激光扫描共聚焦显微镜在乳腺癌研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是当今世界上最先进的分子细胞生物学分析仪器.本文就LSCM在乳腺癌细胞生物学、分子生物学、细胞膜受体、细胞内抗肿瘤药物的定位及其耐药机制研究、图像分析等方面的应用进行综述,并对其临床应用进行展望.     

激光扫描共聚焦显微镜在树突状细胞研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)由于具有高分辨率、高灵敏度、“光学切片”、三维重建、动态分析等优点 ,为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。本文就LSCM在树突状细胞 (DC)的形态学、免疫荧光分析、缝隙连接、功能研究中的应用作一综述。     

激光扫描共聚焦显微镜在乳腺癌研究中的应用

激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）是当今世界上最先进的分子细胞生物分析仪器。本文就LSCM在乳腺癌细胞生物学、分子生物学、细胞膜受体、细胞内抗肿瘤药物的定位及其耐药机制研究、图像分析等方面的应用进行综述。并对其临床应用进行展望。     

激光共聚焦显微镜在肿瘤研究中的应用

激光共聚焦显微镜(LSCM)是当今最为先进的光学显微镜,是形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具.目前在肿瘤研究领域中的荧光定性、定量分析、细胞内离子分析、活细胞动态监测、三维结构观察等也得到较广泛应用.     

激光共聚焦显微镜在肿瘤研究中的应用

激光共聚焦显微镜(LSCM)是当今最为先进的光学显微镜，是形态学、分子生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。目前在肿瘤研究领域中的荧光定性、定量分析、细胞内离子分析、活细胞动态监测、三维结构观察等也得到较广泛应用。     

肝癌细胞及正常肝细胞中间隙连接蛋白Cx32、Cx43的表达--激光扫描共聚焦显微镜研究

目的研究间隙连接蛋白Cx32、Cx43在肝癌细胞系HHCC、SMMC-7721及正常肝细胞系QZG中的表达.方法采用免疫荧光标记技术,对HHCC、SMMC-7721及QZG细胞中Cx32、Cx43蛋白进行激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)分析.结果Cx2、Cx43蛋白定位于肝细胞胞质中,在HHCC、SMMC-7721中阳性细胞率、阳性细胞的荧光强度较QZG中明显减弱.结论Cx32、Cx43蛋白表达降低可能与肝细胞癌的发生有关.     

彗星电泳法检测H2O2对人淋巴细胞DNA损伤及其激光扫描共聚焦显微境下的观察和三维重建

目的:应用彗星电泳法于荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察人淋巴细胞经H2O2作用后的DNA损伤情况.方法:人淋巴细胞经不同浓度H2O2(0、10、20、40、80μmol/L)作用20 min,或20μmol/L H2O2作用不同时间(0、10、20、30 min)后,采用彗星电泳法,荧光显微镜下观察、照相,对尾长、总彗星长度、尾距进行测量和分析.同时采用激光共聚焦显微镜(LSCM)进行观察和三维重建;比较了不同染料(H、AO、EB、Hochest33258)的染色效果.结果:H202作用浓度为0、10、20、40、80μmol/L时,尾距(-x±s)分别为0.001±0.002、0.31±0.35、1.23±0.96、2.82±1.38、3.52±0.96(P＜0.01);作用时间为0、10、20、30min时,尾距(-x±s)分别为0.05±0.09、0.22±0.30、1.62±0.93、1.89±1.09(P＜0.01).尾长、总彗星长度也有显著性增加,经统计学检验,P＜0.01.与荧光显微镜相比,LSCM下的″彗星″轮廓十分清晰;PI和EB染色效果较好.结论:H2O2能剂量依赖性和时间依赖性地导致人外周血淋巴细胞DNA的明显断裂损伤.利用LSCM构建″彗星″的三维图像将更有利于DNA损伤的准确测量.鉴于染色效果的差异,PI和EB是比较适合的彗星电泳染料.     

ATM蛋白在不同肺癌细胞株中表达差异与放射敏感性关系的研究

目的 通过对ATM蛋白在不同肺癌细胞株中表达差异与放射敏感性关系的研究，为下一步研究打下基础。方法利用细胞集落形成实验研究肺癌细胞株A549、NCI—H446的放射敏感性差异，并结合免疫荧光实验和激光共聚焦扫描（LSCM）技术来探讨两细胞株中ATM蛋白的表达差异与放射敏感性之间的关系。结果集落形成实验中，在接受2、4、6、8Gy剂量照射时，A549和NCI—H446两肺癌细胞株的存活分数分别为81．0％、32．4％、12．0％、3．5％和52．4％、17．0％、3．2％、0．7％。ATM蛋白定位于细胞浆和胞核；利用LSCM分析两细胞株中ATM蛋白的表达差异，A549细胞ATM蛋白荧光强度（71．188＋13．379）较NCI-H446细胞（47．478±19．032）明显增强（P〈0．0001），有统计学意义。结论两肺癌细胞株A549和NCI-H446具有放射敏感性差异，ATM蛋白在两细胞株中的表达亦有差异显著性，表明其表达量可能与放射敏感性呈负相关。     

重组人白细胞介素24抑制淋巴瘤raji细胞生长及其分子机制

目的:研究重组人白细胞介素24体外对淋巴瘤raji细胞的生长抑制作用及其分子机制.方法:用rhIL-24蛋白作用于淋巴瘤raji细胞,MTT法检测rhIL-24蛋白对raji细胞的生长抑制作用,激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)观察rhIL-24蛋白诱导raji细胞凋亡的形态学改变,流式细胞仪(FACS)检测rhIL-24蛋白诱导raji细胞的凋亡率及细胞周期改变,免疫细胞化学分析凋亡相关因子Bcl-2 和 Bax的改变.结果:rhIL-24蛋白作用于淋巴瘤raji细胞后,可以显著抑制raji细胞的生长,诱导G2/M期阻滞和凋亡,rhIL-24蛋白能使raji细胞中bcl-2的表达下调和bax的表达上调.结论:rhIL-24蛋白对淋巴瘤raji细胞具有显著的生长抑制及凋亡诱导作用,其作用机制可能与下调bcl-2和上调bax的表达有关.     

ALA-PDT诱导白血病细胞株HL-60凋亡

背景与目的:基于5-氨基乙酰丙酸的光动力疗法(ALA-PDT)利用肿瘤细胞对ALA产生的内源性光敏剂原卟啉IX(PpIX)的优先摄取,使肿瘤细胞在受到一定的光照后被选择性地杀伤。到目前为止,ALA-PDT引起肿瘤细胞破坏的确切机制尚未完全阐明。本研究探讨ALA-PDT对白血病细胞株HL-60的凋亡诱导作用。方法:以白血病细胞株HL-60为实验模型。实验分为4组,对照组、单纯ALA组、单纯光照组及ALA PDT组。用MTT法检测细胞的存活率,瑞氏染色观察细胞形态学改变,用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,并用共聚焦激光显微镜(LSCM)观察凋亡细胞的特征。结果:ALA PDT组光照后细胞形态学可见凋亡改变;MTT法显示细胞存活率明显下降,24 h为(46±9)%,48 h为(26±8)%,两者比较差异有显著性(P<0.05);流式细胞仪检测显示光照后4、5和24 h细胞凋亡率分别为(26±9)%、(29±11)%和(51±6)%,与对照组相比差异有显著性(P<0.05);LSCM观察AnnexinV-FITC单阳性及AnnexinV-FITC/PI双阳性细胞均具有典型的凋亡特征,而单纯ALA组、单纯光照组及对照组则无上述改变。结论:ALA-PDT能杀伤白血病细胞株HL-60,主要通过诱导凋亡的方式实现的,并呈一定的时间依赖性。     

p21活化激酶4在乳腺癌细胞中的表达及定位

目的:研究p21激活激酶4（PAK4）在人乳腺癌细胞和组织中的表达和定位。方法:蛋白印迹法检测PAK4在人乳腺癌细胞系中蛋白和基因的表达,激光共聚焦扫描显微镜检测内源PAK4在MCF-7乳腺癌细胞中的定位。结果:PAK4在人乳腺肿瘤细胞系中蛋白和基因表达水平增高,激光共聚焦扫描显微镜观察发现PAK4主要定位于MCF-7细胞质中。结论:PAK4在人乳腺癌细胞系中高表达,主要定位于乳腺癌组织细胞质内,可能是人乳腺癌重要的调节因子。     

p57kip2蛋白在乳腺癌组织和细胞系中的表达和定位

目的：研究p57kip2在人乳腺癌组织和细胞系中的表达和定位.方法：免疫印迹法检测人乳腺肿瘤细胞系中p57kip2的表达.人乳腺肿瘤组织进行免疫组化染色,检测p57kip2在组织中的表达.激光共聚焦扫描显微镜检测内源p57kip2在MCF-7细胞中的定位.结果：p57kip2在乳腺癌细胞系内表达,免疫组化染色分析和激光共聚焦扫描显微镜证实p57kip2主要定位于细胞核内.结论：p57kip2在乳腺癌细胞内表达,p57kip2主要定位于乳腺癌组织细胞核内,可能是参与肿瘤细胞基因转录调控和蛋白表达的重要蛋白之一.     

蓝舌病毒湖北株致人肝癌Hep-3B细胞和人肺腺癌A549细胞死亡机制的研究

目的探讨蓝舌病毒湖北株(BTV-HbC3)致人肝癌Hep-3B和人肺腺癌A549细胞死亡的方式及其作用机制。方法观察细胞感染BTV-HbC3的病变效应;原位末端标记(TUNEL)法检测细胞感染BTV-HbC3是否出现凋亡;激光打描共聚焦显微镜检测荧光标记的细胞核及内质网变化;萤光照度仪检测病毒诱导细胞caspase-3/7、caspase-8和caspase-9的活性变化。结果BTV-HbC3感染Hep-3B细胞后有明显的病变效应,大量细胞凋亡,细胞核染色质边聚,内质网大量空泡形成,caspase- 3/7活性升高,caspase-8和caspase-9未升高;BTV-HbC3感染A549细胞后有明显病变效应,仅见零星凋亡细胞,内质网有空泡形成,细胞核未见染色质边聚,caspase-3/7和caspase-9活性升高,caspase-8未升高。结论BTV-HbC3主要通过细胞内内质网途径诱导Hep-3B细胞凋亡而发挥其抑瘤作用,而对人肺腺癌的抑瘤作用则是通过诱导A549细胞的非凋亡性程序性死亡来实现的。     

表达BCRP的胚肾细胞系HEK293/BCRP的建立及生物学特征

目的:建立HEK293/BCRP多药耐药细胞系并研究其生物学功能。方法:构建有BCRP基因的表达载体,利用脂质体转染方法将载体转入HEK293细胞,并用RT-PCR、间接免疫荧光染色和流式细胞术分析检测转染细胞系BCRP的表达,体外细胞毒试验检测其对米托蒽醌等的耐药指数,流式细胞术和激光共聚焦分别检测其对罗丹明123和阿霉素的外排作用。结果:HEK293/BCRP细胞系在BCRP mRNA和蛋白表达均明显升高(P<0.05),对米托蒽醌的耐药指数达112.07倍,经1.5 h和3 h外排,细胞内罗丹明123浓度分别降低了42.25%和69.01%,激光共聚焦显示细胞内阿霉素浓度降低。结论:成功构建了表达BCRP的胚肾细胞系HEK293/BCRP,并对多种抗肿瘤药物具有耐受性。     

乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)在肝癌中的表达及定位

目的:研究乙肝病毒X蛋白结合蛋白(HBXIP)在人肝癌细胞中的表达和定位.方法:蛋白印迹法检测HBXIP在人肝癌细胞系中蛋白和基因的表达,激光共聚焦扫描显微镜检测内源HBXIP在BEL7402、HepG2肝癌细胞中的定位.结果:HBXIP在人肝肿瘤细胞系中蛋白和基因表达水平增高,激光共聚焦扫描显微镜观察发现HBXIP主要定位于BEL7402、HepG2细胞核中.结论:HBXIP在人肝癌细胞系中高表达,主要定位于肝癌细胞核内,可能是人肝癌重要的调节因子.     

肝癌抑制基因-1与转运功能相关的451 bp序列区的确定

背景与目的:肝癌抑制基因-1(HCCS1)是一种潜在的肝癌抑制基因,并且在细胞内蛋白分拣运输中也发挥着重要作用,其抑癌作用有可能是通过其蛋白转运的功能而发挥的,本文以寻找HCCS1序列中与转运相关的最小功能序列区域为目的.方法:通过亚克隆技术,构建以pEGFP-C2为载体的含不同长度HCCS1cDNA片段的亚克隆,将构建的亚克隆转染子宫颈癌HeLa细胞,通过免疫荧光共聚焦显微镜观察不同长度HCCS1蛋白的分布,以及与6-磷酸甘露糖受体(M6PR)的共定位.结果:成功构建了以pEGFP-C2为载体的10个含有不同长度HCCS1片段的亚克隆;HCCS1cDNA从3'端向5'端逐渐缺失的片段中:2 100 bp片段至778 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白呈颗粒状分布于核周的胞质内,其中2 100 bp片段至1 571 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白均呈颗粒状、极性分布于核周的胞质内,且与M6PR有共定位;而1 120 bp片段至778 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白虽然也呈颗粒状分布于核周,但极性分布消失,且与M6PR共定位消失;HCCS1cDNA片段678 bp片段至339 bp片段编码的不同长度HCCS1蛋白呈散点状弥散分布于胞质以及胞核内.结论:确定了HCCS1cDNA 1 571 bp片段的3'端451 bp的序列为与HCCS1转运功能相关的最小区域范围.     

激光扫描共聚焦显微镜三维图像分析小鼠巨噬细胞吞噬功能

用激光扫描共聚焦显微镜观察不同月龄小鼠腹腔巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬过程,通过计算机三维图像重建系统清晰地再现了巨噬细胞吞噬异物时的三维立体结构。探讨了老龄小鼠巨噬细胞吞噬功能的特点。     

Penetration and Binding of Monoclonal Antibody in Human Osteosarcoma Multicell Spheroids: Comparison of confocal laser scanning microscopy and autoradiography

Penetration and binding of monoclonal antibody (MAb) in multicell osteosarcoma spheroids have been studied by autoradiography and confocal laser scanning microscopy (CLSM). Optical sectioning of the 3-dimensional spheroids was performed by CLSM. Owing to attenuation of fluorescence intensity, FITC-labelled MAb could not be detected at depths greater than 60 μm within the spheroids. The antibody uptake seen in autoradiographs and CLSM images 60 μm within the spheroids were essentially identical. MAb had reached all parts of the spheroids within 6 h. Quantitative measurements of the fluorescence intensity of FITC-labelled MAb seen in confocal images and measurements of MAb bound per cell using flow cytometry, showed that maximum uptake was reached after 6 h. The possibility to perform both quantitative and qualitative measurements makes CLSM a promising method for studying antibody uptake in thick tissue samples     

协同刺激分子B7-H3在结肠癌细胞株中的表达水平及其分布特征

目的研究协同刺激分子B7-H3在结肠癌细胞株中的表达及其细胞内亚细胞结构的分布特征。方法分别采用Real-time PCR、Western Blot方法检测B7-H3在三株结肠癌细胞SW620、SW480、DLD-1中mRNA和蛋白质的表达水平;激光共聚焦显微镜观察B7-H3分子在三株结肠癌细胞中的亚细胞定位。结果 SW620、SW480、DLD-1 Real-time PCR的B7-H3 mRNA△Ct值分别为21.11±0.07、21.18±0.39、21.45±0.18,F=1.3497,P=0.309;Western Blot检测B7-H3蛋白的表达水平无明显差别;B7-H3分子细胞核内的表达比例分别为0.462±0.07、0.329±0.039、0.411±0.025。SW480细胞B7H3核内分布比例与另两株细胞有明显差异(P<0.05)。结论不同结肠癌细胞株中B7-H3 mRNA与蛋白的表达水平无明显差异,细胞核内有部分B7-H3分子表达,且不同细胞株之间B7-H3的核内表达有一定差异。