人类肥胖相关新基因LYRM1多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备兔抗人LYRM1蛋白的多克隆抗体并对其进行初步鉴定。方法:预测LYRM1蛋白的抗原表位,设计并合成出一段由17个氨基酸组成的多肽,将合成肽与载体蛋白钥孔戚血蓝素(KLH)偶联作为抗原,免疫新西兰大白兔,制备抗LYRM1蛋白的多克隆抗体,利用ELISA、Westernblot鉴定其效价及特异性,并将该抗体用于人脂肪组织LYRM1的表达检测。结果:制备了兔抗人LYRM1蛋白的多克隆抗体并证实此抗体效价较高、特异性较强。结论:采用人工合成多肽作为半抗原成功制备了人类肥胖相关新基因LYRM1的多克隆抗体。     

β-Netrin抗原表位的分析及其抗体的制备与鉴定

目的:制备抗神经细胞突起生长诱向因子(β-Netrin)的多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:应用GoldKey软件分析人βNetrinC末端结构域氨基酸的序列(共114个氨基酸),确定抗原表位并人工合成多肽。然后采用碳化二亚胺法,将合成肽与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶联作为抗原,免疫BALB/c小鼠。取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞常规融合,依次进行HAT选择培养,间接ELISA法筛选阳性的杂交瘤细胞并克隆化。对分泌的mAb的效价、Ig亚类(型)及特异性,分别用间接ELISA和Westernblot进行鉴定。同时,通过免疫细胞化学染色鉴定抗体的特异性。另外,以偶联的分子免疫新西兰白兔,制备抗β-Netrin的pAb,用Westernblot鉴定其特异性。结果:以确定的此16个氨基酸的序列NH2-FRGKRT-LYPESWTDRG-COOH作为抗原表位,以人工合成多肽与BSA偶联作为免疫原,获得3株可稳定分泌特异性抗β-Netrin mAb的杂交瘤细胞。免疫细胞化学染色结果表明,这3株抗体均能特异性地识别细胞中的抗原。另外,制备了高效价的抗β-Netrin的pAb,并能特异性地识别原核表达的β-Netrin蛋白。结论:采用人工合成多肽作为半抗原成功地制备出抗β-Netrin的pAb和mAb。     

构建兔抗人凝血因子XIII A亚单位多克隆抗体及特异性鉴定

背景：关于凝血因子XIII(FXIII)抑制物作用于FXIII的具体结合表位,目前尚无报道。 目的：用免疫动物方法制备针对FXIII A亚单位多克隆抗体,并对其特异性和活性进行鉴定。 方法：用人工合成的FXIII A亚单位多肽免疫新西兰兔,制备多克隆抗体;应用Dot blot鉴定抗体特异性,并用抗体中和/尿素溶解实验检测多克隆抗体活性;Western blot方法检测2例获得性FXIII缺乏症患者的血浆FXIII水平,再应用Dot blot分析这2例患者血浆FXIII抑制物作用的抗原表位。 结果与结论：Dot blot证实兔血清中已产生抗FXIII抗体,此抗体不仅可特异性与人FXIII及转氨酶活性位点多肽结合,且在体外可抑制人FXIII的活性;用此抗体可检测出获得性FXIII缺乏症患者的血浆FXIII缺乏,分析出转氨酶活性位点是病例2血浆FXIII抑制物的作用位点。证实动物免疫法可成功制备兔抗人FXIII A亚单位转氨酶活性位点的多克隆抗体,此抗体可用于人FXIII的检测和抗原表位分析。     

人肌纤生成调节因子-1抗体的制备、鉴定及其在乳鼠心肌细胞中的应用

目的:制备抗人肌纤生成调节因子-1(hMR-1)的多肽抗体,并对其纯度、特异性、效价及适用性进行检测和鉴定。方法:TMHMM、DNAstar等软件分析hMR-1蛋白序列,选取2段优势抗原序列合成多肽并与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联,混合后免疫家兔。抗血清经过免疫亲和层析法纯化得到多克隆抗体。用ELISA法检测效价,Western blotting和细胞免疫荧光(immunocytofluorescent,ICF)法鉴定其特异性和适用范围,并观察其在乳鼠心肌细胞中的应用情况。结果:(1)抗体效价达1∶105,Western blotting检测到与预测分子量17kD相符的条带,ICF图像背景低,阳性结构清晰。(2)乳大鼠心肌细胞实验发现荧光信号浓集于核周,过表达hMR-1后荧光强度明显高于空载对照和正常对照。结论:制备的抗hMR-1多肽抗体效价及特异性可用于Western blotting及ICF实验,可识别人源性和大鼠源性抗原表位,该工作将为进一步深入研究新基因hMR-1的功能奠定基础。     

鸡源性高迁移率族蛋白B1多克隆抗体的制备及应用

目的制备针对鸡的高迁移率族蛋白B1(chHMGB1)特异性抗原亲和层析多克隆抗体,并进行初步应用。方法反转录PCR扩增chHMGB1的全长编码基因,通过序列比对分析筛选一段特异性的多肽序列,偶联载体后作为抗原免疫新西兰兔,采集血清,通过蛋白A柱及多肽偶联的Seprose4B柱得到亲和层析纯化的多克隆抗体;并利用Western blot法、间接免疫荧光染色、免疫组化方法进行鉴定。结果成功制备了抗chHMGB1特异性的多克隆抗体。各项实验结果表明该抗体能特异性的识别重组蛋白以及天然的chHMGB1蛋白。结论成功制备了鸡源性高迁移率族蛋白B1亲和层析多克隆抗体。     

人甲状旁腺激素N端肽中一个含有B细胞新表位的hPTH13-27片段的研究

目的研究并证明人甲状旁腺激素（hPTH）N端肽内的hPTH^13-27片段是一个新的B细胞抗原表位。方法计算机辅助分析预测hPTH^1-37和hPTH^1-84多肽片段内hPTH^13-27抗原表位的特征;制备大鼠抗hPTH^13-27-KLH多克隆抗体;酶联免疫测定（ELISA）研究hPTH^13-27抗原表位和抗体的免疫特征。结果蛋白质结构分析预测在hPTH^13-27区域含有B细胞抗原表位。hPTH^13-27单表位多克隆抗体制备成功。ELISA分析证明hPTH^13-27片段含有B细胞抗原表位,与抗体的结合效果依次为：抗hPTH^13-27抗体〉抗hPTH^1-84抗体〉抗hPTH^1-37抗体。hPTH^13-27片段与固相板结合对免疫原性影响不大。抗hPTH^13-27抗体与含hPTH^13-27片段的多肽结合良好;与不含hPTH^13-27片段的多肽无交叉反应。结论hPTH^13-27可能是制备hPTH N端肽抗体的核心表位片段。     

β_2糖蛋白1多肽抗体的制备与应用

目的利用人工合成β2糖蛋白1(β2GP1)多肽制备针对人源、鼠源β2GP1的多克隆抗体,并鉴定抗体的特异性及致病性。方法应用Fmoc法化学合成β2GP1 N端第35~51位氨基酸的多肽,将合成后的多肽与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫新西兰大白兔制备抗血清,蛋白G纯化得到抗β2GP1多肽抗体,利用ELISA和Western blot法鉴定其效价和特异性。体外实验使用抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物刺激C3H/He N小鼠腹腔巨噬细胞一定时间,收集细胞总RNA和总蛋白,实时定量PCR、Western blot法分别检测细胞组织因子(TF)mRNA和蛋白表达;Western blot法检测细胞p38、磷酸化p38、核因子κB p65(NF-κB p65)及磷酸化NF-κB p65表达情况;体内实验采用C3H/He N小鼠腹腔注射抗β2GP1多肽抗体建立实验性抗磷脂综合征(EAPS)模型,检测小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度及部分凝血活酶时间(APTT)。结果化学合成β2GP1多肽的纯度为94%,达到免疫用抗原标准。偶联KLH后免疫新西兰大白兔,其抗血清效价大于1∶32 000。Western blot结果显示抗β2GP1多肽抗体可特异性识别人源和鼠源β2GP1条带,双抗夹心ELISA检测表明该多肽抗体可与β2GP1隐蔽表位特异性结合。体外实验显示抗β2GP1多肽抗体/β2GP1复合物能够增强小鼠腹腔巨噬细胞p38、NF-κB p65磷酸化,诱导细胞TF mRNA及蛋白表达。体内实验成功建立EAPS小鼠模型,小鼠外周血抗β2GP1抗体滴度大于1∶3200,APTT明显缩短。结论所制备的抗β2GP1多肽抗体可识别人源和鼠源β2GP1分子,能与β2GP1隐蔽抗原特异性结合且具有致病效应。     

抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b多克隆抗体的制备和鉴定

目的:制备小鼠抗人ASGPR大亚基异构体蛋白H1b的多克隆抗体,并鉴定其特异性.方法:合成H1b特异性多肽,以匙孔血蓝蛋白(KLH)作为载体构建多肽免疫原,通过致敏小鼠,制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体;ELISA法检测抗体效价,通过Western blot和免疫组织化学检测,鉴定抗体的特异性与适用范围.结果:得到小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,效价达1:105.纯化后的抗体用于Western blot可高特异性识别真核表达的H1b蛋白,并可用于免疫组织化学实验.结论:成功制备小鼠抗人H1b蛋白的多克隆抗体,该抗体具有较高的效价以及特异性,能区分ASG-PR大亚基的两种剪接异构体,从而为进一步研究H1b蛋白的生理功能及其在人类疾病中的意义提供了有利工具.     

抗人转录因子DP3和TFDP1多肽抗体的制备

目的: 制备兔抗人转录因子TFDP3、 TFDP1的多克隆抗体, 并鉴定其反应性及特异性.方法: 选择TFDP3和TFDP1差异较大肽段, 利用人工合成多肽免疫家兔, 采用真核表达载体瞬时转染HEK293细胞表达TFDP3和TFDP1真核蛋白, 通过Western blot分析抗体的反应性和特异性.结果: 通过氨基酸序列比对选择TFDP3 17-26, TFDP1 17-32氨基酸残基合成多肽, 制备了兔抗人TFDP3、 TFDP1多肽抗体, Western blot检测显示, 抗TFDP3抗体可以特异性识别TFDP3, 而抗TFDP1抗体既可识别TFDP1又可与TFDP3结合.结论: 制备了兔抗人TFD31和TFDP1的多肽抗体, 且TFDP3抗体与TFDP1无交叉反应.     

兔抗人CXCR3-B分子N端多肽多克隆抗体的制备与初步应用

目的:获得兔抗人CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽的多克隆抗体,并对多克隆抗体进行初步鉴定和应用。方法:应用Fmoc法化学合成CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽,经C18的RP-HPLC纯化后,通过高碘酸钠法将纯化的CXCR3-B分子的多肽与KLH交联;皮下注射抗原免疫日本大耳白兔,加强免疫得到抗血清,应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、免疫印迹、免疫组化等初步鉴定和应用。结果:分别化学合成CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽,纯化后多肽纯度分别为98%、88.54%及80%,达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联,用于免疫动物。经纯化后的抗体效价分别为1∶32000(0.1mg/L),1∶4000(3mg/L)和1∶1000(10mg/L)。3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中相对分子质量(Mr)约为50的CXCR3-B分子,相应抗原定位于3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中的血管内皮细胞。结论:所制备的多克隆抗体可应用于ELISA、免疫印迹和免疫组化等实验,为确定CXCR3-B分子的组织及细胞分布和定位、寻找CXCR3-B相互作用的分子提供了有力的工具。目的:获得兔抗人CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽的多克隆抗体,并对多克隆抗体进行初步鉴定和应用。方法:应用Fmoc法化学合成CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽,经C18的RP-HPLC纯化后,通过高碘酸钠法将纯化的CXCR3-B分子的多肽与KLH交联;皮下注射抗原免疫日本大耳白兔,加强免疫得到抗血清,应用蛋白G纯化获得多克隆抗体。对纯化的抗体进行ELISA、免疫印迹、免疫组化等初步鉴定和应用。结果:分别化学合成CXCR3-B分子N端第1~19、第17~35及第33~51个氨基酸多肽,纯化后多肽纯度分别为98%、88.54%及80%,达到免疫用抗原标准。多肽与KLH交联,用于免疫动物。经纯化后的抗体效价分别为1∶32000(0.1mg/L),1∶4000(3mg/L)和1∶1000(10mg/L)。3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中相对分子质量(Mr)约为50的CXCR3-B分子,相应抗原定位于3种多肽的抗体可特异识别胎心组织中的血管内皮细胞。结论:所制备的多克隆抗体可应用于ELISA、免疫印迹和免疫组化等实验,为确定CXCR3-B分子的组织及细胞分布和定位、寻找CXCR3-B相互作用的分子提供了有力的工具。     

BPI N端优势抗原表位的模拟合成及其抗血清的制备

目的通过生物信息学模拟合成杀菌/渗透增强蛋白氨基端(BPIN端)优势抗原表位肽,免疫动物获得相应抗血清。方法利用生物信息学分析BPIN端(1-199)氨基酸序列的抗原性、亲水性、可塑性、表面可及性和二级结构等理化特性,据此设计合成TA/IK两条多肽,将其与钥孔戚血蓝素(KLH)偶联后,免疫家兔获得相应抗血清;采用间接ELISA法鉴定多肽的抗原性、测定血清抗体效价,Westernblot鉴定抗血清特异性。结果人工合成BPIN端TA/IK两个B细胞表位肽;ELISA检测证实TA/IK抗原肽能与商品化兔抗人BPI55多克隆抗体结合;所获TA/IK抗血清效价分别为1∶51200和1∶25600;Westernblot证实TA/IK抗血清能与BPI55标准品特异性结合。结论模拟合成的TA/IK抗原肽确为BPIN端优势抗原表位,相应抗血清可用于BPIN端功能性片段的检测鉴定。     

人TLR4的B细胞优势表位设计、合成及其免疫原性检测

目的　鉴定TLR4的优势抗原表位 ,为抗人TLR4单克隆抗体制备奠定基础。方法　分别应用Hoop&Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数和抗原表位的软件分析对TLR4B细胞表位进行预测 ,最后用抗原性指数的方法进行综合评述。合成针对该表位的多肽 ,以此多肽为免疫原免疫小鼠 ,对其免疫原性进行检测。结果　预测TLR4的B细胞优势表位为 189～ 2 0 2氨基酸序列 :NH2 HKLTLRNNFDSLNV COOH ,此多肽能诱导机体产生较高的抗体滴度 ,多抗具有较高的特异性。结论　预测的TLR4短肽是B细胞的优势表位 ,以此制作抗人TLR4单克隆抗体是可行的。     

小鼠Trim30α人同源基因的生物信息学筛选及初步鉴定

目的 通过生物信息学方法寻找Trim30α的人同源基因,观察候选Trim蛋白对TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活性的影响.方法 经MEGA4软件对具有RBCC和SPRY结构域的Trim分子行进化树分析,用DNAMAN 6.0软件对候选Trim与Trim30α进行氨基酸序列比对,比较Trim30α相毗邻基因在小鼠和人染色体上的排列分布规律.构建Trim22的真核表达载体,用双萤光素酶报告基因系统检测Trim22对TAB2诱导的NF- κB报告基因活化的影响.结果 Trim30α与人Trim5α.、Trim6、Trim22、Trim34α来自进化树的同一分支节点;Trim22、Trim5α与Trim30α的氨基酸序列同源性分别为42.51％、45.47％;Trim22可以抑制TAB2诱导的NF-κB报告基因的活化,而Trim5α无显著抑制作用.结论 Trim22对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化有负向调节作用,可能与Trim30α具有相类似的生物学功能.     

Diagnostic usefulness of aberrant CD22 expression in differentiating neoplastic cells of B-Cell chronic lymphoproliferative disorders from admixed benign B cells in four-color multiparameter flow cytometry

The diagnosis of B-cell chronic lymphoproliferative disorders is a great challenge when made in a background of polyclonal B cells. We studied the diagnostic usefulness of aberrant CD22 expression for differentiating neoplastic from benign B cells by 4-color flow cytometry. Of 56 cases of B-cell chronic lymphoproliferative disorders, we found that neoplastic cells showed aberrant CD22 expression in 39 (70%) of 56 cases, including chronic lymphocytic leukemia, mantle cell lymphoma, marginal zone lymphoma, hairy cell leukemia, and follicular lymphoma. In 4 cases, monoclonality was detected definitively only by evaluating the immunoglobulin light chain restriction in B cells with aberrant CD22 expression because numerous polyclonal B cells were present. Aberrant CD22 expression is a useful marker for detection of monoclonal B cells admixed with numerous benign polyclonal B cells.     

Peptide length-dependent TCR antagonism on class II HLA-restricted responses of peripheral blood mononuclear cells and T cell clones

T cell clonal recognition of peptide ligands is highly diverse. To investigate how peptide mixtures with diverse sequences affect polyclonal responses of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), we synthesized Xn (n = 9-19) peptides that consist of 9 to 19 residues with random sequences. We found that: (1) in antagonism assays, Xn peptides inhibit polyclonal responses of PBMC induced by purified protein derivative (PPD) and crude mite extracts as well as mixed lymphocyte reaction (MLR), in which intermediate-length peptides (n = 13 or 15) show the largest inhibitory effects; and (2) a high-affinity HLA-DR4-binding peptide is devoid of inhibitory activity against MLR to DR4, indicating that these effects are not caused by inhibition of peptide binding to HLA. Furthermore, X15 did not abrogate PBMC proliferation induced by phorbol 12-myristate 13-acetate + ionomycin, or anergize PBMC by preculture. All these observations indicate that TCR antagonism does exist at peripheral T cell levels in humans, and that Xn peptides, depending on peptide length, are capable of antagonizing T cell polyclonal responses. Indeed, even with cloned T cells, certain non-agonistic peptides shorter (but not too short) than the wild type in their C termini, function as TCR antagonists, findings which corroborate the observation that X13-15 antagonizes T cell responses more efficiently than does X17-19 or X9-11.     

鼠TRAM蛋白B细胞表位预测及其免疫原性检测

目的 预测TRAM蛋白的二级结构和B细胞表位,为抗鼠TRAM单克隆抗体制备奠定基础。方法以TRAM蛋白的氨基酸序列为基础,采用Goldkeu计算机分析软件以及网络nnpredict二级结构分析软件对TRAM蛋白二级结构及B细胞表位预测。合成针对该表位的多肽,以此多肽为免疫原免疫兔,对其免疫原性进行检测。结果用多参数预测TRAM蛋白的二级结构和B细胞表位,综合评判表明：TRAM分子的第216～229位氨基酸满足亲水性、可及性和可塑性,在二级结构上位于蛋白伸展结构或无规则卷曲结构内,最可能为其优势B细胞表位。此多肽能诱导机体产生较高的抗体滴度,多克隆抗体具有高的特异性。结论TRAM分子的第216～229位氨基酸为其优势B细胞表位,这为制作B细胞优势短肽单克隆抗体提供了理论依据。     

寡聚蛋白Trim34α对NF-κB报告基因的负向调节作用

目的 测Trim34α对TAB2诱导的NF-κB报告基因活化的影响.结果 经鉴定成功构建Trim34α真核表达载体,该载体表达的Trim34α蛋白能相互聚集形成寡聚体(Trim小体);Trim34α可显著抑制TAB2诱导的NF-κB荧光素酶报告基因活化.结论 Trim34α可以在胞内形成寡聚体,Trim34α能显著抑制TAB2诱导的NF-κB报告基因活化.

Abstract：

Objective To investigate the effects of Trim34α on the activation of luciferase reporter gene containing NF-κB promoter induced by adaptor proteins TAB2. Methods The total RNA was isolated from HeLa cells. After amplification with RT-PCR, the target sequences were cloned into 5'-Flag-pcDNA3.1 (+) vector. The recombinant vector was confirmed by restriction enzyme digestion, colony PCR and sequencing. It was transfected into HEK293T cells to detected Trim34α expression by Western blot. Simultaneously, the effects of Trim34α on the NF-κB activation induced by TAB2 were determined by dual-luciferase reporter assay. Results Restriction enzyme digestion, colony PCR and sequencing confirmed the vector was constructed successfully, furthermore it expressed Trim34α protein in HEK293T cells. Moreover, trim34α could form high-molecular-weight oligomeric protein, and here we called it trimsome. Interestingly, dual-luciferase assay showed that Trim34α could effectively block TAB2-induced NF-κB activation. Conclusion Trim34α was involved in negative regulation of TAB2-induced NF-κB activation and could form high-molecular-weight oligomer.