乙型肝炎病毒核心区DNA疫苗接种后H-2d小鼠的特异性免疫应答

目的观察乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）核心区ＤＮＡ疫苗接种后ＢＡＬＢ／ｃ（－２ｄ）小鼠的特异性免疫应答。方法构建ＨＢＶ核心区ＤＮＡ疫苗（ＰＪＷ４３０３／ＨＢｃ）;用基因枪法和肌肉注射祛将该ＤＮＡ疫苗接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠;ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢＣ（ＩｇＧ）及ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）;５１铬释放法检测小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性ＣＴＬ活性。结果该ＤＮＡ疫苗在体外转染细胞中可良好表达ＨＢｃＡｇ。血清抗－ＨＢｃ终点滴度在ＤＮＡ疫苗基因枪组和肌肉注射接种组小鼠分别为１：３２８０５０和１：１０９３５０．两组小鼠的抗－ＨＢｃＩｇＧ亚类均以ＩｇＧ２ａ略占优势。两组小鼠的ＨＢＣＡｔｈｅ异性ＣＴＬ杀伤活性分别达到５１．１％和５５．２％。结论ＨＢＶ核心区ＤＮＡ疫苗在小鼠实验中具有良好的细胞免疫和体液免疫原性。     

基因疫苗诱导小鼠抗HBV皮下移植瘤免疫研究

目的　观察 ＨＢＶ ＤＮＡ 疫苗（ｐＣＲ３－１Ｓ） 诱导Ｂａｌｂ／ ｃ 小鼠（ Ｈ２ｄ） 的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ 的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５ 细胞（Ｐ８１５ＨＢＶＳ） （ Ｈ２ｄ） 成瘤性的影响．方法　肌肉注射ＤＮＡ 疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５ＨＢＶＳ 细胞,观察成瘤情况,４ ｈ ５１Ｃｒ 释放法检测小鼠脾细胞ＣＴＬ 活性．结果　接种 ＤＮＡ 疫苗后小鼠成瘤率为１２－５ ％ , 对照组为１００ ％ ． 小鼠平均存活期大于３８－２ ｄ ,对照组为２８－４ ｄ ,４０ ｄ 后小鼠存活率为８７－５ ％ ,对照组为０ ％ ． ＣＴＬ 细胞杀伤活性明显增加,ｐＣＲ３－１Ｓ 组５１ ％ ,对照组为２１ ％ （ Ｐ＜ ０－００１） ．结论　ＤＮＡ 疫苗可以诱导细胞免疫应答,对体内ＨＢＶ 感染具有预防及治疗作用．     

重组丙型肝炎病毒基因转染H9细胞模型的建立

目的：建立重组ＨＣＶ基因转染的Ｈ９细胞（人ＣＤ４，Ｔ细胞）模型。方法：以载体ＣＤＺ２（连接有１６９３ｂｐＨＣＶＤＮＡ，包括完整的ＨＣＶ结构区）为模板，通过ＰＣＲ获得高保真的１．７３ｋｂＤＮＡ片段（包括１６９３ｂｐＨＣＶｃＤＮＡ和部分载体ＤＮＡ序列），其特异性被ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ证实。将ＨＣＶｃＤＮＡ片段插入载体ｐＣＤ－ＳＲα，经菌落原位杂交以及酶切分斤和ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｏＩｔ筛选，获得重组ＨＣＶ（ｐＣＤ－ＨＣＶ），并与ｐＳＶ２－ｇｐｔ载体共转染Ｈ９细胞。结果：从选择性培养基中筛选口阳性克隆细胞，经ＲＴ－ＰＣＲ．ｄｏｔＥＬＩＳＡ和ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证表明ｐＣＤ－ＨＣＶ在Ｈ９细胞中可进行复制、转录和表达，表达的约１．３×１０５大小蛋白具有ＨＣＶ抗原性。转染ｐＣＤ－ＨＣＶ的细胞培养至９０天时，仍可检测到ＨＣＶｍＲＮＡ和ＨＣＶ抗原。结论：建立ｐＣＤ－ＨＣＶ转染的Ｈ９细胞模型获得成功。     

DNA疫苗诱导小鼠细胞免疫及抗肿瘤免疫研究

目的 观察ＨＢＶＤＮＡ疫苗诱导ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠（Ｈ－２＾ｄ）的特异性细胞免疫应答及其对稳定表达ＨＢｓＡｇ的小鼠肥大细胞瘤Ｐ８１５细胞（这５－ＨＢＶ－Ｓ）（Ｈ－２＾ｄ）成瘤性的影响。方法 肌肉注射ＤＮＡ疫苗,背部皮下接种Ｐ８１５－ＨＢＶ－Ｓ细胞,观察成瘤情况,４ｈ＾５１Ｃｒ释放法不细胞细胞毒Ｔ淋细胞（ＣＴＬ）活性。结果 ＤＮＡ疫苗可以降低成瘤率,抑制成长小鼠存活期和提高小鼠存活率。ＣＴＬ细胞杀伤活性     

HBcAg DNA疫苗诱导小鼠（H—2^b）特异性细胞和体液免疫应答

目的 观察ＨＢｃＡｇ ＤＮＡ疫苗（ｐＪＷ４３０３／ＨＢｃ）免疫Ｃ５７ＢＬ／６小鼠（Ｈ－２＾ｂ）的特异性细胞和体液免疫应答。方法 基因枪和肌肉注射两种方法接种ＤＮＡ疫苗;ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗－ＨＢｃ（ＩｇＧ）及ＩｇＧ亚类（ＩｇＧ１,ＩｇＧ２ａ）;＾５１铬释放法检测小鼠脾细胞ＨＢｃＡｇ特异性ＣＴＬ活性。结果 该ＤＮＡ疫苗体外可表达ＨＢｃＡｇ;小鼠经基因枪或肌肉注射接种该疫苗后血清抗－ＨＢｃ滴度分     

乙型肝炎病毒C基因变屉对人白细胞抗原表达的影响

目的 阐明我国常见的ＨＢＶ／Ｃ变异对宿主细胞人类白细胞抗原（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ，ＨＬＡ）表达的影响。方法 构建携带野生型和变异型ＨＢＶ／Ｃ基因的真核细胞表达载体，转染ＨｅｐＧ２细胞，鉴定目的基因在宿主细胞中的表达，检测ＨＬＡ－１，ＨＬＡ－ＤＲ在宿主细胞膜上的表达。结果 ＰＣＲ和Ｗｃｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析能分别检测到目的ＤＮＡ片段和ＨＢｃＡｇ的表达，约１００％的ＨｅｐＧ     

HBsAg HBeAg作用PBLs对TCR Vβ基因表达的影响

目的探讨乙肝病毒（ＨＢＶ）与肝癌的相关性．方法取用乙肝疫苗注射３次前后外周血淋巴细胞（ＰＢＬ）；ＨＢＶＤＮＡ转染的ＨｅｐＧ２２２１５株培养上清（ＨＢｓＡｇ，ＨＢｅＡｇ阳性）感染健康人ＰＢＬ后进行ＴＣＲＶβ基因１－２０亚家族表达水平的分析．结果乙肝疫苗注射后及ＨｅｐＧ２２２１５株培养上清感染健康人ＰＢＬ后ＴＣＲＶβ６，１４；Ｖβ６，１５特异性扩增而表达水平显著增高．结论Ｖβ６可能为识别ＨＢＶ抗原或引发免疫应答的基因片段，但Ｖβ１４，１５各自在限制和杀伤功能方面起着重要的作用，这从分子水平上又证明了ＨＢＶ与肝癌的关系     

丙型肝炎病毒核心基因免疫研究

目的研究丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）核心（Ｃ）基因免疫用于预防和治疗ＨＣＶ感染的可行性和有效性．方法将ＨＣＶＣ基因片段插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３质粒ＣＭＶ启动子的下游，在证实其可以在小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０（Ｈ２ｄ）中表达之后，将重组质粒注射ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２ｄ）小鼠股四头肌，ＥＬＩＳＡ检测血清中抗体产生水平；３ＨＴｄＲ掺入法测定免疫小鼠淋巴细胞ＨＣＶＣ抗原特异性增殖能力，４ｈ５１Ｃｒ释放法检测免疫小鼠细胞毒Ｔ细胞（ＣＴＬｓ）体外杀伤功能．结果免疫小鼠２０只，初次免疫２ｗｋ后，血清中均出现了ＨＣＶＣ抗体，且增加免疫剂量可提高抗体滴度；淋巴细胞增殖指数为６１０，明显高于对照组（Ｐ＜００１），ＣＴＬｓ体外特异性杀伤率为６３１％，也高于对照组（Ｐ＜００１）．结论ＨＣＶＣ基因免疫不仅可以诱导机体产生特异性的体液免疫，而且产生特异性的细胞免疫，它可能是防治ＨＣＶ的有效方法．     

乙型肝炎病毒前C／C基因区硫代和脂肪链—硫代反义寡核苷酸的体外抗…

为了研究修饰的反义寡核苷酸（ＡＳＯＮ）的抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）作用。以２．２．１５细胞为靶细胞，在ＨＢＶ前Ｃ／Ｃ基因区设计合成了１６聚硫代和脂肪链－硫代两种修饰的ＡＳＯＮ，用酶联免疫吸附和斑点杂交技术分别检测作用细胞的乙型肝炎病毒表面抗原（ＨＢｓＡｇ）和ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）以及ＨＢＶ ＤＮＡ的分泌情况。结果显示，ＡＳＯＮ在浓度为１０μｍｏｌ／Ｌ时能特异性抑制细胞９２％￣９５％ＨＢｓＡｇ和８４％￣     

可溶性白细胞介素-2受体、CD+25细胞与急性移值物抗宿主病关系的研究

目的　研究造血干细胞移植期（ＨＳＣＴ）细胞因子及受体水平的变化、免疫重建与急性移植物抗宿主病（ａＧＶＨＤ）的关系,以探讨临床预测ａＧＶＨＤ的指标。方法　２２例ＨＳＣＴ患者,采用双夹心ＥＬＩＳＡ动态监测血清细胞因子及受体白细胞介素－６、白细胞介素－８、干扰素－γ、肿瘤坏死因子－ａ、可溶性白细胞介素－２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）水平的变化、流式细胞仪检测移植后淋巴细胞亚群ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋细胞的重建。结果 ２２例患者均获得造血重建,６例发生Ｉ度ＧＶＨＤ,４例发生Ⅲ－Ⅳ度ＧＨＶＤ。ｓＩＬ－２Ｒ在ａＧＶＨＤ发生组于移植后第２周上升,第３周达峰值,Ⅲ－Ⅳ度ＧＶＨＤ峰值为（４２０．３±５９．８）Ｕ／Ｌ,Ｉ度ＧＶＨＤ峰值为（２２１．５±３８．８）Ｕ／Ｌ,早于ａＧＶＨＤ的症状出现,与疾病的严重程度显著相关,随症状的缓解而下降。其他细胞因子水平的变化与ａＧＶＨＤ的发生无明显关系。ＣＤ２５＋细胞的升高与ｓＩＬ－２Ｒ一致。结论分析移植后患者血清细胞因子水平的变化及免疫重建可以预测ａＧＶＨＤ的发生,ｓＩＬ－２Ｒ、ＣＤ２５＋细胞在ａＧＶＨＤ发生之前明显上升,是预测ａＧＶＨＤ的指标。     

HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达

１．材料与方法：乳哺动物细胞表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ,长约４．５ｋｂ,带有Ｔ_７公用序列。ｐＣＰ１０是ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ位点中插入双拷贝头尾相接的ＨＢＶａｙｗ亚型全基因ＨＢＶＤＮＡ重组质粒。ＰＣＲ引物ＸＩ１：１４２８－１４４８ｎｔ５'ＣＧＴ　ＣＣＣＧＴＣ　ＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣ３',ＸＩ_２：１６７２－１６５３ｎｔ５'ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧ３'。人肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１,出上海细胞所提供。将ＥｃｏＲＩ酶切后回收的全基因ＨＢＶ片段。在Ｔ_４ＤＮＡ连接酶作用下,与ＥｃｏＲＩ酶切…     

含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（SjFABPc）基因DNA重组质粒 …

目的 观察裸ＤＮＡ重组质粒ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ在体外转染ＨｅｐＧ２细胞以及质粒ＤＮＡ免疫鼠肌组织中的表达，为进一步应用该质粒进行ＤＮＡ免疫实验奠定基础。方法 用脂质体介导ＤＮＡ转染法将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ转染贴壁细胞ＨｅｐＧ２，Ｇ４１８加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定目的基因在ＨｅｐＧ２细胞中的表达，将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ质粒肌注免疫ＢＡＬＢ     

HLA部分不相合异基因外周血干细胞移植造血重建

目的：了解ＨＬＡ部分不相合异基因外周血干细胞移植（ＡＬＬｏ－ＰＢＳＣＴ）后造血功能重建情况,及在发生严重移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）时对造血功能的影响。方法：对患者移植后的血象、骨髓象,生化指标进行动态观察并分析结果。结果：移植后,＋ １３ ｄ 白细胞达２．２×１０９／Ｌ;＋ ２０ ｄ 骨髓增生活跃;＋ ４６ ｄ ＡＢＯ 血型、ＭＮ 血型、ＨＬＡ表型、ＨＬＡ ＤＮＡ分型均转为供型者,显示移植物植入成功。＋ １０ ｄ 开始出现ＧＶＨＤ征象,＋ ２９ ｄ 达ＧＶＨＤⅢ度,经用马抗人胸腺细胞球蛋白（ＡＴＧ）、ＣＤ３ 单抗、ＣＤ２５单抗后,症状消失。同时造血功能明显受抑。结论：①ＡＬＬｏ－ＰＢＳＣＴ造血重建过程中,应用Ｇ－ＣＳＦ可促使移植干细胞加快分化、增殖。②发生严重ＧＶＨＤ后,用ＡＴＧ等药物抑制Ｔ细胞,同时减少Ｔ细胞分泌ＧＭ－ＣＳＦ等相关细胞因子,致造血功能受抑制。     

基因工程干扰素 α-2b 加CD_3AK治疗慢性乙型肝炎

４５例慢性活动性乙型病毒性肝炎随机分为三组。Ａ组用干扰素α－２ｂ（ＩｎｔｒｏｎＡ，干扰能）加经ＣＤ３单克隆抗体激活的杀伤细胞（ＣＤ３ＡＫ）；Ｂ组单用α－２ｂ；Ｃ组为对照组。结果：Ａ组ＨＢｅＡｇ和ＨＢＶＤＮＡ近期阴转率为７３．３％，远期疗效为５３．３％；Ｂ组分别为４６．７％和３３．３％。两组均明显优于对照组。表明α－２ｂ可有效抑制ＨＢＶ复制，加用ＣＤ３ＡＫ可增强对乙肝病毒的抑制作用。     

丁型肝炎病毒体外短期细胞培养系统的建立

为建立ＨＤＶ的体外细胞培养系统，采用体外细胞转染技术，用含基因ＨＤＶｃＤＮＡ三聚体的重组质粒ｐＳＶＬＤ３转染ＨＢＶ的体外细胞培养株（２．２．１５细胞株）。结果在转染后３天的转染细胞内和培养上清中检出了１．７ＫｂＨＤＶＲＮＡ和２４０００、２７０００ＨＤＡｇ。初步结果提示，该转染细胞培养上清中有ＨＤＶ病毒的排泌，从而建立了ＨＤＶ的体外短期培养系统。     

慢性乙型肝炎和肝硬化中乙型肝炎病毒X抗原表达的分析

用基因工程技术由大肠杆菌合成重组乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）Ｘ抗原（ＨＢｘＡｇ）并制备兔抗－ＨＢｘＩｇＧ以检测ＨＢｘＡｇ，合成一对以ＨＢＶＸ基因序列为模板的引物，用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术扩增ＨＢＶＤＮＡ。免疫组织化学和血清学方法分别用以分析肝病患者肝组织中的ＨＢｘＡｇ和血清标本中的ＨＢｘＡｇ、抗－ＨＢｘ。发现ＨＢｘＡｇ在慢性活动性肝炎（ＣＡＨ）患者肝组织中检出率为７２．７％，在肝炎后肝硬化（ＬＣ）中为９２．６％，而乙型肝炎核心抗原（ＨＢｃＡｇ）在ＬＣ中检出率为４７．８％。在ＣＡＨ、慢性迁延性肝炎和ＬＣ的血清中ＨＢｘＡｇ的阳性率分别为４４．４％、６６．６％和３３．３％，与ＨＢｅＡｇ的阳性率相似，而且在这些ＨＢｘＡｇ阳性的血清中可检出ＨＢＶＤＮＡ的存在，ＨＢｘＡｇ的表达与ＨＢＶ复制紧密相关，ＨＢｘＡｇ可能是一慢性ＨＢＶ感染的重要标志物。     

慢性重型肝炎患者外周血单个核细胞内干扰素和白细胞介素的表达及意义

目的探讨慢性重型肝炎（ＣＳＨ）病人外用血单个核细胞（ＰＢＭＣ）内干扰素－γ（ＩＦＮ－γ）及白细胞介素－４（ＩＬ－４）的表达及其临床意义。方法常规分离ＰＢＭＣ,在ＰＭＡ、Ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ、Ｍｏｎｅｎｓｉｎ的刺激下,采用流式细胞术（ＦＡＣＳ）,对１７例ＣＳＨ患者及１９例正常健康者ＣＤ４＋Ｔ细胞内ＩＦＮ－γ和ＩＬ－４的表达进行分析,并应用荧光定量聚合酶链反应检测ＨＢＶ ＤＮＡ含量。结果 ＣＤ４＋Ｔｈ１、 Ｔｈ２细胞在ＣＳＨ组分别为７．２％—２６．３％（平均１５％）和０、ｌ％—１０．９％（平均２．０％）,正常对照组则分别为２．２％—１１．９％（平均５．９％）和０．４％—３．９％（平均２．２％）;ＣＤ４＋Ｔｈ１细胞百分数两组间差异有显著意义（Ｐ＜０．０１）。荧光定量ＰＣＲ结果表明ＣＳＨ组中１３例ＨＢＶ　ＤＮＡ阳性,其ＨＢＶ ＤＮＡ的含量与ＩＦＮ－γ表达细胞百分数呈负相关。结论 Ｔｈ１细胞与肝脏的炎症活动明显相关,ＩＦＮ－γ的表达对ＨＢＶ复制可能具有一定的影响。     

氧化低密度和极低密度脂蛋白对单核细胞血小板源性生长因子B链表达的影响

在单核细胞的培养基中分别加入２５ｍｇ·Ｌ￣（－１）低密度脂蛋白（ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＬ）、氧化ＬＤＬ（ｏｘｉｄｉｚｅｄＬＤＬ，ＯＬＤＬ）、极低密度脂蛋白（ｖｅｒｙｌｏｗｄｅｎｓｉｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＶＬＤＬ）和氧化极低密度脂蛋白（ｏｘｉｄｉｚｅｄＶＬＤＬ，ＯＶＬＤＬ），培养２４ｈ后再用无血浆脂蛋白培养基收集条件培养基，并观察此条件培养基对￣３Ｈ－ＴｄＲ投入血管壁平滑肌细胞ＤＮＡ的影响。用抗血小板源性生长因子Ｂ链抗体（抗ＰＤＧＦ－Ｂ抗体）作疫组织化学染色。结果表明，单核细胞能表达ＰＤＧＦＢ，ＯＬＤＬ和ＯＶＬＤＬ能明显地促进单核细胞ＰＤＧＦ－Ｂ的表达，其条件培养基亦能促进￣３Ｈ－ＴｄＲ掺入平滑肌细胞ＤＮＡ内。上述结果提示，ＯＬＤＬ和ＯＶＬＤＬ通过加强单核细胞分泌ＰＤＧＦ－Ｂ并促进平滑肌细胞增殖而在动脉粥样硬化的发病过程中起作用。     

LAK细胞治疗慢性乙,丙型肝炎疗效及免疫机制研究

报道应用自体ＬＡＫ细胞回输治疗１１０例慢性乙型肝炎（乙肝）和２０例慢性丙型肝炎（丙肝）的结果。疗程结束时慢性乙肝治疗组ＨＢｅＡｇ阴转率、抗－ＨＢｅ阳转率和ＨＢｖＤＮＡ阴转率分别为４６，４％、３５．５％和４８．２％，与对照组相比明显提高（Ｐ均〈０．００５）；２ｏ例慢性丙肝经治疗后抗－ＨＣＶ阴转２例（１０％），ＨＣＶＲＮＡ阴转４例（２０％），而对照组维持不变。进而对ＬＡＫ治疗的免疫机制进行探讨，结果发现ＬＡＫ治疗后ＣＡＨ患者ＣＤ＋４阳性率、ＣＤ＋４／ｃＤ＋８比值均增高（Ｐ＜０．０５），外周血单个核细胞膜白细胞介素－２受体（ｍＩＬ－２Ｒ）和血清中可溶性白细胞介素－２受体（ｓＩＬ－２Ｒ）的水平也明显升高（Ｐ＜０．０１）。     

乙型肝炎病毒变异对其特异性CTL反应的影响

特异性细胞毒Ｔ淋巴细胞（ＣＴＬ）反应是人体清除ＨＢＶ的主要机制，与临床结局密切相关，了解病毒变异对ＣＴＬ反应的影响尤为重要。 １．ＣＴＬ表位区内的变异：ＣＴＬ通过识别ＨＢＶ抗原特异性表位而清除病毒，ＨＢＶ编码的蛋白产物上都有这种表位。表位区内的变异可能引起（１）与ＨＬＡ分子结合的病毒抗原肽“错位变异”，抗原提呈失败；（２）ＣＴＬ不能识别变异的表位；（３）变异性肽配体与ＣＴＬ受体结合，使ＣＴＬ分化信号发生改变而失去对靶抗原的杀伤作用。但ＨＢＶ可表达多种抗原性、且变异绝大多数不在表位区内，个别ＣＴＬ…