丝裂原激活蛋白激酶信号转导系统对维甲酸诱导NB4细胞分化的影响

本研究观察丝裂原活化蛋白激酶对全反式维甲酸（ATRA）诱导NB4细胞分化的影响并探讨其机制。采用MTT法测定细胞增殖活性，用流式细胞术分析细胞周期，NBT还原实验检测粒系分化，底物磷酸化法测定细胞外调节激酶（ERK）活性。结果显示：0．01—0．1μmol／L的ATRA呈时间和剂量依赖方式抑制NB4细胞增殖，并诱导NB4细胞向粒系分化；在这过程中ATRA激活ERK活性，ERK抑制剂PD98059能部分阻断ATRA的作用。p38MAPK的特异抑制剂SB203580与ATRA联合应用部分阻断了ATRA对细胞的生长抑制和诱导分化作用。结论：ATRA在诱导NB4细胞分化过程中激活ERK和P38MAPK途径，并且对该途径有依赖作用。     

全反式维甲酸诱导白血病细胞分化对brd7基因表达的影响

为了探讨brd7基因与白血病细胞分化的关系及其在白血病细胞分化中的作用,本研究采用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60和K562细胞系分化,通过Wright-Giema染色在显微镜下观察细胞形态学变化,应用流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b的表达,以鉴定细胞分化程度,并在此基础上通过Western blot检测brd7基因在诱导分化前和细胞分化过程中蛋白表达水平的变化。结果发现,ATRA具有抑制HL-60细胞生长的作用,并可诱导HL-60细胞向粒系分化,在ATRA诱导细胞分化过程中HL-60细胞表面CD11b的表达水平逐渐上调,BRD7蛋白表达随着HL-60细胞的分化而增加;ATRA对K562细胞无诱导分化作用,brd7的表达也无明显变化。结论:随着HL-60细胞的分化,brd7基因表达上调,其机制有待进一步阐明。     

人脐带间充质干细胞增强全反式维甲酸对HL-60细胞的诱导分化作用

本研究探讨人脐带间充质干细胞(hucMSC)对全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60细胞分化以及对HL-60增殖的影响。HL-60细胞分为4组:未经ATRA处理的对照组、与hucMSC细胞共培养的hucMSC组,经ATRA处理的ATRA组以及经ATRA处理并与hucMSC细胞共培养的ATRA+hucMSC组。在规定时间采用Cell Counting Kit-8(CCK8)检测对照组和hucMSC组HL-60细胞增殖情况;在光学显微镜下观察各组细胞形态、NBT阳性细胞;应用real-timePCR方法检测c-myc基因表达水平以及流式细胞术检测CD11b表面标志以比较各组中HL-60细胞的分化情况。结果表明:共培养体系中hucMSC细胞能抑制HL-60的增殖,hucMSC∶HL-60为1∶1时,48小时时p0.05,72小时时p0.01;hucMSC∶HL-60为1∶5时,72小时时p0.05。在2μmol/LATRA的刺激下,ATRA+huc-MSC组与ATRA组相比,出现更多具有中性粒细胞形态的HL-60细胞和更高的NBT阳性率(p0.05);ATRA+hucMSC组中HL-60细胞c-myc基因表达更低(p0.05);ATRA+hucMSC组中HL-60细胞CD11b的表达更高(48小时p0.05,72小时p0.01)。结论:脐带间充质干细胞能抑制HL-60增殖并且增强ATRA对HL-60细胞的诱导分化作用。     

槲皮素对白血病细胞中PML基因及蛋白表达的影响和定位的研究

目的 探讨PML基因及蛋白在白血病细胞中的表达和细胞内分布定位。方法 经全反式维甲酸（ATRA）、槲皮素处理后的NB4、HL-60、K562细胞为研究对象，细胞形态学观察采用Wright染色法及荧光染色法；PML蛋白细胞分内分布定位采用免疫荧光技术；PML mRNA表达的检测采用RT-PCR法。结果 （1）ATRA处理后，NB4和HL-60细胞形态学上出现分化表现，K562细胞无变化；经槲皮素处理后，各组细胞形态学上均出现凋亡特征性改变。（2）ATRA处理后，NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白恢复定位，HL-60、K562细胞内PML蛋白定位分布无变化；槲皮素处理后NB4细胞内融合蛋白降解，PML蛋白聚积于POD结构，随后降解，在HL-60及K562细胞，PML蛋白发生相似改变。（3）ATRA、槲皮素对各组细胞PMLmRNA表达均无显著影响。结论 在不同诱导剂刺激下，PML在蛋白水平参与细胞终末分化及诱导白血病细胞凋亡机制；PML蛋白在POD中发挥诱导凋亡、控制细胞生长的作用。     

丝裂原激活蛋白激酶信号转导系统对维甲酸诱导NIM细胞分化的影响

本研究观察丝裂原活化蛋白激酶对全反式维甲酸(ATRA)诱导NB4细胞分化的影响并探讨其机制。采用MTT法测定细胞增殖活性,用流式细胞术分析细胞周期,NBT还原实验检测粒系分化,底物磷酸化法测定细胞外调节激酶(ERK)活性。结果显示:0.01-0.1μmol/L的ATRA呈时间和剂量依赖方式抑制NB4细胞增殖,并诱导NB4细胞向粒系分化;在这过程中ATRA激活ERK活性,ERK抑制剂PD98059能部分阻断ATRA的作用。p38MAPK的特异抑制剂SB203580与ATRA联合应用部分阻断了ATRA对细胞的生长抑制和诱导分化作用。结论:ATRA在诱导NB4细胞分化过程中激活ERK和P38MAPK途径,并且对该途径有依赖作用。     

人可溶性血管内皮生长因子受体1抑制白血病细胞增殖的研究

本研究通过体外实验探讨人可溶性血管内皮生长因子受体1（sFLT-1）对白血病细胞增殖的抑制作用。用RT—PCR检测白血病细胞株K562、HL-60、U937和骨髓LTC—IC VEGF mRNA、VEGF—R1（FLT-1）mRNA的表达，用流式细胞术检测上述细胞VEGF和VEGF—R1（FLT-1）的表达，ELISA法检测细胞培养上清中VEGF的含量，将sFLT-1加入K562、HL-60白血病细胞株和骨髓LTC—IC培养体系中，应用MTT法计算细胞生长的抑制率。结果显示：白血病细胞株K562、HL-60、U937和骨髓LTC—IC均表达VEGF，以K562表达VEGF量最高。K562和HL-60细胞株还表达FLT-1，U937细胞和骨髓LTC—IC表达的FLT-1表达量很低。sFLT-1明显抑制白血病细胞株K562及HL-60的生长，并且随着sFLT-1浓度的增加，其抑制率增加，以用药后48小时抑制作用最明显。结论：sFLT-1能够抑制某些白血病细胞株的生长，其抑制效应随用药浓度的增加而增加，而sFLT-1对正常骨髓细胞增殖无影响。     

丙戊酸钠抑制HL-60细胞增殖并诱导其凋亡与分化

为进一步研究丙戊酸钠(sodium valproate;VPA)对白血病细胞HL-60的增殖、凋亡和分化的影响,采用MTT法检测不同浓度的VPA对HL-60细胞增殖的作用;细胞化学染色法观察药物作用后细胞形态的变化;NBT还原实验结合形态学作为观测细胞分化指标;应用流式细胞术检测不同浓度药物作用后细胞周期的变化及凋亡细胞的比例。结果显示:VPA能明显抑制HL-60的增殖;经2mmol/L VPA处理24-48小时后,HL-60出现胞浆空泡、核固缩、核碎裂及凋亡小体;Annexin V阳性的早期凋亡细胞比例由2.9%升高到17.1%;流式细胞术检测出明显的亚二倍体峰;G1期细胞由51.1%增加至84.6%,S期细胞由37.9%减低至14.4%。0.25mmol/L VPA作用1周后,促进HL-60细胞向中幼粒、晚幼粒阶段分化,NBT阳性细胞百分率为(47±2)%。结论:VPA能明显抑制白血病细胞HL-60的增殖,并诱导其分化及凋亡。     

bcl-2基因反义寡核苷酸的设计与白血病细胞对Ara-C敏感性研究

寻找在bcl-2mRNA上除了起始区以外的反义寡核苷酸作用的敏感位点和观察这些核苷酸对白血病细胞的阿糖胞苷敏感性的影响。用RNAstructure软件模拟bcl-2mRNA的二级结构设计合成两端硫代修饰反义寡核苷酸，用MTT法测定抑制HL-60和K562细胞的阿糖胞苷半数抑制浓度（IC50）值；用流式细胞术检测HL-60和K562细胞凋亡率和bcl-2蛋白表达水平。结果发现，10μmol/Lbcl-2基因的反义寡核苷酸同Ara-C结合使用，能明显地抑制HL-60和K562细胞bcl-2基因蛋白的表达，促进细胞凋亡，减低Ara-C的IC50值；同时发现针对蛋白编码区的反义寡核苷酸有更强的作用。结论：除了bcl-2mRNA的起始区外，在bcl-2mRNA的其他部位存在有设计反义寡核苷酸更有效的位点，该项研究将为反义药物的设计提供新的有用途径。     

右旋柠烯对HL-60、K562白血病细胞体外作用的研究

本研究观察右旋柠烯（d-limonene，D-L）对HL-60和K562白血病细胞增殖凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。首先采用碘化丙锭染色法观察右旋柠烯对HL-60、K562细胞增殖的影响，再通过细胞形态学观察、流式细胞术分析、免疫细胞化学半定量测定突变型p53、bcl-2、bax基因的表达水平，系统观察D-L对HL-60、K562细胞体外诱导凋亡的情况。结果表明：D-L抑制HL-60和K562细胞的增殖，IC50均为0．75mmol／L，呈剂量时间依赖关系；D-L诱导HL-60、K562细胞凋亡；D-L在诱导HL-60细胞凋亡过程中随作用浓度增加，bcl-2的表达下降；D-L在诱导K562细胞凋亡过程中随作用浓度增加，突变型p53及bcl-2的表达下调，而bax的表达上调。结论：D-L抑制HL-60和K562细胞增值并诱导其凋亡；突变型p53，bcl-2，bax参与了D-L诱导凋亡的基因调控，     

丙戊酸诱导白血病HL-60细胞凋亡及其对h-tert基因表达的影响

为了探讨丙戊酸（valproic acid,VPA）对白血病HL-60细胞诱导凋亡的作用及其可能的机制,采用细胞毒性试验（CCK-8法）观察不同浓度VPA在不同作用时间对HL-60细胞增殖的影响,采用荧光显微镜检及流式细胞术检测细胞凋亡,并观察VPA作用后HL-60细胞端粒酶亚单位h-tert基因、凋亡相关蛋白表达和caspase-3活性的变化。结果表明：VPA呈剂量依赖性抑制HL-60细胞增殖（r=-0.87）.,诱导细胞凋亡;同时,抗凋亡蛋白BCL-2表达明显下降,促凋亡蛋白BAX表达上调,caspase-3活性增强,h-tert mRNA表达逐渐下降,HL-60细胞的凋亡率与h-tert mRNA表达呈负相关。结论：VPA可抑制白血病HL-60细胞增殖,诱导细胞凋亡;VPA可能通过下调h-tert mRNA、BCL-2蛋白表达,上调BAX表达及增强caspase-3活性而发挥抗白血病作用。     

汉防己甲素诱导HL-60细胞分化

目的:探讨汉防己甲素(Tetrandrine)靶向黏蛋白1(MUC1)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化。方法:以HL-60细胞株作为研究对象,选取对数生长期细胞,分为空白对照、ATRA、汉防己甲素和ATRA+汉防己甲素,共4组。显微镜下观察各组细胞形态的变化;用NBT还原实验分析细胞分化能力的变化;采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b表达的变化;采用Western blot检测MUC1表达的变化。结果:汉防己甲素可以诱导HL-60细胞分化;ATRA+汉防己甲素组NBT还原阳性率明显高于ATRA和汉防己甲素组(P<0.05);ATRA+汉防己甲素组CD11b+细胞百分率(43.62%±1.38%)明显高于汉防己甲素(15.25%±2.11%)、ATRA(21.84%±7.53%)和空白对照组(8.16%±1.01%)(P<0.05);汉防己甲素组MUC1蛋白量明显低于空白对照组和ATRA组(P<0.05)。结论:汉防己甲素体外能协同ATRA使HL-60细胞分化成熟,其作用机制可能与调控MUC1的表达有关。     

维甲酸诱导HL-60细胞分化中对细胞周期素依赖性激酶活性的影响

目的探讨维甲酸（ＲＡ）对ＨＬ６０细胞的增殖抑制和诱导分化作用与细胞周期素依赖性激酶（ＣＤＫ）活性变化的相关性。方法用５×１０－６ｍｏｌ／Ｌ全反式维甲酸（ＡＴＲＡ）或芳维甲（ＡＥ）处理ＨＬ６０细胞１～４天,在观察细胞生长、四氮唑蓝（ＮＢＴ）还原实验以及细胞周期分析的基础上,用组蛋白Ｈ１激酶活性分析技术检测ＣＤＫ２的活性,免疫沉淀法分析结合于ＣＤＫ２和ＣＤＫ４上的相应的细胞周期素（ｃｙｃｌｉｎ）Ｅ和Ｄ的量。结果ＨＬ６０细胞在ＡＴＲＡ或ＡＥ作用下,细胞增殖减慢,对ＮＢＴ的还原能力明显增强,９０％左右的细胞被阻滞在Ｇ１／Ｇ０期;在Ｇ１到Ｓ期转换过程中起关键作用的ｃｙｃｌｉｎＥ／ＣＤＫ２的活性显著下降,结合于ＣＤＫ４上的ｃｙｃｌｉｎＤ１的量减少。结论ＲＡ抑制ＨＬ６０细胞增殖并诱导其分化可能与ＣＤＫ２和ＣＤＫ４的活性下降有密切关系     

曲古菌素A对HL-60细胞组蛋白乙酰化水平和凋亡的作用

本研究旨在探讨曲古菌素A(trichostatinA ,TSA)高效低毒的抗癌机理。应用细胞培养、MTT法 ,免疫细胞化学技术和Annexin V FITC PI双标流式细胞术观察TSA对HL 6 0细胞和正常人外周血单个核细胞 (normalhumanperipheralbloodmononuclearcell,NPBMNC)的生长抑制 ,组蛋白乙酰化水平以及诱导凋亡的影响。结果表明 :TSA能够以时间、剂量依赖性方式抑制HL 6 0细胞增殖 ,36小时IC50 为 10 0ng ml。TSA能够诱导HL 6 0细胞凋亡 ,其作用也呈时间、剂量依赖性。TSA在显著诱导HL 6 0细胞凋亡的浓度和时间范围内对NPBMNC无明显的诱导凋亡作用。TSA处理 4小时后 ,HL 6 0细胞和NPBMNC组蛋白乙酰化水平上调显著高于未用TSA各组 (P<0 .0 5 ) ,但两者之间无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论 :TSA对HL 6 0细胞有明确的抑制增殖能力 ;TSA有明确的诱导HL 6 0细胞凋亡的能力 ,这可能是TSA体外抑制白血病细胞系HL 6 0生长和发挥抗白血病作用的主要机理之一 ;与NPBMNC相比较 ,TSA能够选择性诱导HL 6 0细胞凋亡 ;TSA选择性抑制HL 6 0细胞的机理与TSA调控HL 6 0细胞和NPBMNC组蛋白乙酰化水平的差异无关。     

SCL基因反义寡核苷酸对K562和CEM细胞系的作用

干细胞白血病(SCL)基因是新发现的与白血病发生有关的癌基因。为进一步探讨SCL反义寡核苷酸对白血病细胞的作用，本研究应用SCL基因的反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸(AS—PS—ODN)分别与K562和CEM白血病细胞系作用，观察细胞生长、分化、凋亡和SCL　mRNA变化。结果显示：(1)AS—PS—ODN对K562和CEM细胞的生长有不同程度的抑制作用，并呈量效和时效关系；(2)AS—PS—ODN作用后K562细胞联苯胺染色阳性率明显增加；(3)AS—PS—ODN作用后K562细胞发生凋亡现象，但未观察到CEM细胞凋亡；(4)AS—PS—ODN作用后K562细胞和CEM细胞SCL　mRNA表达水平减低，同时CEM细胞SIL－SCL　mRNA表达水平也减低。结论：AS—PS—ODN能特异性抑制K562和CEM细胞的增殖，减低SCL　mRNA和SIL—SCL　mRNA表达水平，同时促进红系分化，诱导K562细胞过早凋亡。     

Mcl-1基因在HL-60细胞对全反式维甲酸耐药机制中的作用

目的探讨髓系白血病-1(Mcl-1)基因在HL60细胞对全反式维甲酸(ATRA)耐药中的作用。方法采用少量、递增、反复ATRA诱导HL-60细胞,建立ATRA耐药细胞系HL60/ATRA;利用鸡尾酒法制备Mcl-1基因的小片段干扰RNA(SmallinterferenceRNA,siRNA),并通过脂质体介导将其导入HL60/ATRA细胞;Westernblot检测Mcl-1蛋白在细胞中的表达;MTT实验、NBT还原反应实验、TUNEL免疫组化染色法分别检测细胞的增殖、分化和凋亡情况。结果HL60/ATRA细胞Mcl1蛋白相对灰度值为0.624±0.127,较野生型HL60细胞(相对灰度值为0.162±0.127)明显高表达,并可耐受100nmol/L的ATRA,而不发生分化、凋亡[凋亡率为(1.0±0.5)%];Mcl1siRNA导入HL60/ATRA细胞后,Mcl1蛋白表达下调(相对灰度值为0.267±0.086),恢复对ATRA的敏感性[凋亡率为(18.5±4.5)%]。结论Mcl1基因可能参与了HL60细胞ATRA耐药的形成;抑制Mcl-1基因可能成为一种新的逆转ATRA耐药的策略。