MxA基因真核表达载体构建及体外抗HBV作用研究

目的克隆人类MxA基因,探索其细胞内直接抗HBV作用,以便寻求HBV及其他病毒感染的新的基因治疗靶点。方法以pHMG—MxA质粒载体为基础,构建人类MxA基因表达质粒,采用人HBV—DNA转染的2．2．15细胞株作为研究对象,以不同浓度的MxA基因转染进行干预培养,lamivudine（3TC）阳性对照,同时设立空白对照,观察对HBV表达和复制的影响。结果经过酶切鉴定证明重组MxA基因表达质粒pcDNA—MxA构建正确,转染2．2．15细胞后呈现出明显抑制HBV复制和表达作用,且与转染剂量有关;3TC组也见MxA的表达增高,HBV—DNA复制受到明显抑制。结论抗病毒基因MxA具有细胞内抗HBV的复制及抑制病毒抗原基因的表达作用。     

HBV.CP—β—IFN真核表达载体的构建及鉴定

目的 扩增ＨＢＶ基因Ｃ区启动子,将其与β－干扰素基因进行连接,以构建真核表达载体,为下一步研究表达打下基础。方法 ＰＣＲ方法扩增ＨＢＶ基因Ｃ区启动子,产物经ＤＮＡ自动测序正确后,与表达干扰素的ｐ３．１ｃＤＮＡ（＋）－β－ＩＦＮ质粒进行粘端连接,并对构建真核表达载体进行限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）分析。结果 扩增出ＨＢＶ,ＣＰ,序列与报告资料基本一致;与ｐ３．１ｃＤＮＡ（＋）－β－ＩＦＮ真核表达载体。     

乙型肝炎病毒preS1基因真核表达载体的构建及表达

目的：构建含preS1基因真核表达质粒，探讨乙型肝炎病毒preS1基因在HBV入胞机制中的作用。方法：PCR法扩增含EcoR I与Pst I酶切点的preS1基因序列，PAS2-1载体及preS1基因PCR产物双酶切，经T4DNA连接酶将两者连接并转化到大肠杆菌JM105，对重组质粒经序列测定，命名为PAS 2—1—preS1。经乙酸锂转化法将重组质粒转化入酵母茵AH109，Western Blot法证实重组质粒在酵母细胞中的表达。结果：已构建的质粒PAS2—1-preS1经序列测定合有完整的preS1基因片段，转入酵母后经Western Blot证实酵母细胞正确表达preS1-BD融合蛋白。结论：PAS2—1—preS1的构建为通过酵母双杂交体系筛选体内与preS1蛋白相互作用的preS1相关蛋白，为进一步深入探讨preS1在HBV致病机制中的作用奠定了基础。     

乙型肝炎病毒核心启动子部分缺失真核表达载体的构建及对病毒抗原表达的影响

乙型肝炎病毒核心启动子 (ＣＰ)部分缺失变异已证实在几种ＨＢＶ感染的临床现象中存在[1 3 ] 。我们在一组 14例血清抗 ＨＢｅ阳性的无症状携带者中 ,发现有 9例在ｎｔ174 8(或ｎｔ174 7)至ｎｔ176 7间 2 0 (或 2 1)个核苷酸的缺失 ,此 9例中有 5例合并有ｎｔ1896Ｇ→Ａ点变异[4] 。本研究在此基础上 ,拟构建这种ＣＰ 2 0 / 2 1ｂｐ缺失及合并存在Ａ1896点变异的ＨＢＶ全基因重组真核表达载体 ,并转染ＨｅｐＧ2细胞 ,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响。一、材料与方法1 材料 :ＥＢＯ ｐｐｌｐ质粒由美国Ｓｃｒｉｐｐｓ研究所Ｆｒａｎ…     

HBx基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建重组HBx蛋白的真核表达载体pIRES2-AcGFP-HBx.方法 设计合成HBx基因的特异性PCR引物.PCR扩增获得HBx基因序列;将HBx基因序列克隆人T载体(pGEM-T-HBx);再用限制性内切酶BglⅡ和EcoR Ⅰ双酶切下目的片段,将其亚克隆人真核表达载体pIRES2-AcGFP;双酶切(Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ)和序列测定鉴定重组子;脂质体包裹pIRES2-AcGFP-HBx转染入HepG2细胞,G418筛选得到稳定表达HBx的细胞克隆,Western blot检测HBx蛋白在转染细胞中的表达情况.结果 PCR扩增获得全长HBx基因序列;双酶切筛选得到阳性重组子,测序分析证实插入序列正确;转染plRES2-AcGFP-HBx的HepG2细胞,荧光显微镜可观察到GFP的表达,Western blot 证实表达HBx蛋白.结论 成功构建重组HBx基因真核表达载体,获得稳定表达HBx蛋白的HepG2细胞株,为深入研究HBx蛋白的生物学功能提供实验条件.     

基因重组HBV的构建及其表达反义RNA抗-HBV作用的研究

目的　探索利用乙型肝炎病毒 (HBV)作为基因治疗载体的可能性及检验其表达反义RNA抗HBV的作用。方法　在表达完整HBV颗粒的质粒上 ,经基因修饰后分别表达S或S启动子区的反义RNA ,整合于具有HBV复制的 2 .2 .15细胞 ,形成细胞克隆 ,酶联免疫吸附 (ELISA)法检测细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg ,斑点杂交法检测细胞内HBV核壳中HBVDNA ,聚合酶链反应(PCR)法检测上清液中重组HBV颗粒。结果　 2 .2 .15 pMEP4组、2 .2 .15 SAS组和 2 .2 .15 PAS组对HBsAg平均抑制率分别为 (2 .74± 3.83) %、(6 6 .5 4± 4 .4 5 ) % (P <0 .0 1)和 (5 5 .18± 3.2 7) % (P <0 .0 1) ;对HBeAg平均抑制率分别为 (4 .4 6± 4 .2 5 ) %、(2 6 .36± 1.6 9) % (P <0 .0 1)和 (6 5 .5 4± 3.2 2 ) % (P <0 .0 1) ;对HBV复制的抑制率分别为 17.0 %、5 9.9%和 72 .8%。 2 .2 .15 SAS组及 2 .2 .15 PAS组培养上清液中能检测出突变型HBV颗粒。结论　经过对HBV基因组的两处改造 ,分别在细胞内表达S区及S启动子区反义RNA具有干扰HBV复制及抑制HBV抗原表达的作用 ;在 2 .2 .15细胞中野生型HBV辅助下 ,仍能包装并分泌完整的HBV样颗粒     

乙型肝炎病毒前S2基因酵母表达载体的构建及表达

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白的功能。方法：以质粒pCP10 (含有HBV ayw亚型全长序列)为模板，多聚酶链反应（PCR）扩增HBV前S2基因，克隆到pGEM-T载休整 ，测序鉴定、酶切后回收，与酵母表达质粒pGBKT7连接。将重组载体转化酵母细胞AH109，提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HBV前S2基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示HBV前S2蛋白在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，分子量24kD左右。结论：HBV前S2蛋白在酵母细胞中表达成功。     

乙肝病毒S基因区反义寡核苷酸对表面抗原表达的抑制作用

为了研究硫代反义寡核苷酸的抗乙型肝炎病毒作用，以２．２．１５细胞为靶细胞，在ＨＢＶ Ｓ基因起始区设计了１段ＡＳＯＮ，用酶联免疫吸附法检测了作用细胞的ＨＢＶ的分泌情况。结果显示，ＡＳＯＮ在每天给予２μｍｏｌ／Ｌ的浓度情况下抑制８８％的ＨＢｓＡｇ产生，无关序列的寡核苷酸无明显抑制作用，同时未见ＡＳＯＮ的细胞毒作用。     

携带人beta干扰素基因的人乙型肝炎特异性真核表达载体的构建

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)C区启动子调控的人β干扰素(IFN-β)基因的真核表达载体.方法切除真核表达载体pcDNA3.1(+)-DT390-VEGFexon7内部的CMV启动子及DT390序列使之成为p3.1V7;从逆转录病毒载体pMNSM-IFN-β质粒中游离人β干扰素基因;用PCR方法从pGEM.7Z-HBV质粒中扩增人乙型肝炎病毒(HBV)的C区启动子序列;通过转换酶切位点,将HBV C区启动子和人β干扰素基因共同插入到p3.1V7中,构建成受HBVC区启动子控制的人β干扰素基因真核表达载体p3.1V7-HBV.CP-IFN-β.结果构建完成携带人β干扰素基因的人乙型肝炎特异性真核表达载体.结论该载体为慢性病毒性肝炎的特异性干扰素基因治疗奠定了基础.     

携带人β干扰素基因的人乙型肝炎特异性真核表达载体的构建

目的构建乙型肝炎病毒(HBV)C区启动子调控的人β干扰素(IFN-β)基因的真核表达载体.方法切除真核表达载体pcDNA3.1(+)-DT390-VEGFexon7内部的CMV启动子及DT390序列使之成为p3.1V7;从逆转录病毒载体pMNSM-IFN-β质粒中游离人β干扰素基因;用PCR方法从pGEM.7Z-HBV质粒中扩增人乙型肝炎病毒(HBV)的C区启动子序列;通过转换酶切位点,将HBV C区启动子和人β干扰素基因共同插入到p3.1V7中,构建成受HBVC区启动子控制的人β干扰素基因真核表达载体p3.1V7-HBV.CP-IFN-β.结果构建完成携带人β干扰素基因的人乙型肝炎特异性真核表达载体.结论该载体为慢性病毒性肝炎的特异性干扰素基因治疗奠定了基础.     

核酶在2.2.15细胞内抗乙肝病毒作用

目的:研究针对乙型肝炎病毒前基因组RNA双靶位自剪切核酶在细胞内对HBV复制和表达的抑制作用,进一步探讨如何提高核酶在细胞内的催化效率。方法:人工合成核酶基因片段,利用分子克隆技术,定向克隆到pGEM3ZF(-)质粒的EcoR I、HindⅢ位点中,构建出核酶的自剪切转录载体,再切下核酶基因片段,克隆到pBBS212质粒上构建核酶的真核表达载体。通过脂质体介导的基因转染方法将其导入2.2.15细胞中,观察核酶在细胞内对HBsAg、HBeAg表达的抑制作用。结果:核酶对HBsAg、HBeAg表达的抑制率分别达55％、28％。结论:研究结果表明该双靶位核酶可以在2.2.15细胞内对HBV的复制和表达有明显的抑制作用。     

乙型肝炎病毒C基因逆转录病毒载体的构建及在永生化人外周？…

目的体外研究乙型肝炎病毒Ｃ（ＨＢＶ／Ｃ）基因变异的生物学意义。方法 应用逆转 录病毒勒体ＰＸＴ１构建ＨＢＶ／Ｃ基因表达载体，并转染永生化人外周血Ｂ细胞使之稳定ＨＢｃＡｇ。结果 重组质粒ＰＸＴ１－ＨＢＶ／Ｃ经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢｇｌⅡ及ＸｈｏⅠ双酶切鉴定均阳性，转染后的永生化人外周血Ｂ细胞ＰＣＲ鉴定含目的ＤＮＡ，流式细胞仪分析显示，约４７．４％的细胞膜上表达了ＨＢｃＡｇ。结论ＨＢＶ／Ｃ基因逆转     

HBcAg基因和PreS1（1～65）肽基因真核重组载体的构建和鉴定

目的:构建并鉴定包含人乙型肝炎病毒(HBV)HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因的真核重组载体.方法:采用PCR法扩增HBcAg基因,并通过基因突变在79～80位氨基酸处生成一个Nhe I酶切位点,然后将这段基因连接到真核表达载体pIRES2-EGFP启动子下游的EcoR I和BamH I之间.同时PCR扩增PreS1第1～65氨基酸基因,并在其两端分别引入Nhe I酶切位点,通过酶切、连接,将这段基因插入到HBcAg基因的Nhe I酶切位点上.将构建的重组载体pIREScS1转化大肠杆菌DH5α,分别用上述内切酶双酶切及DNA测序鉴定重组质粒.结果:酶切鉴定示,插入片段大小均与预计相符.测序结果与已知序列结果一致.结论:成功构建了HBcAg基因和PreS1(1～65)肽基因的真核重组载体.     

反义寡核苷酸抗HBV作用的双峰现象

ＨＢＶ基因组含３－２ｋｂＤＮＡ,有至少４个ＯＲＦ,其中Ｓ区包含Ｓ基因,ｐｒｅＳ１基因和ｐｒｅＳ２基因,编码形成大、中、小３种蛋白,构成ＨＢＶ的包膜蛋白（ＨＢｓＡｇ,ｐｒｅＳ１Ａｇ,ｐｒｅＳ２Ａｇ）．其中ＨＢｓＡｇ在体内引起的免疫病理反应是ＨＢＶ感染中的重要致病机制,ｐｒｅＳ２Ａｇ较ＨＢｓＡｇ有更强的抗原性,并具有反式激活作用,在ＨＢＶ感染及肝癌发生中关系密切．因而如何从基因水平抑制ＨＢｓＡｇ和ｐｒｅＳ２Ａｇ的表达,对抗ＨＢＶ治疗有重要意义．我们设计了针对Ｓ基因翻译起始区和ｐｒｅＳ２基因翻译起…     

HBeAg特异性细胞免疫反应体外抗乙肝病毒作用

目的探讨体外HBeAg特异性细胞免疫反应对乙型肝炎病毒(HBV)mRNA表达及蛋白合成的影响。方法自正常人外周血单核细胞中诱导培养树突状细胞(DC),经不同浓度的HBeAg负载后与自身T细胞共同培养,诱导产生HBeAg特异性T细胞,同时设与无HBeAg刺激的DC共同培养的T细胞、单纯T细胞为对照组,作用于HepG2.2.15细胞系,逆转录PCR(RT-PCR)检测HepG2.2.15细胞内乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)的mRNA水平,酶联免疫法(ELISA)检测细胞培养上清中HB-sAg和乙肝e抗原(HBeAg)水平。结果经HBeAg刺激激活的T细胞可以有效地抑制HBsAg、HBcAg mRNA的表达(P0.05)及HBsAg、HBeAg的合成(P0.05),且随着HBeAg刺激浓度的升高,对上述指标的抑制率逐渐上升。结论HBeAg特异性细胞免疫反应可显著抑制HBV mRNA和蛋白的表达,为开发HBeAg相关的治疗性疫苗奠定理论基础。     

硫代磷酸反义寡核苷酸对乙型肝炎病毒抗原表达的体外抑制作用

目的 研究硫代磷酸反义寡核苷酸（Ｓ－ＡＳＯＮ）的抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）作用。方法 作者以２．２．１５细胞作为研究对象，在ＨＢＶ基因Ｓ区和Ｃ区的翻译起始位点设计合成了２段１６聚Ｓ－ＡＳＯＮｓ，采用酶联免疫吸附试验检测了培养细胞上清中表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）的分泌情况。结果 当Ｓ－ＡＳＯＮ浓度为每天２μｍｏｌ／Ｌ时，对ＨＢｓＡｇ和ＨＢｅＡｇ的抑制率可分别达到８８％和７５％，而无关     

反义核酸抗乙型肝炎病毒基因治疗基础研究

为寻找抗乙型肝炎病毒新制剂，我们合成一系列互补于ＨＢＶ不同基因位点的反义硫代寡核苷酸，应用ＨＢＶ基因转染的Ｈｅｐ－Ｇ２－２．２．１５细胞证明：反义核酸抑制ＨＢＶ基因表达具有序列特异性、剂量相关性、时效依赖性、修饰增强性、联合协同性、对宿主细胞无害性等高效无毒特点。     

乙型肝炎病毒e抗原真核表达载体的构建及在酵母中的表达

为探讨乙型肝炎病毒(HBV)e抗原(HBeAg)的功能，用多聚酶链反应(PCR)的方法以HBV ayw亚型全序质粒pCP10为模板扩增HBeAg基因，克隆到pGEM—T载体中扩增并测序，鉴定符合GenBank报告序列。用EcoRI和Pstl双酶切后回收片段，连接到真核表达载体pGBK17中并转化酵母AH109，在色氨酸缺陷型培养基(SD／—Trp)上筛选阳性菌落。提取阳性酵母菌的蛋白质，进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和Western免疫印迹分析，显示HBeAg基因在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，相对分子质量(MT)为43000左右。     

HBeAg真核表达载体的构建及其在中国仓鼠卵巢细胞中的表达

目的 克隆HBeAg基因,构建重组HBeAg真核表达载体,并在中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中进行表达.方法 采用PCR法从HBeAg阳性乙型肝炎患者血清HBV DNA中扩增HBeAg基因,克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,构建重组pcDNA-HBeAg真核表达载体,经PCR、双酶切、测序鉴定后,将其转染入CHO细胞,G418筛选,用PCR、免疫斑点、Western Blot、免疫细胞化学方法检测HBeAg在CHO细胞中的表达.结果 成功克隆到HBeAg基因,并构建了重组pcDNA-HBeAg真核表达载体;基因测序证实克隆的HBeAg基因中共有12个位点发生单碱基置换突变(C1819G,A2007T,C2046T,C2061G,G2106A,C2109A,C2146T,T2172C,C2203T,A2235G,G2253A,C2298T),1个位点发生缺失突变(2346 del T);成熟HBeAg蛋白中149位缬氨酸(valine,V)突变为苯丙氨酸(phenylalanine,F)(V149F),在HBeAg蛋白羧基端融合有一段长11个氨基酸的多肽(RLESRGPVZTR).PCR、免疫斑点、Western Blot和免疫细胞化学方法证实重组pcDNA-HBeAg真核表达载体可在CHO细胞中表达分泌型HBeAg蛋白.结论 重组HBeAg真核表达载体的构建和表达为HBeAg的临床诊断和深入研究提供了条件.