hTERT基因反义核酸对顺铂诱导Jurkat细胞凋亡的影响

目的:用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制Jurkat细胞端粒酶活性后, 观察化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)对Jurkat细胞凋亡的影响。方法:采用台盼蓝拒染法观察hTERT ASODN与化疗药物(顺铂、柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙)联合作用对Jurkat细胞系生长的影响;姬姆萨染色法观察凋亡细胞的形态变化;琼脂糖凝胶电泳分析细胞凋亡的DNA断裂情况;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果: hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙, 对细胞生长的抑制分别与单用柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙及hTERT正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide, SODN)联合柔红霉素、长春新碱、足叶乙甙组相比, 无显著差异(P>0.05) 。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂, 分别与SODN联合顺铂作用组、单用顺铂作用组相比, 对细胞抑制明显增强(P<0.05)。hTERT ASODN作用于Jurkat细胞24 h再加入顺铂作用48 h, 细胞出现典型的凋亡形态学改变, 经琼脂糖凝胶电泳即可见到DNA梯形条带, 而SODN与顺铂联合作用组及单独应用顺铂均未见到DNA梯形条带。hTERT ASODN与2.5 μmol/L顺铂联合作用于Jurkat细胞48h的凋亡细胞百分率(25.18±3.63)%分别同SODN与顺铂联合作用组(10.07±2.12)%、单用顺铂作用组(9.73±2.43)%进行比较有显著差异(P<0.01)。 结论:hTERT基因反义寡核苷酸能促进顺铂诱导Jurkat细胞凋亡。     

人类端粒酶逆转录酶基因反义核酸促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡

目的:利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASODN)抑制HL-60细胞的端粒酶活性后,探讨顺铂对HL-60细胞凋亡的影响。方法:采用聚合酶链反应-酶联免疫测定(PCR-ELISA)方法检测人工合成的反义核酸处理HL-60细胞前后端粒酶活性的改变;免疫荧光标记通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达水平;用DNA电泳及流式细胞仪计数检测细胞凋亡。结果:hTERT基因的ASODN作用于HL-60细胞后,细胞的hTERT蛋白表达及端粒酶活性表现不断降低;抑制HL-60细胞端粒酶活性后,顺铂可诱导HL-60细胞产生明显的DNA断片;ASODN与顺铂联合作用于HL-60细胞后的凋亡细胞百分率(38.62±3.45)%分别同正义寡核苷酸(SODN)与顺铂联合作用组(11.02±2.07)%、单用顺铂作用组(9.23±1.70)%进行比较有显著差异(P＜0.01)。结论:hTERT基因的ASODN能促进顺铂诱导HL-60细胞凋亡。     

hTERT基因反义核酸促进顺铂诱导原代急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的研究

目的:利用人类端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的反义寡核苷酸(ASPS-ODN)抑制人原代急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞hTERT基因表达后,观察顺铂对ALL细胞凋亡的影响。方法:采用间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达量的变化;以台盼蓝拒染法计数细胞数,确定细胞的增殖情况;Hoechst33258和PI双染色法观察凋亡细胞的形态变化;通过流式细胞仪对细胞凋亡峰进行定量分析。结果:hTERT反义核酸作用于ALL细胞72hhTERT蛋白表达阳性率为(32.17±3.00)%,与空白对照组(66.31±2.84)%及正义核酸作用组(62.56±6.11)%比有显著差异(P<0.05);而正义核酸作用组与空白对照组比无显著差异(P>0.05)。hTERT反义核酸作用于ALL细胞24h加入顺铂,再共同作用48h,ALL活细胞均数为1.750×10⁸cells/L,与单用顺铂组(2.090×10⁸cells/L)及hTERT正义核酸联用顺铂组(1.990×10⁸cells/L)相比,对细胞抑制明显增强(P<0.05)。hTERTASPS-ODN作用于ALL细胞24h再加入顺铂作用48h,细胞出现典型的凋亡形态学改变。hTERTASPS-ODN与25μmol/L顺铂联合作用于ALL细胞48h的凋亡细胞百分率(37.85±2.44)%分别同SPS-ODN与顺铂联合作用组(15.16±2.8)。     

hTERT反义寡核苷酸促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡

目的：探讨转染人端粒酶逆转录酶基因（hTERT)反义寡核苷酸后能否增强紫杉醇诱导皮肤T细胞淋巴瘤细胞株Hut78凋亡。方法:采用脂质体介导的基因转染技术将hTERT反义寡核苷酸（AODN)、正义寡核苷酸（SODN)导入Hut78细胞株中，应用端粒酶重复序列扩增及酶联免疫吸附方法（TRAP-PCR-ELISA)、逆转录-聚合酶链反应、四甲基偶氮唑蓝法（MTT)、台盼蓝拒染法和流式细胞仪分析测定联合应用紫杉醇后对细胞端粒酶活性、hTERT mRNA表达、细胞增殖及凋亡的影响。结果:转染hTERT基因反义寡核苷酸并联合应用紫杉醇，48 h后Hut78细胞增殖即被明显抑制，端粒酶活性下降，hTERT mRNA表达降低，分别同SODN联合紫杉醇组及单用紫杉醇组进行比较，有显著差异（P<0.05)； MTT结果显示，紫杉醇对AODN组、SODN组及空白对照组细胞的IC50值分别为(81.10 ± 1.68) nmol/L，(138.70±1.80) nmol/L和(139.40± 5.50) nmol/L，差异显著（P< 0.05)；经流式细胞仪检测，AODN联合紫杉醇组凋亡率明显高于SODN联合紫杉醇组和单用紫杉醇组。结论:hTERT反义寡核苷酸与紫杉醇有协同抗肿瘤效应，并能增加Hut78细胞对紫杉醇的敏感性，促进紫杉醇诱导Hut78细胞凋亡。     

hTERT基因反义核酸提高原代复发急性淋巴细胞白血病细胞对顺铂敏感性的研究

目的：研究人类端粒酶逆转录酶（hTERT）基因的反义核酸（AS PS-ODN）能否增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。 方法:采用免疫荧光标记法检测hTERT蛋白表达水平，以台盼蓝拒染法计数细胞数，通过细胞形态学观察及流式细胞仪细胞周期的分析来检测凋亡。 结果:hTERT基因反义核酸能降低hTERT蛋白的表达。顺铂与hTERT基因反义核酸联合应用能明显抑制培养原代细胞的增殖，与单用顺铂组比较P<0.05。凋亡检测，用药48 h后，单用顺铂、顺铂联用反义核酸或正义核酸组，经Hoechst33258和PI双染法观察细胞均表现典型的细胞凋亡的形态学改变；顺铂联用反义核酸组，细胞的凋亡率明显高于单用顺铂组（P<0.05）。 结论:hTERT基因反义核酸能增强复发急性淋巴细胞白血病原代细胞对顺铂的敏感性。     

端粒酶逆转录酶及c-myc基因反义寡核苷酸对HL-60细胞端粒酶活性的影响

目的研究端粒酶逆转录酶（hTERT）与c-myc基因反义寡核苷酸（ASODN）对HL-60细胞端粒酶活性的影响,探讨HL-60细胞端粒酶活性与hTERT和c-myc基因表达的关系。方法应用反义寡核苷酸（ASODN）分别封闭HL-60细胞hTRET与c-myc基因,RT-PCR方法检测基因表达;分别使用TRAP-ELISA法、PAGE-银染法检测细胞端粒酶活性。结果ASODN作用细胞72h后。hTERT、c-mycmRNA的表达受到不同程度抑制。以30μmol／L作用组表达量最低。TRAP-ELISA检测：hTERT ASODN10、20、30μmol／L作用组,c-myc ASODN20、30μmol／L作用组与未作用组比较,端粒酶活性明显降低（P〈0．05）;c-myc ASODN 10μmol／L作用组及c-myc、hTERTSODN作用组与未作用组比较无显著差异（P〉0．05）。PCR-PAGE检测：hTERT与c-myc ASODN作用组较SODN作用组端粒酶条带明显减少,以30μmol／L作用组条带最少,而同浓度hTERT ASODN作用组较c-mycASODN作用组条带减少。结论hTERT与c-myc基因ASODN能够分别抑制该基因mRNA的表达,同时具有下调端粒酶活性作用。     

hTERT基因反义核酸对Raji细胞端粒酶活性的影响

目的:观察人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的全硫代修饰反义寡核苷酸(ASODN)对Raji细胞端粒酶活性的影响。方法: 端粒酶聚合酶链反应-酶联免疫测定法检测Raji细胞的端粒酶活性；采用逆转录-聚合酶链反应方法检测hTERT基因mRNA的表达水平；以间接免疫荧光标记法通过流式细胞仪检测hTERT蛋白表达含量的变化。结果:hTERTASODN作用于Raji细胞后，hTERTmRNA表达水平明显降低，ASODN与Raji细胞共同孵育48h，hTERT蛋白表达阳性率降为50.15%±3.49%，72hhTERT蛋白表达阳性率降为33.35%±2.75%。而hTERT正义核酸作用24、48、72h对hTERT蛋白表达阳性率(65%)无显著影响(P＞0.05)。hTERT基因ASODN作用于Raji细胞48h，其端粒酶活性明显降低，作用72h，端粒酶活性明显受到抑制，分别与正义寡核苷酸组、空白对照组相比有显著差异(P＜0.05)。结论:hTERT基因反义寡核苷酸特异性地抑制Raji细胞的端粒酶活性。     

Survivin反义寡核苷酸诱导胃癌细胞凋亡及对化疗药物的增敏作用

目的观察survivin反义寡核苷酸（ASODN）对胃癌细胞的增殖、凋亡及对化疗药物敏感性影响。方法人工合成survivin硫代ASODN,通过脂质体转染胃癌细胞株MGC803后,用MTT法检测细胞毒作用,流式细胞术检测细胞的凋亡;RT-PCR、Western blot检测survivin mRNA及蛋白的表达。结果survivin ASODN抑制MGC803增殖,呈剂量依赖性;各survivin ASODN处理组MGC803细胞凋亡率显著高于对照组（P〈0.01）;survivin ASODN处理组MGC803细胞survivin蛋白及mRNA的表达水平显著下降（P〈0.01）;200nmol/Lsur-vivin ASODN和顺铂联合处理MGC803细胞株,其细胞抑制率为74.7%,显著高于单用survivin ASODN组的38.4%和单用顺铂组的33.6%（P〈0.01）。结论survivin ASODN能够抑制MGC803细胞增殖、诱导凋亡,并能增加MGC803细胞对化疗药物的敏感性。     

奥沙利铂联合柔红霉素诱导结肠癌细胞系HT-29凋亡

目的研究奥沙利铂联合柔红霉素对结肠癌细胞凋亡的影响及机制。方法分别用不同浓度的奥沙利铂和柔红霉素处理结肠癌细胞HT-29,MTT法检测细胞增殖并计算半数抑制浓度。分别用半数抑制浓度的奥沙利铂、柔红霉素及二者联合处理HT-29细胞,MTT法测定细胞增殖;平板克隆实验检测细胞克隆形成;流式细胞计量术检测细胞凋亡;Western blot检测细胞中活化的caspase-3(cleaved caspase-3)、第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(PTEN)、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白表达。结果不同浓度的奥沙利铂和柔红霉素均可以抑制HT-29细胞增殖(P<0. 05),其半数抑制浓度为:柔红霉素约0. 23μmol/L,奥沙利铂约40 mg/L。柔红霉素、奥沙利铂和奥沙利铂联合柔红霉素处理后的HT-29细胞增殖能力、克隆形成能力降低;细胞凋亡率升高;细胞中cleaved caspase-3蛋白表达升高;细胞中p-Akt蛋白表达降低;PTEN蛋白表达升高。奥沙利铂联合柔红霉素作用高于单纯柔红霉素或奥沙利铂处理(P<0. 05)。结论奥沙利铂联合柔红霉素能够诱导结肠癌细胞HT-29凋亡,其作用机制可能与PTEN/Akt信号调控有关。     

抑制氯通道CLCN2基因表达对顺铂诱导胶质瘤U251细胞损伤的影响

目的： 探讨使用特异性CLCN2反义寡核苷酸抑制CLCN2基因表达对顺铂诱导的神经胶质瘤U251细胞损伤的影响。方法：U251细胞按处理方法不同分4组,对照组（转染无义寡核苷酸）、转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组（无义寡核苷酸与顺铂联用）、CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组。应用MTT法检测U251细胞生存率;RT-PCR检测CLCN2、cyclinD1 mRNA表达;TUNEL法检测细胞凋亡率。结果：与对照组相比,转染CLCN2反义寡核苷酸组、顺铂组和CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组U251细胞生存率、CLCN2 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加;与顺铂组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组细胞生存率（P＜0.05）、CLCN2、cyclinD1 mRNA表达降低,凋亡细胞数增加（P＜0.01）;与CLCN2反义寡核苷酸组相比,CLCN2反义寡核苷酸与顺铂联用组CLCN2 mRNA表达明显降低（P＜0.01）。结论：①转染CLCN2反义寡核苷酸能有效抑制CLCN2 mRNA表达;②抑制CLCN2 mRNA表达能促进顺铂对U251细胞的损伤作用;③CLCN2基因表达降低参与顺铂对U251细胞损伤作用。     

Bcl-2硫代反义寡核苷酸对人恶性黑色素瘤A375细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究bcl-2硫代反义寡核苷酸(bcl-2ASODN)对人恶性黑色素瘤细胞A375增殖和凋亡的影响及其作用机制。方法:采用MTT法、激光共聚焦显微镜、TUNEL法和AnnevinV/PI双染法检测bcl-2ASODN对A375细胞增殖和凋亡的影响。应用RT-PCR方法,观察bcl-2ASODN处理前后bcl-2mRNA在A375细胞表达水平的变化。结果:MTT法检测显示bcl-2ASODN抑制A375细胞增殖,并呈时间和剂量依赖性;经30μmol/LASODN作用48h,激光共聚焦显微镜观察细胞呈现典型凋亡特征;TUNEL染色可见ASODN组多数A375细胞核被标记呈棕褐色,而SODN组和对照组细胞核未被明显标记;AnnexinV/PI检测ASODN组凋亡细胞比例升高,与SODN组和对照组均有显著性差异(P<0.001);RT-PCR结果显示bcl-2mRNA表达水平下降。结论:bcl-2ASODN可抑制A375细胞增殖和诱导A375细胞凋亡,其诱导凋亡的机制是下调bcl-2mRNA的表达。     

硫修饰脂质体包裹VEGF反义寡核苷酸对肺癌血管生成及转移的抑制作用

目的：探讨硫修饰脂质体包裹的VEGF反义寡核苷酸对肺癌血管生成和转移的抑制作用。方法：将硫修饰脂质体包裹的VEGF反义寡核苷酸（ASODN）、正义寡核苷酸（SODN）、错义寡核苷酸（MODN）加入培养的Lewis肺癌细胞中，采用免疫组织化学方法检测肺癌细胞中VEGF蛋白表达，观察经ODN处理的条件培养基对牛主动脉内皮细胞增殖的影响。另外，复制小鼠Lems肺癌模型40只，随机分为对照组、VEGFASODN组、VEGFSODN组及VEGFMSODN组，每组10只，接种肿瘤细胞24小时内，给予脂质体、VEGFASODN、VEGFSODN、VEGFMSODN皮下注射，每周2次，连续4周。检测皮下肿瘤的变化和肺转移率，并用免疫组织化学方法检测肿瘤组织微血管密度（MVD），超声检测肿瘤组织Ps、砌变化。结果：ASODN能够下调肺癌细胞中VEGF蛋白的表达，经ASODN处理的条件培养基能显著抑制牛主动脉内皮细胞的增殖。ASODN组小鼠肿瘤生长及肺转移受到显著抑制，MVD、PS、RI与其它各组相比有明显差异（P〈0．01）。结论：硫修饰脂质体包裹的VEGF反义寡核苷酸能够显著抑制肺癌血管生成，进而抑制肿瘤生长及转移。     

靶向沉默Ku80增强顺铂诱导的人肺腺癌细胞凋亡

目的:观察沉默Ku80能否增强顺铂诱导的人肺腺癌耐药细胞的细胞凋亡。方法:首先采用RT-PCR、Westernblot方法比较Ku80在人肺腺癌亲代(A549)与耐药细胞系(A549/DDP)的表达水平;将Ku80siRNA及si-Scramble转染至A549/DDP细胞后,加药组转染后48小时加顺铂作用24小时;应用MTT法检测顺铂对各组细胞的抑制率,采用流式细胞仪检测凋亡率,Caspase-3活性检测试剂盒检测Caspase-3活化程度。结果:Ku80 mRNA、蛋白在A549/DDP表达水平显著高于其亲代A549;si-Ku80组A549/DDP细胞的Ku80的mRNA、蛋白表达水平下调;顺铂对si-Ku80组细胞的抑制率明显高于si-Scram-ble组与Control组;在6μg/ml顺铂作用24小时后,si-Ku80组细胞凋亡率及Caspase-3活化程度高于si-Scramble组和Control组(P<0.05)。结论:靶向Ku80siRNA导入人肺腺癌耐药细胞特异性下调Ku80的表达,增强顺铂诱导的人肺腺癌耐药细胞凋亡作用。     

大鼠脑缺血过程中神经细胞死亡的研究

通过凝胶电泳及细胞死亡原位末端标记研究了大鼠全脑缺血时细胞凋亡。结果是在轻度缺血时细胞于２４ｈ出现凋亡，重度缺血时１２ｈ出现，高峰时间在４８－７２ｈ，凝胶电泳变化较ＩＳＥＬ异常出现晚，分别在２４ｈ及４８ｈ。重度缺血急性期以坏死为主，忱发性损害期则以细胞凋亡为主，轻度缺血在坏互表现不显著时，仍可见明显的凋亡细胞。结果表明：细胞凋亡参与脑缺血急性期及迟发性神经元损害，轻度缺血神经细胞损害以细胞凋良为主     

Hydrogen peroxide reverses IL-5 afforded eosinophil survival and promotes constitutive human eosinophil apoptosis

BACKGROUND: Eosinophils play a central role in the induction and perpetuation of allergic inflammatory responses. The present study was performed to investigate the effects of reactive oxygen intermediates on constitutive apoptosis as well as on interleukin (IL)-5 afforded human eosinophil survival. METHODS: Peripheral blood eosinophils were isolated by CD16-negative selection to >99% purity and were cultured for 48 h. The number of apoptotic eosinophils in the culture was assessed by flow cytometric analysis of relative DNA content in propidium-iodide-stained cells, annexin-V binding or by morphological analysis. Apoptosis was confirmed by the appearance of a typical ladder pattern in the DNA fragmentation assay by agarose gel electrophoresis. RESULTS: Exogenous H(2)O(2) reversed IL-5-afforded eosinophil survival by inducing apoptosis. Constitutive eosinophil apoptosis was inhibited by a reduction of intracellular levels of H(2)O(2) by catalase. Exogenous H(2)O(2) increased the rate of constitutive apoptosis. CONCLUSIONS: Our results suggest that H(2)O(2) may play a role in the downregulation of eosinophilic inflammation by inducing eosinophil apoptosis.