低氧对人脐带间充质干细胞成脂肪分化的影响

目的：研究低氧（2%O2）对人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs）成脂肪分化的影响,为脂肪组织工程种子细胞的筛选提供实验依据。方法：培养条件有低氧（2%O2）、常氧（20%O2）、10%FBS完全培养基（GM）、10%FBS成脂培养基（DM）;将第3代hUCMSCs根据培养条件分为3组,对照组（常氧＋GM5天,常氧＋DM2周）、实验组1（低氧＋GM5天,低氧＋DM2周）、实验组2（低氧＋GM5天,常氧＋DM2周）;在诱导后2周分别进行油红O染色并观察其成脂效率。结果：与对照组相比,实验组1脂肪样细胞数量明显减少,实验组2脂肪样细胞数量明显增加。结论：将hUCMSCs预先进行低氧处理再转换为常氧培养可显著提高其成脂分化能力。     

3，4-二羟基苯甲酸乙酯预处理对白蛋白诱导低氧培养肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的 探讨脯胺酰羟化酶抑制剂3,4-二羟基苯甲酸乙酯（EDHB）对白蛋白诱导的低氧条件下培养的肾小管上皮细胞（NRK-52E）凋亡的影响。 方法 NRK-52E细胞在以下各组孵育24 h：常氧（5％CO2+空气）组,低氧（1％O2+5％CO2+94％N2）组,常氧+白蛋白（30 g/L）组及低氧+白蛋白（30 g/L）组,观察各组NRK-52E细胞的凋亡情况。然后NRK-52E细胞在以下各组孵育24 h：常氧组、低氧组,低氧+白蛋白（30 g/L）组,低氧+EDHB（500 μmol/L）组,EDHB预处理组（培养细胞中先加入EDHB 500 μmol/L,0.5 h后再加入BSA 30 g/L,低氧培养）,观察EDHB对白蛋白诱导低氧培养NRK-52E凋亡的影响。流式细胞技术检测细胞凋亡;RT-PCR检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax 及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA表达;Western印迹检测VEGF蛋白表达。 结果 NRK-52E细胞凋亡率在常氧组与低氧组差异无统计学意义 （P > 0.05）,但低氧+白蛋白组细胞凋亡率显著高于常氧+白蛋白组（37.36%±4.95%比25.59%±3.32%,P < 0.05）。低氧+白蛋白组bax mRNA表达显著高于常氧+白蛋白组（P < 0.05）,而bcl-2 mRNA的表达则显著低于常氧+白蛋白组（P < 0.05）。EDHB预处理可显著抑制低氧+白蛋白组细胞凋亡率的增高（P < 0.05）、bax mRNA表达的增高（P < 0.05）以及bcl-2 mRNA表达的降低（P < 0.05）。低氧组NRK-52E细胞VEGF mRNA和蛋白表达显著高于常氧组（P < 0.05）,而低氧+白蛋白组则显著低于低氧组（P < 0.05）。EDHB预处理可显著抑制低氧+白蛋白组细胞VEGF mRNA和蛋白表达的降低（P < 0.05）。 结论 白蛋白和低氧联合刺激可显著增加NRK-52E细胞凋亡,EDHB预处理可改善该病变,可能与其提高VEGF的表达有关。     

羧甲基壳聚糖通过抑制线粒体途径保护氧化损伤诱导雪旺细胞凋亡

[目的]探讨线粒体途径在羧甲基壳聚糖(carboxymethylated chitosan,CMCS)保护过氧化氢(H_2O_2)诱导雪旺细胞(Schwann cells,SCs)凋亡中的作用及机制。[方法]体外培养SCs,S-100免疫荧光染色鉴定。将SCs分为空白对照组、H_2O_2诱导组、H_2O_2加CMCS处理组。流式细胞仪检测细胞凋亡比率,罗丹明(Rhodamine123)荧光染色检测细胞线粒体膜电位水平,Western blot检测SCs内细胞色素C(Cytochrome C)表达水平。[结果]本实验培养细胞经S-100荧光染色鉴定阳性率达95%以上,H_2O_2诱导SCs凋亡,降低线粒体膜电位,增加细胞色素C释放;而在加入CMCS后SCs凋亡比例降低,线粒体膜电位增加,细胞色素C释放减少。[结论]CMCS通过抑制线粒体细胞凋亡途径保护H_2O_2诱导SCs凋亡。     

体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞向许旺细胞样细胞分化的研究

目的探讨体外定向诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)向许旺细胞样细胞转化的有效方法。方法分别进行成年大鼠许旺细胞原代培养和BMSC分离培养。根据诱导方法不同,分为化学诱导组和共培养诱导组。采用显微镜观察许旺细胞和BMSC的生长情况,分别采用免疫荧光化学染色法[检测神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)抗体和S-100抗体等许旺细胞标志蛋白]和流式细胞术鉴定两种细胞;显微镜下动态观察两组细胞的形态和生长情况;共培养诱导组共培养3 d后,化学诱导组诱导作用4 h、1 d后分别采用免疫荧光化学染色的方法评估两组细胞的诱导分化情况。结果化学诱导组诱导后的细胞发生了明显的许旺细胞样细胞形态改变,预诱导4 h后即出现GFAP抗体表达阳性,维持诱导1 d后,GFAP抗体阳性表达率为(80.9±3.5)%,S-100抗体阳性表达率为(59.0±1.1)%。诱导2 d后分化细胞开始出现脱落死亡,3 d后大部分分化细胞脱落死亡。共培养诱导组共培养3 d后,被诱导的BMSC未出现类似化学诱导组明显的细胞形态改变,GFAP抗体阳性表达率为(89.8±2.4)%,S-100抗体阳性表达率为(80.9±1.7)%。共培养诱导组S-100、GFAP抗体阳性表达率均高于化学诱导组,差异均有统计学意义(均为P0.01)。结论共培养诱导法不仅对BMSC向许旺细胞样细胞定向分化具有明确的效果,而且对BMSC的存活和增殖均有促进作用,因此该法相对于化学诱导法更加安全和有效。     

常氧条件下调控表达缺氧诱导因子1α对肝癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨在体外常氧条件下,诱导表达缺氧诱导因子1d（HIF-1α）对肝癌细胞（HepG2）增殖及侵袭能力的影响。方法利用Tet—on基因调控系统构建能诱导表达HIF-1α的HepG2^Tet-on-HIF-1α“细胞系;常氧条件下,噻唑兰法检测HIF-1α对细胞增殖、黏附能力的影响,Transwell法检测其对HepG2细胞侵袭能力的影响。结果常氧条件下,强力霉素（1μg／m1）可诱导HepG2^Tet-on-HIF-1α“细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达增加;增殖实验中,Dox（＋）组与Dox（一）组各时段吸光度A490nm值无差异（P〉0．05）;黏附实验中,Dox（＋）组的A490nm值明显高于Dox（-）组（P=0．008）;Dox（＋）组侵袭细胞数[（37．6114-8．424）个]明显高于Dox（-）组[（25．3334-8．117）个]（P〈0．01）。结论Tet—on基因调控系统可上调HIF-1α mRNA的转录并增加其蛋白的表达;常氧条件下,HIF-1α不影响HepG2细胞的增殖,但明显增加其黏附和侵袭能力。     

骨髓基质干细胞诱导成雪旺细胞的可行性及促轴突生长的体外功能实验

目的 探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)向雪旺细胞(SCs)分化的可行性,以及分化成类SCs的表型、分子及功能特征.方法 原代培养F344乳鼠BMSCs,流式细胞仪检测细胞表面特异标记CD29、CD44、CD45的表达;诱导干细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化,评价干细胞的生物学特性;采用碱性成纤维细胞生长因子和forskolin等诱导BMSCs向SCs分化,光镜观察诱导后细胞形态的变化;免疫荧光染色鉴定SCs特异性标记物S100和p75的表达;RT-PCR分析诱导前、后SCs相关基因的表达;培养大鼠背根神经节神经元,分别与诱导前后的BMSCs共培养,评价其促轴突生长的功能特性.结果 分离培养的鼠BMSCs CD29、CD44表达呈阳性,CD45表达呈阴性:干细胞诱导的成骨细胞茜素红染色阳性,脂肪细胞油红O染色阳性;BMSCs经过胶质细胞生长因子的作用,光镜下发现诱导的细胞形态与SCs相似;免疫荧光染色S100和p75阳性;RT-PCR结果S100、CD104均表达增强;与背根神经节神经元共培养,诱导后的BMSCs促进轴突生长的距离为(285.3±36.7)μm,与未诱导组BMSCs的[(113.5±11.5)μm]相比,差异有统计学意义(t=8.966,P=0.001).结论 BMSCs可诱导分化成SCs,其表型、分子及功能特征与SCs相似,诱导分化的BMSCs是一种理想的神经组织工程的种子细胞.     

低氧反应元件对低氧复氧状态下心肌细胞转染人血管内皮生长因子165基因表达的调控作用

目的研究9拷贝低氧反应元件（HRE）对低氧、复氧心肌细胞转染人血管内皮生长因子（hVEGF165）基因表达的调控作用。方法分离新生SD大鼠心肌细胞进行培养，将在HEK293T细胞进行包装后获得的腺相关病毒转染培养的心肌细胞。心肌细胞分为8组，采用无血清培养基，分别在低氧（氧浓度5％）、正常氧（氧浓度21％）条件进行培养．取低氧／复氧不同时段的心肌细胞或培养液，采用细胞免疫荧光法、ELISA法分别测定心肌细胞及培养液中hVEGF165蛋白表达情况；逆转录．聚合酶链反应（RT-PCR）法测定心肌细胞hvEGF165 mRNA的表达。结果病毒转染率约为87％；转基因低氧1组（A组）、2组（B组）及复氧1组（E组）培养液中hVEGF165蛋白含量显著升高（P〈0．01），细胞免疫荧光hVEGF165蛋白染色呈阳性；RT-PCR结果亦显示，转基因低氧1组（A组）、2组（B组）及复氧1组（E组）可见484bp目的条带。结论在低氧状态下，9拷贝HRE作为氧敏感调控开关，可促使心肌细胞转染的hVEGF165基因高度表达，而在复氧（正常氧浓度）状态下，hVEGF165因的表达即行中止。     

胚胎源脊髓组织诱导骨髓基质干细胞向神经元样细胞的分化

目的体外诱导大鼠骨髓基质干细胞（BMSC）分化为神经元样细胞。方法采用Percoll（密度：1．073g／ml）梯度分离液，离心分离鼠BMSC，体外培养，提取大鼠胚胎脊髓组织匀浆诱导BMSC分化为神经元样细胞。形态学观察及免疫组织化学鉴定神经元烯醇化酶（NSE）、神经丝蛋白（NF-200）、胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达。结果大鼠骨髓基质干细胞在诱导后细胞形态变化，突起交织；免疫组织化学发现分化细胞NSE、NF-200表达阳性率分别为（68．0±1．7）％，（76．2±2．9）％，少数GFAP阳性。结论胚胎脊髓组织匀浆可诱导骨髓基质干细胞分化为神经元样细胞。     

吸脂组织中脂肪干细胞分离和定向分化的研究

目的探讨吸脂组织中的干细胞分离和体外诱导分化为表皮样细胞、成骨细胞及脂肪细胞的可能性。方法通过电动负压吸引获取1例行吸脂手术的30岁女性腹部脂肪组织,酶消化法获取脂肪来源干细胞,体外培养扩增,通过流式细胞仪检测表面抗原的表达。取生长良好的第3代人脂肪来源干细胞,分别应用成表皮诱导培养液（70％培养液A＋30％成纤维细胞培养基上清液＋10ng／L表皮生长因子）,成骨诱导培养基（DMEM／10％FBS,0．1μmol／L地塞米松,50μmol／L维生素C,10mmol／Lβ-甘油磷酸钠,100U／ml青霉素,100U／ml链霉素）和成脂肪细胞诱导培养基（DMEM＋10％FBS＋500μmol／L1-甲基-3-异丁基黄嘌呤＋1μmol／L吲哚美辛）诱导20d后,分别对成表皮诱导组进行免疫组化检测CK19表达,成骨诱导组进行碱性磷酸酶检测,成脂诱导组进行油红O检测。结果流式细胞仪鉴定结果示,人脂肪来源干细胞CD44和CD49d为阳性,CD34为阴性。诱导20d后,成表皮诱导组示免疫组织化学鉴定结构显示有CK19的表达;成骨诱导组示细胞碱性磷酸酶染色阳性;成脂肪细胞诱导组示油红O染色,胞质内脂滴均被染成红色,证实为脂性液体。结论从吸出的脂肪组织中分离出脂肪来源干细胞,在体外进行了脂肪干细胞的扩增和传代,所分离的脂肪来源干细胞具备多向分化能力。     

羧甲基壳聚糖抗氧化损伤诱导雪旺细胞凋亡的作用及机制研究

[目的]探讨羧甲基壳聚糖(carboxymethylated chitosan,CMCS)对氧化应激诱导雪旺细胞(schwann cells,SCs)凋亡的保护作用及作用机制。[方法]体外培养SCs,S-100免疫荧光染色鉴定。将SCs分为空白对照组、H2O2诱导组、H2O2加CMCS处理组。通过CCK-8检测不同组SCs增殖情况,流式细胞仪计数检测SCs早期凋亡率,检测各组细胞内超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的含量,Real-time PCR技术检测Bcl-2及Bax mRNA表达水平,Western blot法检测Bcl-2,Bax,Caspase-3、-9的表达水平。[结果]H2O2诱导SCs后其细胞增殖活性明显降低,加入不同浓度CMCS后增殖活性增加。流式细胞技术检测结果表明,经H2O2诱导SCs早期凋亡率增加,加入50²00μg/ml CMCS后凋亡率逐渐降低。经H2O2诱导组SCs与空白对照组比较SOD含量明显减少,MDA含量明显增加(P<0.05);加入CMCS后SOD含量增加,MDA含量减少(P<0.05)。Real-time PCR及Western blot检测结果表明经H2O2诱导SCs内Bcl-2表达降低,Bax,Caspase-3、-9表达增高,加入CMCS后Bcl-2表达恢复,Bax,Caspase-3、9表达抑制。[结论]CMCS对H2O2诱导SCs凋亡具有保护作用。     

无血清诱导脂肪间充质干细胞向雪旺细胞分化的实验研究

目的探索无血清诱导脂肪间充质干细胞分化为雪旺细胞的方法。方法取大鼠双侧睾丸周围脂肪组织,分离培养原代脂肪间充质干细胞,CD90、CD44和CD45流式鉴定。将脂肪间充质干细胞分成两组,实验组无血清诱导培养,对照组有血清诱导培养。采用雪旺细胞化学诱导因子逐步诱导2周,比较形态学变化以及细胞免疫荧光S-100和GFAP阳性率。结果分离的脂肪间充质干细胞相关的CD90和CD44表达阳性,CD45表达阴性。诱导后两组形态学相似,实验组S-100、GFAP阳性率与对照组比较无明显差异(P0.05)。结论无血清诱导培养可作为诱导脂肪间充质干细胞向雪旺细胞分化的方法。     

人脂肪干细胞的体外培养鉴定及分化特性

目的：在体外从脂肪块中分离出脂肪干细胞（adipose derived stem/stromal cells,ASCs）,对其进行形态观察、干细胞鉴定、增殖和分化能力检测。方法：将腹部取皮术的皮下脂肪利用胶原酶消化法,进行体外分离培养,取第3代的细胞进行细胞爬片HE染色、流式鉴定、MTT、细胞周期检测等,利用成脂和成骨培养液诱导,油红O和茜素红染色鉴定诱导结果。结果：原代培养第1次换液时细胞多呈多角形和短梭形,第3代ASCs细胞爬片HE染色显示形态多为长梭形,呈漩涡状生长;流式鉴定显示：CD29＋,CD31-,CD34-,CD44＋,CD45-,CD49＋,CD106-,CD133-;MTT显示ASCs生长增殖活性强;细胞周期检测结果显示：G1=86.8%,G2=8.77%;成脂诱导后油红O染色阳性,对照组为阴性;成骨诱导后茜素红染色阳性,对照组为阴性。结论：人ASCs具有贴壁生长、多向分化以及干细胞表型等特征,且生长增殖活性强,是一种很有应用前景的间充质干细胞。     

成人骨髓间充质干细胞体外低氧培养及生物学特征

目的建立人骨髓间充质干细胞（human marrow mesenchymal stem cells,hMSCs）体外低氧培养及向成骨细胞分化的生物模型,研究其生物学特征,为骨组织工程提供实验依据。方法采用人淋巴细胞分离液分离健康成人hMSCs,DMEM-LG（含20%胎牛血清）中培养,10～14d后传代培养。取第2代细胞,根据培养氧浓度及培养基类型分为4组：正常氧组（20%O2加DMEM-LG,A组）、低氧组（1%O2加DMEM-LG,B组）、正常氧成骨诱导组（20%O2加条件培养基,C组）及低氧成骨诱导组（1%O2加条件培养基,D组）,通过细胞计数、细胞增殖测定（MTT法）、集落形成检测、RT-PCR检测、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性检测及茜素红染色,研究低氧环境对hMSCs生物学行为的影响。结果与A组相比,B组及D组中的hMSCs有较高的增殖速度,并且不受条件培养基的影响,比较差异有统计学意义（P〈0.01）。B组中的hMSCs生成的集落逐渐增多,A组9d后生成的集落数基本不发生变化。D组培养的hMSCs的ALP活性逐渐增高,但明显低于C组,两者差异有统计学意义（P〈0.01）。定量RT-PCR检测,C组ALP、骨钙素、Ⅰ型胶原蛋白及骨粘连蛋白mRNA表达量明显增加（P〈0.01）。培养4周后,与其他3组相比,C组可见到明显的钙盐沉积和染成红色的钙结节。结论低氧使hMSCs增殖率增加,集落形成能力增强,抑制向成骨细胞分化。     

人骨髓间充质干细胞向肝细胞诱导分化的进一步研究

目的：探索骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）向肝细胞诱导的最有效方法,并对诱导后的细胞进行鉴定。方法：取健康成人的适量骨髓,采用梯度密度离心法分离BM-MSCs并行贴壁培养,扩增至第3代,取第3代细胞分3组分别进行诱导。A组：肝细胞生长因子（HGF）＋表皮生长因子（EGF）;B组：肝细胞生长因子（HGF）＋成纤维生长因子（FGF）;C组：肝细胞生长因子（HGF）＋表皮生长因子（HGF）＋成纤维生长因子（HGF）。分别进行培养,诱导前通过流式细胞仪分析细胞表面标志CD44、CD90的表达率对培养的BM-MSCs进行鉴定,诱导后通过RT-PCR、免疫组织化学法、糖原染色检测鉴定其诱导分化情况。结果：本文通过建立从人骨髓中分离、培养、扩增、传代、纯化BM-MSCs,定向诱导分化,使其成功向肝样细胞转化,图像分析表明C组鼠抗人白蛋白单克隆抗体（ALB）表达最为明显。结论：证明3种组合均可成功将骨髓间充质干细胞向肝样细胞诱导分化,均能分泌肝细胞特异性标记如鼠抗人甲胎蛋白单克隆抗体（AFP）、ALB、糖原,其中C组效果最为突出。     

MicroRNA-129促进骨髓间充质干细胞向心肌分化的实验研究

摘要：目的研究microRNA．129（mir．129）对骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells,BM．MSCs）向心肌分化过程中的促进作用及其机制。方法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,通过慢病毒转染使细胞获得过表达基因分为4组：对照组（MSCs）;慢病毒空转组（Lentiviralvectors＋MSCs,Lv—MSCs）;mir-129单转染组（mir-129-MSCs）;mir-129＋糖原合成酶激酶（GSK-3p）双转染组（mir。129＋GSK-3p—MSCs）。以10gmol／L浓度的5-氮杂胞苷（5-Aza）诱导MSCs向心肌细胞分化后,分别以第1d、5d、10d、15d和20d为时间点,采用real—time—PCR检测GATA．4、NKx2．5、MEF-2C的mRNA水平,以第10d、15d、20d为时间点,用蛋白质印迹法（Westernblotting）检测肌钙蛋白I（cTnI）、结蛋白（Desmin）、GSK-3B以及磷酸化3-catenin与非磷酸化13-catenin的表达量。结果与对照组比较,随着研究时间点的推移,mir-129单转染组反映心肌分化的相关标记物基[夭I和蛋白水平明显升高,GSK-3B的表达水平则显著降低,非磷酸化13-catenin／磷酸化13-catenin比值升高;当MSCs同时过表达mir。129和GSK-3B时,相关的心肌标记物基因和蛋白均低于mir-129单转染组,非磷酸化13-catenin／磷酸化13-catenin比值明显降低。结论过表达mir．129能够促进MSCs向心肌细胞分化,可能的机制是通过抑制GSK-3B的生成,从而削弱了对13-catenin的磷酸化抑制,后者游离入核开启调控干细胞下游的心肌分化途径。     

镁合金对骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响研究

目的：探讨镁合金对人骨髓间充质干细胞（BMSCs）增殖及成骨分化的影响。方法抽取人骨BMSCs并予以鉴定;采用AZ31B镁合金浸提液培养人BMSCs 1、3、5、7 d,以普通培养基为对照组,CCK-8法检测细胞增殖活性;应用浸提液培养人BMSCs,诱导分化后检测成骨分化相关基因（COLⅠ、ALP、OPN）的表达。另设置调节pH值AZ31B组（pH-AZ31B组）,以观察pH值变化对实验结果的影响。结果 BMSCs表达CD34（-）、CD45（-）、CD44（＋）、CD73（＋）、CD90（＋）、CD105（＋）。浸提液培养1、3、5、7 d,AZ31B组细胞相对增殖率低于对照组（P＜0.05）,毒性评级为2级;对照组和pH-AZ31B组细胞活性较好,两组细胞相对增殖率比较,差异无统计学意义（P ＞0.05）。AZ31B组COLⅠ基因表达量与对照组比较,差异无统计学意义（P ＞0.05）;AZ31B组ALP基因表达量较低（P＜0.05）,pH-AZ31B组与对照组无显著差异（P＞0.05）;AZ31B组OPN基因表达量在诱导分化后6 d、12 d显著高于对照组（P＜0.05）,pH-AZ31B组与对照组无显著差异（P＞0.05）。结论镁合金对BMSCs增殖及成骨分化无不良影响,其影响可能与浸提液pH值的变化有关。     

低氧状态下联合培养骨髓基质干细胞及其诱导来源的内皮细胞的实验研究

目的在低氧条件下联合培养兔骨髓基质干细胞(Bone Marrow Stromal Cell,BMSC)及由其诱导而来的内皮细胞(Endothelial Cell,EC),观察并探讨低氧状态及EC对BMSC增殖的影响。方法从兔骨髓中分离获得BMSC,体外培养扩增后取部分向EC诱导。实验分4组:①BMSC常氧培养组;②BMSC低氧培养组;③BMSC+EC常氧联合培养组;④BMSC+EC低氧联合培养组。通过观察细胞的形态、增殖能力等了解低氧条件及EC对BMSC生长的影响。结果 BMSC可诱导为EC,EC与BMSC混合生长良好。MTT法检测显示,低氧培养组的细胞增殖能力明显高于常氧培养组(P<0.01),但相同条件下的BMSC单独培养组和BMSC+EC联合培养组间的细胞增殖能力没有显著性差异(P>0.05)。结论在一定时间内,低氧培养可以促进BMSC的增殖;BMSC来源的EC不能促进BMSC的增殖。