干旱胁迫对柴胡中皂苷合成关键酶基因表达及皂苷含量的影响

为了探究干旱胁迫对柴胡皂苷合成关键酶基因表达和皂苷含量的影响,以期从终产物,基因水平揭示柴胡皂苷合成对环境变化的响应。该研究以定植5个月的柴胡苗为研究材料,通过添加聚乙二醇(PEG)模拟干旱环境,利用HPLC测定不同胁迫程度下,柴胡根中皂苷a和d含量的变化,同时以β-tubulin为内参基因,采用荧光实时定量PCR(RT-q PCR)分析皂苷合成途径中4个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR),异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI),法尼基焦磷酸合酶(FPS)和β-香树素合成酶(β-AS)基因的表达。通过研究发现,干旱胁迫处理显著提高了柴胡中皂苷的含量,且当PEG为10%时,柴胡皂苷a和d质量分数最高,分别达到0.648%,0.781%;同时,各基因表达量结果显示,4个关键酶基因的表达均呈现不同程度的上调,其中FPS和β-AS上调极显著(P0.01);此外,相关性分析表明,HMGR,IPPI,FPS,β-AS的表达量和皂苷含量间存在显著正相关关系。因此,干旱胁迫下,柴胡通过调节皂苷合成关键酶基因的表达,来调节次生代谢物皂苷的合成,从而对逆境做出响应。     

外源ABA对北柴胡抗旱性的影响

目的:研究干旱胁迫下外源脱落酸(abscisic acid,ABA)对柴胡抗旱性的影响。方法:以1年生柴胡苗为材料,采用盆栽控水实验法研究了在不同干旱程度(正常水分、轻度干旱、中度干旱和重度干旱)下叶面喷施10、50和100μmol/L的ABA对柴胡苗的生理特性、皂苷含量及皂苷合成途径关键酶基因表达的影响,分析了外源ABA对柴胡抗旱性的影响。结果:在干旱胁迫下,外源喷施50μmol/L ABA能够明显的阻止柴胡苗叶片叶绿素和含水量的降低,阻止柴胡苗体内超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性的减弱,促进了柴胡体内渗透调节物质脯氨酸的积累,抑制了丙二醛含量的升高,增强了柴胡的抗旱性。在干旱胁迫下外源喷施ABA后合成皂苷的关键酶基因的表达呈现了先升高后降低的趋势,当ABA浓度为50μmol/L时皂苷的关键酶基因的表达到最大值,皂苷含量也有所增加。结论:在干旱胁迫下,外源50μmol/L ABA能够提高柴胡1年生苗的抗旱性,同时可显著提高柴胡皂苷合成途径关键酶基因的表达,并且对皂苷含量的增加也有一定的作用。     

干旱胁迫对银柴胡药材活性成分含量的影响研究

目的研究干旱胁迫对银柴胡药材中活性成分含量的影响,以明确干旱胁迫对银柴胡药材质量的影响效应。方法通过盆栽控水试验设置土壤饱和含水量的90%~100%、80%~90%、60%~70%、40%~50%和20%~30%5个水平栽培银柴胡,利用紫外分光光度法对银柴胡药材中总黄酮和总皂苷的含量进行测定。结果随着土壤含水量的降低,银柴胡药材中总黄酮含量逐渐升高,40%~50%和20%~30%处理与充分供水处理差异显著,分别提高了15.34%和20.54%;随着土壤含水量的降低,总皂苷含量呈现出先升高后降低的趋势,80%~90%、60%~70%、40%~50%和20%~30%处理分别较充分供水处理提高了38.08%、34.26%、60.08%和15.87%,差异均达到显著水平。结论干旱胁迫显著提高银柴胡药材中总黄酮和总皂苷的含量,当土壤含水量为40%~50%时,银柴胡药材总黄酮和总皂苷含量均较高,40%~50%供水条件下有利于银柴胡药材质量提高。     

干旱胁迫对银柴胡生长及生理生化特性的影响

采用盆栽试验,设置土壤饱和含水量的90%~100%,80%~90%,60%~70%,40%~50%,20%~30% 5个供水水平,研究水分胁迫对银柴胡生长及生理生化特性的影响。结果表明,随着土壤含水量的降低,银柴胡株高和地上部干重逐渐下降,而根长和根干重均表现为先升高后降低的趋势。随着土壤含水量的降低,脯氨酸含量先下降后明显升高,可溶性蛋白质含量逐渐下降;保护酶SOD和POD均表现为逐渐降低的趋势,CAT表现为先不变后降低的趋势;银柴胡叶片膜透性呈现出逐渐下降的趋势,而MDA含量呈现出先下降后上升的趋势。综上所述,在适度的干旱胁迫下银柴胡可以保持一定的抗渗透胁迫能力和清除活性氧的能力,进而保持膜的稳定。     

北柴胡不同部位柴胡皂苷含量与其关键酶基因表达量的相关性研究

目的筛选适宜北柴胡Bupleurum chinense表达分析的内参基因,并分析不同部位中柴胡皂苷含量与其关键酶基因表达的关系。方法以北柴胡根、茎、叶、果为实验材料,利用实时荧光定量PCR技术,选取Actin、α-tubublin、β-tubulin、Cyclophilin、EF-1α5个常用的内参基因作为候选,以筛选到的最适内参基因为参考分析北柴胡基因ACAT、FPS、HMGR、IPPI、PMD、PMK、SE、SS、β-AS、UGT1、UGT3、UGT6、UGT8、UGT10、P450-7、P450-12的组织表达模式,用HPLC法检测柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d的含量,并用SPSS软件进行相关性分析。结果以5个候选基因(EF-1α、Cyclophilin、Actin、β-tubulin、α-tubublin)中稳定性最好的EF-1α为内参基因,测定北柴胡16个关键酶基因表达量,表明ACAT、PMK、IPPI、SS、SE、UGT1、UGT3、UGT6、UGT8均在地上部分(茎、叶、果)表达量最高,HMGR、β-AS、P450-7、P450-12在根中表达量高于地上部分,PMD、FPS、UGT10则组织差异性不明显。以HPLC法检测柴胡皂苷含量在根中远高于地上部分(茎、叶、果)。相关性分析结果显示,16个关键酶基因间上游ACAT、HMGR、PMD、SE等多与下游P450-7、P450-12、UGT3、UGT6、UGT8等表现出了显著正相关(P0.05),表明关键酶基因相互间密切相关,共同调控柴胡皂苷合成。16个关键酶基因与柴胡皂苷含量的相关性分析结果显示:HMGR、P450-7、P450-12与3种皂苷总和呈极显著正相关(P0.01),β-AS与3种皂苷总和呈显著正相关(P0.05),且HMGR、β-AS、P450-7、P450-12与单体皂苷a、c、d含量均呈显著正相关(P0.05),这4个基因对于皂苷合成积累有重要影响。结论柴胡皂苷合成途径中HMGR、β-AS、P450-7、P450-12基因表达与柴胡皂苷合成积累具有一致性,在调控皂苷合成方面有重要作用。     

基于转录组测序揭示适度干旱胁迫对甘草根基因表达的调控

适度干旱胁迫可促进甘草有效成分的积累,提高药材质量。该研究以栽培6个月的甘草根为材料,设置适度干旱胁迫组(土壤相对含水量40%~45%)和对照组(土壤相对含水量70%~75%),分别应用Illumina HiSeq 2000进行转录组双末端测序,分析甘草根响应适度干旱胁迫的差异表达基因。在适度干旱胁迫组和对照组中分别得到80 490 490,82 588 278个Clean reads,经序列拼接和去冗余处理分别得到94 828,305 100个Unigene序列,序列长度的中位数分别为1 007,1 125 nt。差异表达基因分析表明,适度干旱胁迫抑制细胞壁中β-木糖苷酶、天冬酰胺酰内肽酶、GDP-L-岩藻糖合酶等酶的基因表达,可能抑制根细胞的初生壁降解与程序性细胞死亡;促进萜类、黄酮类化合物生物合成的关键酶基因的表达,进而促进甘草有效成分的积累;促进生长素、乙烯、细胞分裂素的生物合成和信号转导,进而促进根的发生和细胞增殖;促进脱落酸、茉莉酸的生物合成和信号转导,进而提高甘草对干旱胁迫的适应能力;抑制赤霉素、油菜素内酯等激素的生物合成和信号转导,进而抑制地上茎的伸长。     

柴胡生物培养技术与柴胡皂苷合成生物学的研究进展

合成生物学是解析中药活性成分生物合成途径、发掘参与生物合成功能基因的一门新兴学科。柴胡是我国常用大宗中药材,药用价值显著。柴胡皂苷是其指标性成分,具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等显著活性。但目前野生柴胡资源遭到破坏,人工栽培过程中存在一定问题。生物培养技术及合成生物学的应用可扩大柴胡皂苷的来源,保护柴胡资源。不同植物的培养条件没有固定模式可遵循,不同药用活性成分的生物合成途径也是不一致的。目前,尚无柴胡组织培养技术及柴胡皂苷生物合成途径研究的综述报道。该文拟介绍合成生物学过程中用到的愈伤组织培养、不定根培养、毛状根培养与悬浮细胞培养等生物培养技术与柴胡皂苷生物合成途径及其关键酶功能基因的研究进展,建议通过借鉴其他传统根类药材的组织培养技术,对柴胡的生物培养技术进行优化,为深入研究柴胡皂苷的生物合成途径与代谢调控提供参考。     

不同产地北柴胡中柴胡皂苷含量与土壤因子的关系

目的土壤是影响中药材活性成分形成和积累的重要生态因子,以11个省市自治区29个样地野生和栽培北柴胡Bupleurum chinense为研究材料,采用数学统计分析方法探讨柴胡皂苷积累与土壤因子的关系,为实施土壤生态调控提高北柴胡品质提供依据。方法采用高效液相色谱法(HPLC)分析不同产地北柴胡柴胡皂苷a、c、d、e、f的含量;采用常规方法测定土壤样品的pH、有机质、电导率、全氮、碱解氮、速效磷、速效钾、有效镁、有效铁、有效铜、有效锰;通过聚类分析研究不同产地北柴胡皂苷差异;通过主成分分析解释不同产地土壤因子差异;通过Pearson相关性分析研究土壤因子与北柴胡柴胡皂苷含量的关系。结果北柴胡的柴胡皂苷测定结果显示河南禹州的柴胡皂苷含量最高,其中柴胡皂苷a和d的含量分别为0.71%、0.80%。对不同产地进行聚类分析,根据柴胡皂苷差异29个样地分为3类。对柴胡皂苷含量与土壤因子进行Pearson相关性分析表明,土壤的有机质、有效铁与各柴胡皂苷之间呈极显著正相关(P0.01),有效铜、有效镁与各柴胡皂苷之间呈显著负相关(P0.05)。不同产地土壤主成分分析表明,得分较高的是样地9、10、11、14、19、28,这与不同产地北柴胡柴胡皂苷含量聚类分析的结果基本一致;通过对不同产地北柴胡主要土壤指标分析发现,在一定范围内土壤中有效铁含量与柴胡皂苷含量显著正相关,这与Pearson相关性分析结果基本一致。结论研究结果提示在北柴胡生产实践中可以通过提高土壤有机质含量,增施铁肥等农艺措施调控北柴胡柴胡皂苷含量。     

北柴胡皂苷生物合成途径关键酶IPPI的全长cDNA克隆及其序列分析

目的克隆北柴胡皂苷生物合成途径关键酶异戊烯基焦磷酸异构酶(EC 5.3.3.2,isopentenyl diphosphate isomerase,IPPI)的全长cDNA,为研究柴胡皂苷的生物合成与基因调控奠定基础。方法 PCR矩阵法快速筛选北柴胡全长cDNA文库。结果获得了北柴胡IPPI的全长cDNA(GenBank No.gq433719),其核苷酸序列长1 117bp,编码319个氨基酸的蛋白。NCBI Blastx结果显示与胡萝卜Daucus carotasubsp.sativus(abb52064)的IPPI氨基酸序列相似性最高,一致性为92%,相似度为97%。保守结构域搜索显示含有IPPI共有的催化活性位点、金属结合位点及Nudix基序。TargetP1.1和SignalP3.0分析表明北柴胡IPPI N端含有长26 bp的叶绿体信号肽。结论首次克隆了北柴胡IPPI的全长cDNA,将促进后续北柴胡IPPI基因表达特性及其在柴胡皂苷合成代谢中功能的研究。     

春季水分胁迫对川芎叶片相对含水量及保护酶活性的影响

目的:研究春季不同时期持续干旱和饱和水分处理对川芎叶片水分状况、质膜透性和保护酶活性等生理生化特性的影响.方法:采用盆栽法,测定川芎叶片各生理生化指标.结果:干旱胁迫下,随着处理天数的增加,土壤相对含水量(SRWC)和叶片相对含水量(RWC)持续下降,丙二醛(MDA)含量和质膜相对透性明显增加,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性呈现先上升后下降的趋势,过氧化物酶(POD)活性呈现上升趋势.饱和水分处理对上述指标的影响趋势与干旱处理大体一致,但影响的程度较小.结论:长时间的干旱和饱和水分处理均对川芎造成伤害,干旱处理的伤害程度要高于饱和水分处理,本试验得出土壤相对含水量为60%左右最适宜川芎生长.     

HPLC-ELSD测定柴胡总皂苷中柴胡皂苷a、d的含量

目的:应用高效液相色谱-蒸发光散射(HPLC-ELSD)检测柴胡总皂苷中柴胡皂苷a、d的含量。方法:柴胡以碱性乙醇进行提取,AB-8大孔吸附树脂分离纯化,得到柴胡总皂苷,用HPLC-ELSD法测定柴胡皂苷a、d的含量。结果:柴胡总皂苷中柴胡皂苷a、d的含量分别为4.31%,12.86%,柴胡皂苷a、d分别在0.09～0.72μg、0.16～1.08μg范围内呈良好的线性关系,加样回收率分别为102.39%、102.00%,RSD分别为1.95%、2.21%。结论:HPLC-ELSD测定柴胡总皂苷中柴胡皂苷a、d含量,方法简便,结果可靠,可作为柴胡提取物质量控制的检测方法。     

北柴胡不同炮制品柴胡皂苷a含量及急性毒性实验比较研究

目的 :对北柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a的含量和急性毒性大小进行比较研究,探讨炮制对北柴胡柴胡皂苷a含量与毒性的影响。 方法 :运用HPLC法、经典急性毒性实验法,进行北柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a的含量测定及急性毒性比较研究。 结果 :北柴胡生品,清炒品,醋炙品,酒炙品和蜜炙品不同炮制品中柴胡皂苷a的百分含量依次为0.60%,0.23%,0.56%,0.39%,0.35%。北柴胡生品,清炒品,醋炙品,酒炙品和蜜炙品没有出现死亡,测得最大给药量(MLD)值按含生药量计算分别为26.4,31.2,27.6,28.8,32.4 g ·kg^-1,分别相当于临床70 kg人每公斤体重日用量的205,242,214,224,252倍,连续观察14 d,小鼠一般状况良好,无一死亡。 结论 :北柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a含量和毒性各不相同,且各样品均未出现死亡,其最大给药量显示北柴胡的各炮制品基本安全低毒,提示炮制对北柴胡药材柴胡皂苷a含量和安全剂量范围大小有一定影响。     

炮制对柴胡药材中 4 种柴胡皂苷的影响

 目的 建立生柴胡、醋柴胡和酒柴胡中柴胡皂苷 a 、 b₂ 、 b₁ 、 d 的 HPLC 含量测定方法,并比较炮制前后 4 种柴胡皂苷的含量的变化。 方法 采用 Hypersil C₁₈ 色谱柱（ 4.6 mm×250 mm , 5 μm ）;流动相：乙腈 - 水,梯度洗脱（ 0 ～ 50 min ： 30∶70 → 50∶50 ）;流速： 1.0 mL·min^-1 ;柱温： 30 ℃ ;检测波长： 210 和 254 nm 。 结果 柴胡经不同的方法炮制后, 4 种柴胡皂苷的含量有不同程度的变化。 结论 本方法简便、可靠、重现性好,可用于柴胡及其炮制品中柴胡皂苷 a 、 b₂ 、 b₁ 、 d 的含量测定,并为全面控制其质量提供参考,为深入探讨柴胡炮制的意义,提供一定的实验依据。     

河北省涉县不同采样点柴胡药材中柴胡皂苷的含量比较

目的考察河北省涉县境内不同采样点的柴胡药材中柴胡皂苷a,d的含量,为柴胡的质量标准提供一定依据。方法采用《中国药典》中柴胡项下柴胡皂苷的含量测定方法,用HPLC法测定不同产地柴胡中柴胡皂苷a,d的含量。结果柴胡皂苷a含量在1.8847~4.6681 mg·g~(-1)范围内,柴胡皂苷d含量在1.8600~6.4988 mg·g-1范围内,二者之和含量在3.8323~10.7973 mg·g~(-1)范围内。结论不同产地的柴胡药材中柴胡皂苷a,d的含量差异较大,二者之和含量均高于《中国药典》规定含量,与河北省涉县是柴胡主产区的历史地位相一致。     

不同炮制方法对北柴胡中柴胡皂苷含量的影响

目的测定北柴胡不同炮制品(蜜炙北柴胡和麸炒北柴胡)中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。方法采用高效液相色谱法;Ultimate XB-C18色谱柱(4.6mm×250mm,0.45μm);流动相:乙腈-水;流速:1.0ml/min;检测波长:210nm;柱温:30℃;采用梯度洗脱法测定北柴胡不同炮制品中柴胡皂苷a和皂苷d的含量。结果生柴胡和麸炒北柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量均高于蜜制北柴胡中的柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量。结论不同炮制方法对北柴胡中柴胡皂苷a、d含量影响不同。     

水分胁迫对甘草光合作用及生物量的影响

目的:研究水分对甘草光合特性及生物量的影响,明确甘草生长的最佳土壤含水量。方法:采用盆栽方法,设置了4个水分梯度。结果:在20%~70%土壤体积含水量范围内,随着水分含量增加,甘草光合速率逐渐增加,水分利用效率也呈上升趋势。土壤含水量50%时甘草根系及茎生物量最大。在严重干旱胁迫下,各器官生物量均明显下降。结论:50%的土壤含水量有利于甘草根系生物量的积累,有利于提高人工种植甘草的药材产量。     

柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因片段的克隆与序列分析

本文以北柴胡幼嫩根的总RNA为模板，通过RT—PCR方法，克隆出3-羟基-3甲基戊二酰辅酶A还原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coeflzyme A reductase，HMGR）、异戊烯基焦磷酸异构酶（isopentenyl diphosphate isomerase，IPPI）和法尼基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，FPS）基因的cDNA片断，大小分别为470bp、532bp、466bp，分别编码157、177、155个氨基酸多肽。提交到Gen—Bank上，得到登陆号分别为：HMGR（EU400217）、IPPI（EU400218）、FPS（EU400219）。NCBI在线blast结果表明，推断的北柴胡HMGR、IPPI和FPS基因的氨基酸序列分别与杜仲、三岛柴胡和雷公藤的一致性最高，分别为93％、99％、97％。对HMGR基因和FPS基因进行特征性保守域分析，结果显示，推断的HMGR氨基酸序列存在两个NADPH结合基序，FPS存在三个特征性保守序列：DDIMD、GQMID和KL。构建的植物IPPI的分子进化树表明，北柴胡IPPI基因与伞形科植物（胡萝卜和三岛柴胡）亲缘关系最近，与单子叶植物（玉米和水稻）亲缘关系较远。本文首次分离报道了北柴胡柴胡皂苷合成途径中三个关键酶基因（HMGR、IPPI和FPS）cDNA的克隆，新获得的基因片段序列为进一步克隆全序列和了解调控柴胡皂苷的生物合成奠定了基础。     

不同溶剂对柴胡中柴胡皂苷a溶出效果的影响

目的:基于目前柴胡提取溶剂无一定论的现状,考察并确定柴胡的最佳提取溶剂。方法:采用高效液相色谱法测定不同溶剂对药材中柴胡皂苷a的提取量。结果:中性乙醇-水溶剂系统中,50%乙醇对柴胡皂苷a的提取效率最高,碱性乙醇-水溶剂系统中,碱性50%乙醇的效果较好,且效果优于50%乙醇。结论:当提取的目的仅是柴胡皂苷a时,用碱性50%乙醇作为提取溶剂,其他情况,建议采用50%乙醇作为柴胡的提取溶剂。     

干旱及盐胁迫对黄芩种子萌发和黄酮合成关键酶活性的影响

目的:研究干旱及盐胁迫模拟条件下黄芩种子萌发及黄酮合成关键酶活性,解析黄芩种子萌发生长的抗性能力及黄酮合成路径关键酶活性的变化。方法:测定不同浓度聚乙二醇(PEG-6000)与盐(NaCl)胁迫下黄芩种子的发芽势、发芽率、相对发芽率、发芽指数、活力指数及幼苗的苗高、根长、鲜重,并对苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)、4-香豆酰-CoA连接酶(4CL)、査耳酮合成酶(CHS)、黄酮合成酶(FNS)5个黄芩黄酮合成关键酶活性进行测定。结果:5%PEG-6000溶液干旱胁迫浓度对黄芩种子萌发影响较小,当PEG-6000浓度5%、NaCl浓度50 mmol/L时,各萌发指标呈降低趋势,对黄芩种子萌发生长抑制作用明显增强。黄酮合成关键酶活性整体呈现先升高后降低的趋势,但升降幅度存在差异。结论:黄芩具有一定的抗旱耐盐能力,PEG-60005%、NaCl50 mmol/L的胁迫浓度对黄芩种子萌发生长具有抑制作用,适度干旱及盐胁迫能提高黄酮合成关键酶活性。     

藏柴胡以及种植北柴胡和竹叶柴胡的皂苷含量研究

目的及方法:分别采用紫外分光光度法和HPLC法测定了藏柴胡(来源于窄竹叶柴胡Bupleurum marginatum var.stenophyllum)及种植北柴胡(B.chinese)和竹叶柴胡(B.marginatum)中柴胡总皂苷、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量。结果:总皂苷含量藏柴胡为2.93%~5.86%,北柴胡为1.56%~2.25%,竹叶柴胡为1.83%~2.50%;柴胡皂苷a+d含量藏柴胡为2.03%~3.95%,北柴胡为0.46%~1.28%,竹叶柴胡为0.88%~1.90%。结论:藏柴胡种植量正以甘肃为中心不断扩大,其中柴胡皂苷含量显著高于其他柴胡,将产生不同的临床效果,应引起充分重视。