418抗性的K562细胞株,Westernblot证实转染后有P27蛋白表达,MTT法检测细胞生长指数和细胞存活率,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果:表达外源性P27蛋白的P27-pcDNA3.1-K562细胞株生长速度明显慢于对照K562细胞株,流式细胞仪显示G0/G1期细胞增多,S期细胞明显减少,P27-pcDNA3.1-K562细胞与伊马替尼联合应用后凋亡细胞比例明显上升,MTT法显示细胞存活率较P27-K562细胞组及伊马替尼-K562细胞组均明显下降(P<0.01vsP27-K562细胞组,P<0.05vs伊马替尼-K562细胞组)。结论:表达外源P27蛋白联合应用伊马替尼对抑制K562细胞增殖及促凋亡方面具有协同作用。     

高三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的时间节律性及其机制研究

本研究旨在观察高三尖杉酯碱（HHT）作用于K562细胞后不同时间点凋亡率的变化及其机制。HHT10ng／ml作用K562细胞后,用MTT法检测不同时间点的细胞增殖活力,Westernblot法检测caspase-3凋亡蛋白表达;流式细胞术检测BCL-2蛋白表达;应用透射电子显微镜观测细胞自噬。结果表明,HHT10ng／ml处理后的前5d,K562细胞增殖活性逐渐下降,但在第6天以后增殖活性又逐渐上升;同时激活型caspase-3蛋白从第1天至第7天逐渐增高,而在第8天明显降低（P〈0．05）;BCL-2蛋白表达水平则呈现先降低后升高（P〈0．05）的特点。细胞自噬体在HHT作用第8天明显增多。结论：HHT作用后,K562细胞凋亡水平变化呈现先升高后下降的特点,其机制与HHT作用后期K562细胞自噬水平升高有关。     

K562/Vp16细胞系中边缘细胞对伊马替尼耐药机制的初步研究

目的进一步阐明白血病细胞对伊马替尼耐药的机制。方法经过对K562细胞系长期的鬼臼乙叉甙（Vp16）诱导和克隆筛选，建立了一株耐药细胞系K562／Vp16，利用干细胞高效能将Hoechst 33342荧光染料泵出细胞的特性，采用流式细胞术从K562／Vp16细胞系中分选出一小群细胞，即边缘细胞（Side population，SP），称为K562／Vp16SP细胞，并初步探讨了其对伊马替尼耐药的机制。结果BCR／ABL和ABL蛋白在K562细胞、K562／Vp16SP细胞及K562／Vp16非SP细胞（K562／Vp16 non-SP）中的表达水平差异无统计学意义；P-gP在K562细胞中不表达，在K562／Vp16SP及K562／Vp16non-SP细胞中均高表达且表达水平一致；与K562／Vp16non-SP细胞比较，K562／Vp16SP细胞对伊马替尼的耐药性更强，并且这种耐药性几乎不能被多种多药耐药逆转剂逆转；另外，体内外实验显示，K562／Vp16细胞的致瘤性几乎全部来源于K562／Vp16SP细胞：结论白血病细胞对伊马替尼具有一定的耐药性，可能与数量极少的SP细胞有直接的关系。因此，这类数量极少的SP细胞应当成为有效治疗肿瘤的靶细胞。     

伊马替尼、高三尖杉酯碱联合治疗慢性粒细胞白血病24例疗效分析

目的探讨慢性粒细胞白血病(CML)应用伊马替尼、高三尖杉酯碱联合治疗的疗效与安全性。方法随机将我院2010年3月—2011年3月收治的初次诊断为慢性粒细胞白血病病例50例分为联合治疗组24例、对照组26例,两组均应用伊马替尼治疗,联合治疗组在该基础上加用高三尖杉酯碱。结果用药3个月后两组血液学缓解率比较无显著差异(P>0.05);用药1年后两组遗传学缓解率有显著差异(P<0.05);两组不良反应比较无明显差异(P>0.05)。结论伊马替尼、高三尖杉酯碱联合治疗CML疗效显著,安全可靠。     

抑制NAMPT表达增强K562细胞对伊马替尼的敏感性及相关机制研究

本研究探讨烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)对K562细胞(人慢性髓系白血病细胞株)对伊马替尼敏感性的影响及其相关机制。在体外合成针对NAMPT基因的小干扰RNA(siRNA),转染K562细胞株。将转染后的K562细胞经1μmol/L伊马替尼作用48 h后,采用PI/Calcein染色方法测定细胞存活率;经不同浓度伊马替尼作用48 h后,采用MTS法测定细胞增殖活性,计算半数抑制浓度(IC50)。未经转染的K562细胞经1μmol/L伊马替尼作用3-48 h后,采用Western blot方法检测NAMPT表达的变化。通过对NCBI GEO中基因表达数据的挖掘分析及Western blot方法检测,探讨NAMPT-siRNA和伊马替尼对凋亡相关基因表达的影响。采用荧光素酶报告基因技术,研究NAMPT-siRNA、伊马替尼对NF-κB转录活性的影响。结果表明,1μmol/L伊马替尼作用于K562细胞48 h对NAMPT表达无明显影响。NAMPT-siRNA能够明显抑制K562细胞NAMPT的表达,再经1μmol/L伊马替尼作用后,NAMPT-siRNA干扰组细胞存活率明显降低(P<0.05),提示抑制NAMPT表达能增强K562细胞对伊马替尼的敏感性。不同浓度伊马替尼作用后,干扰组IC50值明显降低(P<0.05);拟合增殖曲线在0.01-0.1μmol/L伊马替尼浓度范围内斜率增大,提示在此范围内NAMPT-siRNA与伊马替尼的协同作用最强。基因表达谱分析及Western blot验证结果都显示,NAMPT-siRNA和伊马替尼处理均可下调NF-κB下游因子抗凋亡基因Bcl-2表达水平,两者同时作用时效果更明显。NAMPT-siRNA及伊马替尼均能降低NF-κB转录活性,两者同时作用效果更显著。结论:伊马替尼可能并非通过调节NAMPT表达影响细胞存活;抑制NAMPT表达能增强K562细胞对伊马替尼的敏感性,可能与抑制NF-κB及其下游因子Bcl-2有关。     

高三尖杉酯碱对慢性粒细胞白血病细胞及K562细胞端粒酶活性的影响

我们观察了高三尖杉酯碱(HHT)对慢性粒细胞白血病(CML)患白血病细胞及K562细胞端粒酶活性的影响，对HHT治疗CML的作用机制进行初步探讨。     

高三尖杉酯碱对伊马替尼耐药的慢性髓系白血病疗效的研究进展

高三尖杉酯碱(HHT)是一种具有抗肿瘤活性的生物碱,对慢性髓系白血病(CML)有较好的疗效,而且其不良反应较其他抗恶性肿瘤药物低。然而,伊马替尼(IM)治疗CML的显著疗效让HHT逐渐被遗忘。如今,学者们发现,HHT对于伊马替尼耐药的CML患者有临床疗效,从而使HHT再次受到了重视。本文对HHT治疗IM耐药的CML患者的临床疗效及其作用机制作一综述。     

三尖杉酯碱诱导K562细胞凋亡的蛋白质组研究

目的　应用比较蛋白质组技术 ,寻找并鉴定与细胞凋亡相关的蛋白质 ,探讨三尖杉酯碱(HT)促进白血病细胞凋亡的分子机制。方法　应用AnnexinⅤ和PI双染法 ,通过流式细胞术区分HT诱导K5 6 2细胞凋亡早期和凋亡晚期阶段。并进一步运用比较蛋白质组的研究方法 ,对HT诱导K5 6 2细胞凋亡的相关蛋白进行“蛋白差异显示”、质谱鉴定和数据库查询。结果　 10 μg/mlHT作用K5 6 2细胞 5h和 2 4h ,凋亡细胞主群处于凋亡早期和凋亡晚期阶段 ;配比分析对照细胞和凋亡早期及晚期的蛋白图谱 ,统计学分析表明 ,在凋亡晚期组中 3个斑点消失 ,7个斑点表达量显著降低 ,10个斑点表达量显著升高 ;选择 10个表达量改变并且蛋白表达量较大的斑点进行肽指纹谱鉴定 ,其中 5个蛋白斑点鉴定结果比较肯定 ,分别为角蛋白 9、BTF3、色氨酰tRNA合成酶 (tryptophany1 tRNAsyn thetase,TrpRS)、RS和 prohibitin。 结论　在凋亡细胞中TrpRS、RS和 prohibitin表达上调以及BTF3表达下调 ,主要影响核酸转录和蛋白合成。角蛋白 9表达增加是一种凋亡抵抗反应。