木香烃内酯通过JAK/STAT通路抑制K562细胞增殖研究

目的:探讨木香烃内酯对慢性髓系白血病细胞系K562细胞的增殖抑制作用及机制。方法:采用CCK-8法检测木香烃内酯对K562细胞的增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,Western blot检测相关蛋白的表达。结果:木香烃内酯能够明显抑制K562细胞增殖,其24 h半数有效抑制浓度(IC50)约为(15.70±2.13)μmol/L(P<0.05);15μmol/L木香烃内酯分别作用K562细胞0、24和48 h均能够诱导K562细胞凋亡,凋亡率由(1.77±0.59)%分别增加到(17.68±2.84)%、(30.65±4.54)%(P<0.05);木香烃内酯能够明显增加细胞内ROS的水平,由(3.52±1.08)%分别增加到(23.56±3.52)%,(36.68±4.22)%(P<0.05);木香烃内酯能够显著降低BCL-2、p-JAK2、p-STAT3的表达,上调BAX、细胞色素C、cleaved-caspase-3、cleaved-PARP的表达水平。结论:木香烃内酯能够通过JAK/STAT信号通路诱导K562细胞凋亡,从而抑制其细胞增殖。     

藤黄酸对白血病K562/A02细胞的耐药逆转作用

本研究旨在探讨藤黄酸(gambogic acid,GA)对K562/A02细胞株的耐药逆转作用及其逆转机制。采用MTT法检测GA对K562和K562/A02细胞的增殖抑制作用及对K562/A02细胞阿霉素(ADM)耐药逆转效应;用流式细胞术检测GA联合ADM对K562及K562/A02细胞凋亡率的影响;DAPI荧光染色观察ADM联合GA作用后细胞的形态学改变;Western blot法检测K562及K562/A02细胞P-糖蛋白(P-gp)、存活蛋白(Survivin)基因的表达。结果表明:ADM作用48 h抑制K562和K562/A02细胞增殖的IC50值分别为(1.42±0.07)μg/ml和(28.42±1.40)μg/ml。GA≤0.0625μmol/L时,对K562及K562/A02细胞株无明显增殖抑制作用;0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞能增加其对ADM的敏感性,耐药逆转倍数为1.53。0.0625μmol/L GA联合ADM作用于K562/A02细胞48 h能提高细胞的凋亡率(P<0.05),下调Survivin及P-gp蛋白的表达(P<0.05)。结论:GA可以逆转K562/A02细胞的耐药性,增强耐药细胞对ADM的敏感性,其机制可能与提高K562/A02细胞凋亡、下调Survivin和P-gp蛋白的表达有关。     

雷公藤红素提高人白血病细胞化疗敏感性的实验研究

目的探讨雷公藤红素提高人白血病多药耐药细胞株(K562/A02)化疗敏感性的作用及其机制。方法白血病细胞株K562和多药耐药细胞株K562/A02,培养至对数生长期分成6组,分别为K562/A02阴性组、K562/A02+62.5μmol/L雷公藤红素组、K562/A02+125μmol/L雷公藤红素组以及K562阴性组、K562+62.5μmol/L雷公藤红素组、K562+125μmol/L雷公藤红素组;设置K562+硼替佐米4nmol/L为阳性对照组。采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;采用反转录PCR法检测各组细胞中核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)、survivin、死亡受体5(death receptor 5,DR5)mRNA表达水平;应用流式细胞术检测DR5蛋白阳性表达率。结果K562阴性组与K562+62.5μmol/L雷公藤红素组细胞凋亡率[(5.110±0.803)%、(6.283±0.889)%]以及K562/A02阴性组与K562/A02+62.5μmol/L雷公藤红素组细胞凋亡率[(7.203±0.275)%、(8.753±0.951)%]比较差异均无统计学意义(P0.05);K562/A02阴性组NF-κB mRNA(0.863±0.073)、survivin mRNA(0.989±0.018)、DR5 mRNA(0.114±0.037)表达水平高于K562阴性组(0.262±0.074、0.267±0.056、0.050±0.011)(P0.05);K562+62.5μmol/L雷公藤红素组、K562+125μmol/L雷公藤红素组NF-κB mRNA(0.210±0.053、0.128±0.076)、survivin mRNA(0.199±0.064、0.228±0.030)表达水平均低于K562阴性组,DR5mRNA表达水平(0.312±0.075、0.464±0.073)表达水平高于K562阴性组(P0.05);K562/A02+62.5μmol/L雷公藤红素组、K562/A02+125μmol/L雷公藤红素组NF-κB mRNA(0.492±0.040、0.359±0.069)、survivin mRNA(0.516±0.042、0.348±0.047)表达水平均低于K562/A02阴性组,DR5mRNA表达水平(0.470±0.034、0.519±0.048)均高于K562/A02阴性组(P0.05);K562+62.5μmol/L雷公藤红素组、K562+125μmol/L雷公藤红素组DR5蛋白阳性表达率[(5.438±0.517)%、(6.250±0.897)%]高于K562阴性组[(0.093±0.015)%](P0.05),K562/A02+62.5μmol/L雷公藤红素组、K562/A02+125μmol/L雷公藤红素组DR5蛋白阳性表达率[(19.900±0.526)%、(20.703±1.045)%]高于K562/A02阴性组[(6.980±0.925)%](P0.05)。结论雷公藤红素提高K562/A02耐药细胞株化疗敏感性的作用可能与下调NF-κB、survivin表达,上调DR5表达有关。     

葡萄糖神经酰胺合成酶抑制剂PDMP对K562/A02细胞柔红霉素耐药逆转的研究

本研究旨在探讨葡萄糖神经酰胺合成酶(glucosylceramide synthase,GCS)抑制剂D,L-threo-1-phenyl-2-decanoylamino-3-morpholino-1-propanol(PDMP)hydrochloride对K562/A02细胞株柔红霉素(daunorubicin,DNR)耐药的逆转作用及其逆转机制。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测不同浓度PDMP对K562细胞和K562/A02细胞的增殖抑制效应及其对K562/A02细胞DNR耐药逆转作用;用流式细胞术检测PDMP对K562/A02细胞内DNR浓度及细胞凋亡率的影响;半定量RT-PCR和Western blot方法检测K562及K562/A02细胞mdr1、GCS基因的表达以及PDMP对K562/A02细胞两种基因表达的影响。结果表明:DNR对K562和K562/A02细胞的IC50分别为0.23±0.02和7.15±0.24μg/ml,当PDMP≤20μmol/L时,对K562及K562/A02细胞株无明显生长抑制作用;20μmol/L和10μmol/L PDMP均能增加K562/A02细胞对DNR的敏感性,其耐药逆转倍数分别为2.59和1.69;两种浓度PDMP作用于耐药株48小时后能增加细胞内DNR浓度(p0.05)和细胞凋亡率(p0.01)。20μmol/L PDMP处理K562/A02细胞48小时后可在mRNA和蛋白水平下调GCS和mdr1基因的表达(p0.01)。结论:PDMP可以增强K562/A02细胞对DNR的敏感性,其机制可能与增加细胞内药物浓度及细胞凋亡率、下调GCS和mdr1基因表达有关。     

Src激酶抑制剂ZD6474对白血病耐药细胞系K562/A02细胞增殖的影响及其作用机制探讨

目的 研究Src激酶抑制剂ZD6474对K562及其耐药株K562/A02细胞增殖的影响及其作用机制.方法 用不同浓度ZD6474处理K562、K562/A02细胞,观察细胞的增殖情况;用流式细胞术分析细胞周期的变化;用Western blot法分析ZD6474处理前后K562/A02细胞Src激酶及其磷酸化水平.用K562和K562/A02细胞建立裸鼠皮下移植瘤模型,待肿瘤直径达到0.5 ～1.0 cm,灌胃方法每天给予25、50及100 mg/kg ZD6474,生理盐水灌胃作为对照,观察ZD6474对裸鼠移植瘤的影响.并对移植瘤组织进行HE染色和免疫组化染色检测Src激酶表达(末次给药后24h)的改变.结果 ZD6474呈剂量依赖的方式抑制K562和K562/A02细胞增殖,作用48 h的IC50值分别为(1.61±0.07)μmol/L和(3.22±0.21) μmol/L.6μmol/L ZD6474分别作用K562和K562/A02细胞24 h,可以诱导G0/G1期细胞分别由(40.2±9.4)％、(25.0±7.0)％提高至(76.3±6.1)％、(54.2±6.6)％.6 μmol/L ZD6474可呈时间依赖方式抑制磷酸化(p)-Src和Src激酶的表达.用灌胃方法给予ZD6474,连续给药18 d,50 mg/kg ZD6474对K562和K562/A02移植瘤的抑制率分别为43.7％和56.3％.结论 ZD6474可通过抑制Src激酶磷酸化水平诱导K562/A02细胞凋亡;体内给药可抑制裸鼠移植瘤的生长.     

去氢木香内酯对K562增殖的抑制作用及其机制

目的:探讨去氢木香内酯对慢性髓系白血病细胞系K562细胞的增殖抑制作用及其机制。方法:应用CCK-8法检测细胞增殖抑制率,采用流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期,Western blot检测相关蛋白的表达。结果:CCK-8检测结果显示,4、6、8、10、12μmol/L去氢木香内酯能够明显抑制K562细胞增殖,作用24 h抑制率分别为(24.32±3.05%)、(42.91±3.89%)、(46.35±4.93%)、(77.06±5.42%)、(89.04±4.25%),对照组为(2.08±0.27%),差异有统计学意义(P 0.05);5、10μmol/L去氢木香内酯能够诱导K562细胞凋亡,与对照组相比凋亡率由(2.73±0.46%)分别增加到(14.43±2.52%)、(31.71±3.58%)(P 0.05);去氢木香内酯能够使细胞周期阻滞在G_2/M期,G2/M期细胞比例由(8.53±1.71%)分别增加到(17.42±2.72)、(31.79±4.38%)(P 0.05);去氢木香内酯能够显著抑制BCL-2、CyclinB1、CDK1、BCR/ABL、STAT5、STAT3等的表达,上调BAX、p21的表达水平。结论:去氢木香内酯通过BCR/ABL-STAT信号通路抑制K562细胞增殖,诱导K562细胞凋亡。     

尼洛替尼联合5-溴汉防己甲素逆转K562/A02细胞耐药的研究

目的 探讨尼洛替尼、5-溴汉防己甲素(BrTet)及其联合应用对K562/A02细胞多药耐药的逆转作用及其机制.方法 尼洛替尼、BrTet单独或联合作用于K562/A02细胞,应用MTY法检测细胞增殖抑制率、流式细胞术检测细胞凋亡率、RT-PCR检测mdr1 mRNA的表达及Western blot分析P糖蛋白(P-gp)的表达的情况.结果 5 nmol/L尼洛替尼和0.5μmol/L BrTet单独使用48 h后,柔红霉素(DNR)对K562/A02细胞的IC50分别为4.52 mg/L和5.41 mg/L,联合使用后,DNR对K562/A02细胞的IC50降为2.98 mg/L.单用DNR、尼洛替尼和BrTet均不能增加K562/A02细胞凋亡率(P>0.05),DNR联合尼洛替尼和BrTet后细胞凋亡率明显增高.单用5 nmol/L尼洛替尼和0.5μmol/L BrTet 48 h后,K562/A02细胞mdr1 mRNA灰度值为0.48±0.04、0.64±0.01,两者合用K562/A02细胞mdr1 mRNA灰度值下降为0.35±0.04.单用5 nmol/L尼洛替尼作用48 h,P-gp的表达水平为0.61±0.05;单用0.5μmoL/L BrTet作用48 h,P-gp的表达水平为0.52 ±0.02;两者合用K562/A02细胞P-gp的表达水平降为0.44±0.03.结论 单独应用尼洛替尼和BrTet均可部分逆转K562/A02细胞的耐药,机制可能与降低mdr1 mRNA和P-gp的表达及增加K562/A02细胞凋亡有关,并且两药联用具有明显的协同作用.     

低氧诱导因子-1α抑制剂逆转K562/A02细胞多药耐药机制研究

目的 探讨低氧诱导因子抑制剂3-(5'-Hydroxymethyl-2'-furyl)-1-benzylindazoh(YC-1)对人白血病耐阿霉素细胞K562/A02的耐药逆转作用,并探讨逆转机制.方法 采用MTT法检测不同浓度YC-1和阿霉素(ADM)单独或联合使用48 h对K562/A02细胞和K562细胞增值抑制效应及耐药逆转效应;用流式细胞术检测0、5、10和20 μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素作用K562/A02细胞48 h后细胞凋亡率及联合应用后细胞内阿霉素浓度;半定量RT-PCR检测各组细胞低氧诱导因子-1α(HIF-1α)、mdr1基因mRNA表达变化;Western blot方法检测各组细胞HIF-1α、P-糖蛋白(P-gp)表达变化.结果 K562与K562/A02细胞对阿霉素的IC50值分别为(1.56±0.07)mg/L和(42.98±3.15)mg/L,耐药倍数为27.55倍.予5、10和20μmol/L YC-1作用后,K562/A02细胞对阿霉素的耐药倍数分别为24.63、16.38和10.71倍;0、5、10和20μmol/L YC-1单独或联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后,凋亡率分别为(1.9±0.9)%、(4.9±0.9)%、(5.8±1.1)%和(9.3±1.4)%与(2.3±0.7)%、(8.2±1.2)%、(19.0±1.7)%和(34.5 ±2.4)%.0、5、10和20 μmol/L YC1联合1 mg/L阿霉素处理K562/A02细胞48 h后细胞内阿霉素荧光强度分别为232±33、1300±219、1961±240和3342±269;随着YC-1浓度增加,HIF-1α mRNA表达没有明显差异,mdr1 mRNA逐渐下调,HIF-1±和P-gp表达均下调.结论 YC-1可以通过抑制HIF-1α蛋白表达,下调mdr1 mRNA水平和P-gp水平,增加细胞内阿霉素药物浓度,部分逆转K562/A02细胞耐药.     

甲异靛对K562细胞bcr-abl信号通路的影响以及诱导细胞凋亡机制研究

目的 探讨甲异靛对K562细胞bcr-abl信号通路的影响以及甲异靛诱导K562细胞凋亡的机制.方法 应用流式细胞术检测甲异靛诱导K562细胞凋亡的情况以及线粒体膜电位稳定性.应用Western blot技术检测bcr-abl信号通路相关蛋白、caspase以及Bcl-2家族成员在甲异靛作用前后的表达情况.RT-PCR技术检测甲异靛作用前后bcr-abl mRNA表达水平,用电泳移动迁移速度分析检测STAT3、STATS的DNA结合能力.结果 20 μmol/L甲异靛町降低ber-abl融合蛋白的表达及其磷酸化水平,但并不改变其mRNA表达水平,甲异靛可降低STATS以及CRKL的磷酸化水平,抑制STAT3、STATS的DNA结合能力.5-20μmoL/L甲异靛可诱导K562细胞凋亡并且具有浓度依赖性.甲异靛诱导K562细胞凋亡中伴随caspase 3、8、9活化以及细胞线粒体膜电位降低,caspase 3、8、9特异抑制剂z-DEVD-fmk、z-IETD-cho和z-LETD-fmk可阻断甲异靛诱导的K562细胞凋亡.甲异靛诱导K562细胞凋亡前后不伴有Bcl-2、Bax、Bid蛋白表达水平的改变.结论 甲异靛通过降低bcr-abl融合蛋白的表达并抑制bcr-abl信号通路中相关蛋白活性从而抑制K562细胞的增殖.甲异靛诱导K562细胞凋亡依赖于caspase活化以及线粒体途径,但Bcl-2家族成员不参与凋亡的调控.     

HMGB1基因沉默对阿霉素诱导K562/A02细胞凋亡增敏作用的研究

目的 探讨高迁移率族蛋白1(HMGB1)基因沉默对白血病细胞耐药逆转的作用.方法 将HMGB1基因特异性干扰RNA(HMGB1 siRNA)导入K562/A02细胞中,通过Western blot和RTPCR方法检测HMGB1基因在转染前后的表达;WST8法检测阿霉素(ADM)对转染前后K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术检测凋亡细胞百分率;Western blot检测线粒体促凋亡蛋白Smac/DIABLO的释放;采用caspase活性定量检测试剂盒分析caspase-3的活性.结果 ①与未经处理的K562/A02细胞组相比,转染HMGB1 siRNA的K562/A02细胞组HMGB1 mRNA和蛋白水平分别下降86%和71%;②HMGB1基因沉默使K562/A02细胞对ADM的药物敏感性增强,其IC50值从转染前的(4.83±0.08)μg/ml降低到(1.33±0.10)μg/ml,并在ADM浓度为1μg/ml和5μg/ml时,细胞凋亡百分率分别增加27%、32%;③HMGB1基因沉默可促进ADM所致Smac/DIABLO从线粒体向胞浆释放,并增加caspase-3的活性.结论 HMGB1基因沉默能明显增加K562/A02细胞对ADM的敏感性,逆转K562/A02细胞对ADM耐药.     

2-甲氧基雌二醇诱导K562细胞凋亡及机制研究

本研究探讨2-甲氧基雌二醇（2-ME2）对K562细胞的诱导凋亡作用及其机制。采用不同浓度2-ME2处理K562细胞,MTT法检测K562细胞的增殖活性,DNA琼脂糖凝胶电泳和Annexinv／PI双染色法检测K562细胞的凋亡效应,流式细胞术检测细胞线粒体膜电位的变化,RT-PCR和Western blot方法分别检测相关基因mRNA和／或蛋白的表达变化。结果表明：2-ME2抑制K562细胞增殖呈时间和剂量依赖性;48小时的半数抑制浓度（IC。）为2μmol／L;2μmol／L2-ME2作用于K562细胞24、48、72小时,DNA凝胶电泳分析可见典型DNA梯形条带;Annexinv／PI双染色法检测显示,细胞凋亡率分别为13．78％、22．32％和29．43％,而对照组凋亡率仅为1．78％（P〈0．05）;1、2和4μmol／L2-ME2分别处理K562细胞24小时,流式细胞术检测显示细胞线粒体膜电位下降;2μmol／L2-ME2处理K562细胞24、48和72小时,K562细胞中bcr／abl、bcl-2mRNA表达下调,而baxmRNA表达上调,Bcl-2、procaspase-3、procaspase-9、PARP（116 kD）和p-Akt蛋白表达下调,胞浆Cyto-C和PARP活性片段（85kD）表达上调,而对总Akt蛋白表达无影响。结论：2-ME2通过升高bax／bcl-2比值降低线粒体膜电位、促使细胞色素C（Cyto-c）释放入胞浆、触发K562细胞的线粒体凋亡途径,活化caspase-3,导致K562细胞凋亡并抑制其增殖;通过下调bcr／ab1 mRNA表达以阻断P13K／Akt信号通路也参与了该过程。     

赤芍总苷诱导K562细胞凋亡及对线粒体膜电位和Ca2+的影响

目的:赤芍总苷能诱导鼠HepA和S180细胞凋亡,但赤芍总苷能否抑制K562细胞增殖及其诱导K562细胞凋亡的机制尚不明确.观察赤芍总苷诱导人红白血病细胞株K562细胞凋亡及线粒体膜电位与Ca2 水平的变化,以探讨凋亡机制.方法:实验于2007-03-02/2007-10-20在北京中医药大学细胞生化实验室,国家重点实验完成.①实验材料:赤芍总苷由西安奥晶科技发展有限公司提供,批号:060417,纯度>95%.人红白血病K562细胞株购自上海中科院细胞库.②实验方法:取对数生长期的K562细胞,培养24 h后加入50 mg/L赤芍总苷进行干预,光镜下观察细胞形态.MTT显色法检测25,50,75,100,150,200,400 mg/L赤芍总苷对K562细胞增殖的抑制作用,以仅加入无血清培养基培养的为对照.③实验评估:采用Annexin V/PI双标记法检测凋亡效应,罗丹明123(Rh123)染色流式检测线粒体膜电位和荧光染料Fluo-3AM流式检测K562细胞内游离Ca2 浓度.结果:①50 mg/L 赤芍总苷作用K562细胞24 h后,出现核固缩、核碎裂和凋亡小体等形态学改变.②与对照组相比,不同质量浓度赤芍总苷能明显抑制K562细胞的增殖(P < 0.01),并具有量效关系,呈时间和剂量依赖性.③细胞线粒体经Rh123染色呈现明亮绿,不同质量浓度赤芍总苷干预组荧光强度均较对照组明显减弱,膜电位水平较高.④赤芍总苷可引起细胞线粒体膜电位下降.不同质量浓度赤芍总苷组细胞内游离Ca2 浓度均升高, 线粒体膜电位下降,与对照组比较差异显著(P < 0.01).结论:赤芍总苷诱导K562细胞凋亡的可能机制是通过减低细胞内线粒体膜电位及提高游离Ca2 水平,从而导致细胞凋亡.     

土木香内酯对RPMI-8226细胞的增殖抑制作用及其相关机制研究

目的:探讨土木香内酯(alantolactone)对多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖、凋亡的影响,并分析其可能的作用机制。方法:使用浓度为1、2.5、5、7.5及10μmol/L的土木香内酯处理RPMI-8226细胞48 h,应用CCK-8检测细胞活力,并计算其半数抑制浓度(IC50)值;使用浓度为2.5,5及7.5μmol/L的土木香内酯处理RPMI-8226细胞48 h后,应用AnnexinV/PI双标记法分析细胞凋亡;Western blot方法检测呈切割的caspase-3及ERK信号通路的变化;裸鼠荷瘤并给予土木香内酯以进一步验证其对多发性骨髓瘤细胞的促凋亡作用。结果:土木香内酯可抑制RPMI-8226细胞活力,并呈现剂量依赖效应(r=-0.9784,P=0.0007);RPMI-8226细胞48 h的IC50为4.32±0.15μmol/L;流式细胞术分析凋亡结果显示,随着土木香内酯浓度的增高,细胞早期凋亡率显著增加(r=0.9601,P0.05);Western blot结果显示,土木香内酯处理RPMI-8226细胞后,活化了caspase-3,降低ERK磷酸化水平;体内结果显示,给药组小鼠瘤体积明显小于对照组(P0.05);免疫组织化学检测结果显示,与对照组相比,实验组瘤内细胞核增殖相关抗原Ki67及p-ERK的水平降低。结论:土木香内酯可有效地抑制多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖并促进其凋亡,其机制可能是通过抑制ERK信号通路的活性,抑制裸鼠皮下多发性骨髓瘤的生长。     

HO-1基因表达对伊马替尼耐药的慢性髓系白血病细胞增殖的影响

目的 通过氯高血红素(Hemin)诱导伊马替尼耐药慢性髓系白血病(CML)细胞株K562/A02-IM 中血红素加氧酶-1(HO-1)基因表达,探讨HO-1基因对伊马替尼耐药CML细胞增殖的影响,为治疗CML多药耐药及新药的开发提供思路和实验依据.方法 采用RT-PCR法检测20例CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞中HO-1基因的表达,半定量RT-PCR法和Western blot法分别检测不同剂量Hemin处理K562/A02-IM细胞不同时间后HO-1的表达,通过Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况,采用MTT法检测Hemin诱导及锌原卟啉抑制HO-1表达与细胞存活率的关系.结果 RT-PCR结果显示耐药患者骨髓细胞中HO-1基因阳性表达,半定量RT-PCR和Western blot法显示,不同浓度的Hemin(0、10、20及40 μmol/L)处理K562/A02-IM细胞16 h后,HO-1的表达量随Hemin浓度的升高而增加,存在剂量依赖关系,而20 μmol/L Hemin分别处理K562/A02-IM细胞0、8、16、24 h后,HO-1的表达肇在处理16 h组最高.Annexin V/PI法检测显示,0、10、20及40 μmol/L Hemin作用于K562/A02-IM细胞16 h后细胞凋亡率分别为(17.61±0.01)%、(12.13±0.11)%、(7.94±0.03)%和(4.62±0.15)%,其抗凋亡的作用呈剂量依赖性;20 μmol/L Hemin作用K562/A02-IM细胞8、16及24 h的细胞凋亡率分别为(14.72±0.05)%、(8.15±0.07)%和(16.37±0.13)%.MTT法检测显示与对照组相比,Hemin诱导K562/A02-IM细胞HO-1基因表达促进了细胞的增殖,且作用存在剂量依赖关系;而锌原卟啉抑制HO-1的表达,促进了细胞的凋亡(P<0.05).结论 CML伊马替尼耐药患者骨髓细胞HO-1基因阳性表达,HO-1 是一种可诱导表达型基因,具有抗细胞凋亡及促进细胞增殖的作用,抑制HO-1 表达可能成为治疗CML耐药的新方法.

Abstract：

Objective To investigate the effect of heme oxygenase-1 (HO-1 ) expression on cell growth and apoptosis in imatinib resistant chronic myeloid leukemia (CML) cells ( K562/A02-IM) , and explore the relationship between HO-1 gene and CML. Methods The expression of HO-1 in 20 drug-resistant CML patients was detected by RT-PCR. Different concentrations of hemin were used to induce HO-1 expression of K562/A02-IM, HO-1 expression at different time was detected by RT-PCR and Western blot analysis. Cell apoptosis was detected by Annexin V/PI staining, and MTT assay was used to detect viability of K562/ A02-IM cells after induction or inhibition of HO-1 gene by hemin and zinc protoporphyrin (ZPP). Results RT-PCR showed that HO-1 was expressed in the bone marrow mononuclear cells (BMMNCs). When treated with hemin at different concentrations (0, 10, 20, 40 μmol/L) for 16 h, the expression of HO-1 in K562/ A02-IM was increased in a dose-dependent manner, and peaked at 20 μmol/L of hemin for 16 h. The apoptosis rates were (17.61 ±0.01)%, (12. 13 ±0.11)%, (7.94 ±0.03)% and (4.62 ±0. 15)% at 0,10, 20 and 40 μmol/L of hemin respectively for 16 h and were (14. 7 ± 0.05) % , (8. 1 ± 0. 07) % and (16. 3 ± 0. 13)% at 20 μmol/L of hemin treatment for 8,16, and 24 h respectively. Hemin induced apoptosis of K562/A02-IM cells in a dose-dependent manner. The expression of HO-1 was induced in K562/A02-IM cells in a dose-dependent manner, and the survival of K562/A02-IM cells was significantly increased as compared to that of control group. When HO-1 was inhibited by ZPP, the cells survival was sharply decreased compared to that of the control group (P<0.05). Conclusion HO-1 was expressed in the BMMNCs. It is a kind of molecules whose expression can be induced and can promote the growth of drug-resistant cells. Inhibition of HO-1 expression probably be used for the treatment of drug-resistant CML.     

藤黄酸对K562细胞的凋亡诱导及其作用机制研究

本研究探讨藤黄酸（gambogi cacid,GA）对K562细胞的抑制作用及机制。以不同浓度的藤黄酸处理K562和K562／A02细胞;用四甲基偶氮唑盐（MTF）法检测GA对细胞增殖的影响;碘化丙啶（PI）染色分析细胞周期;AnnexinV／PI双染法检测细胞的凋亡;JC-1染色法检测线粒体跨膜电位水平;流式细胞仪检测荧光素激活的caspase-3、caspase-8、caspase-9阳性细胞水平。结果显示：藤黄酸呈时间和浓度依赖性抑制K562细胞增殖。K562／A02细胞（GA〉2μg/ml）比K562细胞（GA〉0．5μg／ml）需要更高的藤黄酸浓度才显示增殖抑制作用。藤黄酸呈浓度依赖性诱导K562细胞凋亡。藤黄酸0、0．5、1．0、2．0μg／ml浓度对K562细胞周期未显示明显影响。藤黄酸作用后的K562细胞的线粒体跨膜电位明显降低。藤黄酸2μg/ml作用24小时激活的caspase3、caspase8、caspase9阳性细胞比例与对照相比分别上升2．19％、-1．95％、34．01％;作用48小时分别上升60．4％、71．3％、77．7％。结论：藤黄酸对K562细胞株有显著的抑制作用,该作用是通过诱导细胞凋亡实现的。藤黄酸不影响K562细胞的细胞周期。藤黄酸通过线粒体跨膜电位途径和胞浆激活途径诱导K562细胞的凋亡。     

二磷酸氯喹对K562细胞增殖与凋亡的影响

本研究探讨二磷酸氯喹对K562细胞增殖与凋亡的影响及其可能的作用机制。用细胞增殖试验（MTT法）检测不同浓度二磷酸氯喹对K562细胞的增殖抑制作用；应用细胞形态学检查、流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳观察和检测细胞凋亡；以罗丹明123（Rhodamine 123）为细胞染色剂，采用流式细胞术检测不同浓度二磷酸氯喹处理后K562细胞线粒体膜电位（△Ψm）的变化。结果表明：用不同浓度二磷酸氯喹（1.5625、3．125、6．25、12．5、25、50、100μmol／L）分别作用于K562细胞24、48和72小时后，细胞生长活力明显降低，具有剂量依赖性；典型的细胞形态学改变、亚G1峰的测出、梯形条带的显现共同证实了二磷酸氯喹能诱导K562白血病细胞凋亡；Rhodamine 123染色显示二磷酸氯喹处理的K562细胞线粒体膜电位强度下降。结论：二磷酸氯喹对K562细胞有生长抑制、诱导凋亡作用，其作用可能与细胞线粒体膜电位（△Ψm）下降有关。     

西达本胺联合地西他滨对霍奇金淋巴瘤细胞株增殖及凋亡的影响

目的探讨西达本胺联合地西他滨对霍奇金淋巴瘤(HL)细胞株Hs445和L428细胞增殖及凋亡的影响。方法采用MTT法检测西达本胺单用或联合使用地西他滨对Hs445和L428细胞的增殖与抑制作用,流式细胞术检测细胞凋亡情况及线粒体膜电位变化,Western blot检测细胞内cleaved PARP蛋白的表达。结果西达本胺作用24、48、72 h可抑制Hs445和L428细胞增殖,且呈现浓度和时间依赖性,对2种细胞的IC50(μmol/L)分别为1.91和3.46。西达本胺(μmol/L)(对Hs445为0.25、0.5,对L428为1、2)与地西他滨(μmol/L)(0.5、2)分别联合作用72h,对2种细胞的增殖抑制率(%)分别为35.76±0.97、54.20±1.32、54.12±1.24、73.13±0.45,41.05±0.67、56.40±0.39、67.80±0.89、82.35±1.45,对应浓度的西达苯胺单药组的增殖抑制率(%)为12.02±1.41、31.00±0.90,18.03±0.91、36.00±0.21(P0.05),且均为两药相互作用的协同指数(CI)1。0.5μmol/L西达本胺单用或其与2μmol/L地西他滨联合作用48 h后Hs445细胞凋亡率(%)分别为13.22±3.12 vs 67.26±7.87(P0.01);2μmol/L西达本胺单用或其与2μmol/L地西他滨联合作用48 h后L428细胞凋亡率(%)分别为34.03±4.67 vs 70.58±5.76(P0.01);联合用药组cleaved PRAP蛋白表达和线粒体膜电位的下降也明显高于单药组。结论西达本胺可抑制HL细胞株增殖并诱导其凋亡,与地西他滨联用对HL细胞株的增殖抑制及诱导凋亡具有明显著的协同效应。     

CD44基因沉默对K562/A02细胞逆转耐药及生物学活性的研究

本研究旨在探讨CD44基因表达抑制对白血病多药耐药细胞株K562/A02耐药性及生物学活性的影响。根据CD44基因表达序列设计有效的RNA干扰片段,将其插入质粒表达载体中,获得针对CD44mRNA的特异性siRNA真核质粒(pGCsiRNA-CD44),转染K562/A02细胞。用实时荧光定量RT-PCR检测K562/A02细胞CD44、mdr-1和bcl-2mRNA的表达;用MTT法检测阿霉素对K562/A02细胞的半数抑制浓度(IC50);流式细胞术(FACS)检测细胞周期;Hochest33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果表明:针对CD44基因的siRNA真核质粒可有效沉默K562/A02细胞的CD44基因:与对照组相比,转染了4条pGCsiRNA-CD44质粒的K562/A02细胞CD44表达均明显受抑,以转染了siCD44-1的细胞中抑制最强。转染pGCsiRNA-CD44质粒48小时后,K562/A02细胞CD44mRNA表达水平下降64.1%(p0.05),同时mdr-1与bcl-2mRNA的表达量较对照组分别下降了25.6%与50.8%;K562/A02细胞IC50为(17.97±1.61)μg/ml,无义序列质粒转染后阿霉素对K562/A02细胞的IC50为(16.95±1.72)μg/ml,pGCsiRNA-CD44转染后IC50明显降低为(8.77±1.63)μg/ml(p0.01)。转染48小时后,G0/G1期细胞比例提高了10.7%;细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论:特异性CD44siRNA可显著抑制K562/A02细胞CD44基因的表达,抑制细胞增殖,诱导其凋亡,并有效逆转K562/A02细胞的多药耐药性。     

别欧前胡内酯对HL-60细胞凋亡的影响

目的探讨别欧前胡内酯对人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞凋亡的影响及可能的机制。方法对数生长期人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞随机分为对照组和4、16、32、64、128mg/L别欧前胡内酯组。别欧前胡内酯作用24h,应用透射电子显微镜观察HL-60细胞形态学改变,MTT法检测别欧前胡内酯对HL-60细胞增殖的影响,根据细胞生长抑制率计算别欧前胡内酯对HL-60细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50),流式细胞仪检测HL-60细胞凋亡率及线粒体膜电位改变。结果别欧前胡内酯作用24h,对照组HL-60细胞表面光滑,形态正常,大小均匀;64、128mg/L别欧前胡内酯组HL-60细胞数目明显减少,且体积变小,呈凋亡形态改变;MTT检测结果显示,别欧前胡内酯对HL-60细胞增殖具有明显的抑制作用,IC50值为(75±13)mg/L;流式细胞仪检测结果显示,对照组HL-60细胞凋亡率为(11.6±5.2)%,4、16、32、64、128 mg/L别欧前胡内酯组HL-60细胞凋亡率分别为(17.2±6.1)%、(24.2±8.6)%、(36.1±4.5)%、(46.0±7.3)%和(69.9±10.2)%,随别欧前胡内酯浓度增加,HL-60细胞凋亡率逐渐增高,线粒体膜电位逐渐降低(P0.05)。结论别欧前胡内酯可明显促进人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞凋亡,其机制可能与改变HL-60细胞线粒体膜电位有关。     

应用细胞培养、流式细胞技术和Western Blot检测氮杂糖化合物SZL在体外抑制人宫颈癌HeLa细胞增殖与诱导凋亡的效应

目的:存在于细胞表面的糖复合物参与细胞的通讯、增殖、迁移、分化等生理过程,在机体中具有复杂的生物学调控作用。探讨氮杂糖化合物SZL在体外对人宫颈癌HeLa细胞生长、DNA损伤、线粒体膜电位以及细胞凋亡的干预。方法:实验于2004-12/2006-12在北京大学医学部细胞生物学系完成。①实验材料:人子宫颈癌HeLa细胞株由北京大学医学部细胞生物学系杜晓娟副教授提供。SZL由北京大学天然药物及仿生药物重点实验室叶新山教授合成。②实验方法:取对数生长期HeLa细胞,消化后制成细胞悬液,按1.5×103/孔的密度接种,培养24h细胞完全贴壁后,SZL组加入5,10,25,50,100μmol/L的SZL,空白对照组加入DMEM培养液。③实验评估:SZL作用24,48,72h后,采用酸性磷酸酶法检测细胞生长抑制情况,瑞氏染色镜下观察细胞形态;AnnexinV-PI染色后,流式细胞仪检测细胞凋亡率;Rhodamine123标记活细胞后,流式细胞仪检测线粒体膜电位的变化;WesternBlot法检测SZL作用后凋亡相关蛋白的表达;单细胞凝胶电泳检测SZL作用后细胞DNA损伤情况。结果:①细胞生长抑制:5,10,25,50,100μmol/LSZL作用24,48,72h后的半数抑制浓度分别为73.6,43.2,33.6μmol/L,显著抑制Hela细胞的增殖。镜下空白对照组HeLa细胞分布均匀,胞质透明清亮,呈铺展状态生长;50μmol/LSZL作用24h后,HeLa细胞密度变稀,体积变小,胞核染色质呈聚集状态。②细胞凋亡:50,100μmol/LSZL作用24h后细胞凋亡率分别为(3.51±0.41)%,(58.46±8.45)%;在24～48h过程中,凋亡的细胞逐渐坏死,SZL作用48h后细胞凋亡率分别为(10.51±2.20)%,(17.29±7.52)%。空白对照组24,48h后细胞凋亡率均为1%。③线粒体跨膜电位的变化:50μmol/LSZL作用24,48h后,HeLa细胞的线粒体膜电位平均荧光强度均明显低于空白对照组(P<0.01)。④凋亡相关蛋白的表达:25,50,100μmol/LSZL作用HeLa细胞48h后,凋亡相关蛋白pro-caspase3、Bcl-2表达降低,细胞色素c含量升高。⑤细胞DNA损伤:50μmol/LSZL作用24h后,受损细胞DNA在电场中迁出,呈现彗星状拖尾。结论:氮杂糖类化合物SZL能够抑制HeLa细胞的增殖,诱导细胞发生DNA损伤,通过干预线粒体途径实现细胞凋亡。