组织工程化子宫片层构建的实验研究

目的利用组织工程方法体外构建了与子宫壁内膜和肌层相近的子宫片层。方法将分离培养的兔子宫平滑肌细胞和基质细胞分别与液态Ⅰ型胶原支架材料混合,依次接种于自制静态力学拉伸模具中,再将上皮细胞接种在基质层上,形成组织工程化子宫组织。采用组织学和免疫组织化学方法观察所构建的组织工程化子宫的组织学特征,扫描电镜检测上皮细胞微结构。结果分离培养的兔子宫平滑肌细胞、基质细胞和内膜上皮细胞的纯度均达到95％以上。在静态力学拉伸下培养14天后,在胶原凝胶上生长的平滑肌细胞和基质细胞按拉伸方向有序排列,上皮细胞生长在最上层。激素处理后,扫描电镜观察显示上皮细胞表面有羽状突或纤毛,并且附有大量的微绒毛。结论由平滑肌细胞、基质细胞、上皮细胞和Ⅰ型液态胶原构建,并经静态力学拉伸构建的组织工程化子宫片层能较好地模拟自然子宫的形态结构和功能。     

心肌组织工程种子细胞的研究进展

目的 综述组织工程心肌种子细胞来源的研究现状与存在的问题,并展望其前景.方法 广泛查阅近十年来有关组织工程心肌种子细胞的文献,并进行综述.结果 心肌组织工程的替代治疗具有极其诱人的前景,但还处于起步阶段,仍然需要通过大量的实验找到最佳的细胞来源.结论 组织工程心肌有广阔潜在的临床应用前景,其细胞来源值得进一步研究.     

聚羟基丁酸酯与骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

取4周龄新西兰兔骨髓，分离骨髓基质细胞，体外培养，经诱导分化为成骨细胞，接种于聚羟基丁酸酯（PHB）泡沫材料中，并植入裸鼠背部皮下，对照组单纯植入PHB。植入4、8周后行X线摄片和组织学观察，观察新骨形成情况。结果显示，PHB与3同髓基成骨细胞植入裸鼠皮下4周后，愕部形成骨组织，可见大量成内细胞，某些部位可见红色的骨基质形成；8周形成大量新生骨级,可见要反层骨。对照 组未见骨形成。     

颌面部火器伤损伤组织几种主要细胞外基质变化的研究

探讨Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ,ＦＮ）等几种主要细胞外基质在颌面部火器伤损伤组织中的动态变化。方法 选取２４例杂种犬,采用７．６２ｍｍ制式枪弹,建立颌面部火器伤动物模型,应用免疫组化方法,对颌面部火器伤损伤组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和ＦＮ进行观察。结果 Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原,以及ＦＮ分布在炎性细胞和成纤维细胞中阳性率较高,尤以炎性细胞聚集区最为明显。Ⅲ型胶原主要在创伤早期     

组织工程化心肌构建研究中形态学检测体系的建立

目的：建立并完善再造工程化心肌组织研究中形态学检测项目平台。方法：取新生大鼠天然心肌组织固定,制作天然心肌石蜡组织切片;用胰酶消化法分离新生大鼠心肌细胞进行细胞爬片培养;以液态胶原为支架材料与来源于新生大鼠的心肌细胞在体外构建工程化心肌组织条带并进行力学拉伸刺激,进而对其进行固定处理,制作石蜡组织切片。之后将天然心肌组织、心肌细胞爬片和工程化心肌组织标本分别进行HE及心肌特异性标志肌钙蛋白T（cTnT）免疫组化染色,并对三者的形态学检测结果进行观察、分析。结果：天然心肌组织的HE及cTnT结果反映了三维立体正常心肌组织在体情况下组织结构、细胞形态、数量比例等组织形态学特点;心肌细胞爬片培养简便直观地反映了体外二维条件下的心肌细胞形态、数量及其比例的改变;工程化心肌组织检测则反映了三维立体再造心肌的组织结构、细胞形态、数量及比例改变。结论：设立天然心肌、心肌细胞爬片及工程化心肌组织三者的HE、cTnT免疫组化检测项目并对其结果进行对照分析,从二维与三维、在体与体外等方面,建立并完善了再造工程化心肌组织研究中形态学检测对照体系,提高了实验效率,节约了实验成本。     

采用温敏性壳聚糖水凝胶体外构建组织工程化软骨的实验研究

目的 验证自行制备的温敏性壳聚糖水凝胶作为软骨细胞支架材料构建组织工程化软骨的可行性.方法 以壳聚糖、β-甘油磷酸钠和羟乙基纤维素为原料,制备温敏性壳聚糖水凝胶,通过SD大鼠肌内注射植入,进行组织相容性检测.在此基础上,将其与软骨细胞复合构建组织工程化软骨,观察软骨细胞在壳聚糖水凝胶中的存活情况,并于体外培养3周后,作相关组织形态学检测.结果 制备的壳聚糖水凝胶具有温度敏感性,即室温时为液态,37℃时10～15min可发生交联反应成为固态凝胶.SD大鼠肌内注射不同时间点组织相容性检测表明,该材料具有良好的组织相容性,植入体内2、4周时有少量炎性细胞浸润,6周时材料降解明显,8周时已经基本降解.采用该材料构建的组织工程化软骨体外培养3周后取材,通过组织学检查,HE染色可观察到软骨陷窝样结构,甲苯胺蓝染色、番红O染色及免疫组化染色结果显示软骨细胞具有分泌细胞外基质的功能.结论 本研究自行制备的温敏性壳聚糖水凝胶材料具有良好的组织相容性,将其与软骨细胞复合后,可以在体外再造组织工程化软骨,是一种有广泛应用前景的软骨组织工程支架材料.     

应用不同种子细胞和种植方法构建组织工程心脏瓣膜的实验研究

目的：探讨不同种子细胞及种植方法对构建组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve，TEHV）的影响。方法：体外分离及培养犬主动脉瓣内皮细胞（Ec）、主动脉瓣间质细胞（ISC）、骨髓间充质干细胞（BMSC）。将上述3种细胞以单纯接种和分阶段联合接种的方法种植于生物可降鳃材料聚羟基丁酸／聚羟基戊酸共聚物（Poly—hydroxybutyrate／hydroxyvalerate，PHBV）上，对种植细胞应用免疫组化法检测Ⅷ因子、α-SMA的表达。放免法测定细胞培养液中PG12的含量，检测种植细胞的功能。结果：种子细胞体外培养生长良好，细胞种植于PHBV后EC组、ISC和EC分阶段联合种植组、BMSC组表面均可见细胞层形成，ISC和EC分阶段联合种植组表面见细胞呈复层生长，细胞开始向基质浸润。种子细胞BMSC组PG12值明显低于EC组及EC＋ISC组（P〈0．01），EC＋ISC组较EC组明显增高（P〈0．01）。结论：BMSC构建TEHV从形态及功能上与EC构律TEHV有一定差距．ISC及EC分阶段联合种植构建TEHV较单纯种植EC更具有可行性。     

筛选适宜于构建工程化肝组织的凝胶材料支架

目的使用不同可注射性凝胶支架体外进行新生大鼠肝细胞立体培养,为后期体内植入筛选相容性较好的支架材料。方法使用胰酶冷消化法分离新生大鼠肝细胞。将肝细胞分别与纤维蛋白胶、壳聚糖凝胶、鼠尾胶原、透明质酸钠支架材料复合,形成工程化肝组织凝胶,接种于培养板中,并通过定期光镜来观察大鼠肝细胞,四唑盐(MTT)比色法评价细胞活性。溴甲酚绿法测上清白蛋白含量,脲酶比色法测定上清尿素含量。结果四组均可形成三维生长的工程化类肝样组织。培养第4天,生物蛋白胶及壳聚糖组的培养上清液中尿素含量达到高峰,分别为培养第1天的1.31倍和1.28倍,随后含量缓慢下降。培养第7天,新生大鼠肝细胞在纤维蛋白凝胶及壳聚糖凝胶中密集生长,同时MTT显示细胞活性及白蛋白分泌达到高峰,OD值分别为培养初期的1.11倍和1.17倍,上清白蛋白含量分别是初期的1.13倍和1.15倍。而在透明质酸钠及鼠尾胶原凝胶中则细胞生长缓慢,白蛋白及尿素含量持续下降。结论 4种可注射性支架中,壳聚糖和生物蛋白胶对于新生大鼠肝细胞生物相容性较好,透明质酸和鼠尾胶原较差,前两者更适合用于工程化肝组织的构建。     

用组织工程方法修复山羊胫骨骨缺损的实验研究

制备组织工程用山羊胫骨骨缺损模型，研究用组织工程的方法修复山羊胫骨骨缺损的可行性。27只中国山羊制备单侧胫肌中段20mm 的骨膜与骨缺损，7孔钢板内固定，随机分3组：空白组不进行植入处理；对照组（CHAP组）单纯植入羟基磷灰石（CHAP）；实验组（CHAP／BMSc组）植入CHAP 与骨髓基质细胞（BMSc）的复合物。术的4、8、12周放射学检查X线片光密度指数比值、组织学方法评价各组骨缺损修复情况，12周CHAP／BMSc组与CHAP组做压应变与三点弯曲试验，评价骨缺损修复后的生物力学性质。结果显示，术后4、8、12周X线片光密度指数比值空白组无明显变化，CHAP组低于CHAP／BMSc组（P＜0．05）；组织学切片显示CHAP／BMSc组成骨较CHAP组早、多；12周三点弯曲实验载荷、弯曲应力CHAP／BMSc组高于C组（P＜0．05）。提示山羊胫骨20mm骨与骨膜缺损不能自行修复，可满足骨组织工程大动物实验需要；CHAP与BMSc复合物修复骨缺损在成骨时间、成骨量与质量上均优于单纯CHAP.     

以牛胶原凝胶为支架构建人工真皮的研究

目的：制备成纤维细胞胶原凝胶(即真皮替代物)，以研究细胞的生长、分化、增生及与真表皮问的相互作用，为研制大面积创面覆盖物——复合皮奠定基础。方法：①酶消化法培养胎儿成纤维细胞；②制备细胞胶原凝胶，分为Ca—gel和Cf-gel组，接种后于不同时间观察两组细胞的形态变化和胶原凝胶的收缩情况；③细胞计数；④SEM观测胶原凝胶的表面是否有成纤维细胞附着；⑤HE染色。结果：①成纤维细胞形态及增殖情况：成纤维细胞胶原凝胶形成后呈半透明状，可出现较明显的细胞增殖，并可见凝胶收缩现象，但Ca-gel组较小；人工真皮质地与颜色近似真皮组织，有一定的弹性和抗拉性，不易脆。②细胞计数法所得两组生长曲线基本相似。Ca-gel和Cf-gel组细胞均具有典型的细胞增殖现象，Cf-gel组细胞在后期的增殖略快于Ca-gel组。③扫描显微镜下可见到凝胶表面有梭形的成纤维细胞出现，且成纤维细胞紧密贴附于凝胶上。④HE染色可见胶原呈较均一的淡红色网状分布，成纤维细胞分布于胶原凝胶内部和表面。结论：①培养好的细胞凝胶称之为真皮替代物，是进行皮肤器官型培养和制作复合皮的关键与基础，并可与培养的人工表皮膜片混合移植，起到促进表皮细胞的生长黏附和加速创面愈合的作用。②成纤维细胞在胶原凝胶中有着活跃的生物学特性，因此在研究成纤维细胞在创面愈合中的生物学行为以及在皮肤组织工程学的研究中，以胶原凝胶为支架的三维培养系统较脱细胞基质系统更为科学。     

脂肪来源干细胞的多向分化性及其在组织工程中的应用

近期研究表明间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSC）可以从脂肪组织获得,这类细胞被称为脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells,ADSCs）。ADSCs与骨髓来源MSC具有相似的多向分化性,并且存在容易获取、取材创伤小和细胞获得量大等优点,因此有望成为组织工程中另一种很有前景的种子细胞来源。本文介绍了ADSCs多向分化性的最新研究进展,以及在各种组织工程中的应用情况。     

种植密度、换液时间对人间充质干细胞原代培养时间的影响

目的 :探讨不同种植密度、换液时间对人间充质干细胞 (hMSCs)原代培养时间的影响 ,从而确定原代培养hMSCs的适宜条件。方法 :分离人骨髓细胞 ,按不同种植密度、首次换液时间分组进行原代培养 ,记录原代培养时间 ,然后进行传代培养和成骨诱导培养 ,并检测细胞碱性磷酸酶、骨钙素、钙结节表达情况。结果 :hMSCs原代培养种植细胞密度为 1× 10 5～ 3× 10 5/cm2 ,4 8h后换液的方法较合理。经化学药物 (如地塞米松、β -甘油磷酸、维生素C)成骨诱导后 ,hMSCs表达碱性磷酸酶、骨钙素明显增加 ,并可形成钙结节。结论 :合理hMSCs原代培养方法 ,可以快速获得大量的自体种子细胞 ,从而为组织工程化骨的体外构建创造条件。     

间充质干细胞的来源及临床应用

在骨髓中存在着一群非造血的干细胞成分———间充质干细胞。间充质干细胞在体外可扩增 ,在体内体外都能被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、腱细胞、肌肉细胞、神经细胞和支持造血的基质等。间充质干细胞是多潜能 ,并且易分离培养 ,在体外可被大量扩增。因此 ,间充质干细胞在组织工程、细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。本文对骨髓来源的间充质干细胞的生物学特性和其他间质组织来源的间充质干细胞以及它们在临床上的应用进行了综述     

术中富集骨髓细胞构建组织工程骨成骨能力的研究

目的 观察术中富集骨髓干细胞构建的组织工程骨在山羊脊柱横突间融合的成骨效果,为组织工程骨探索一种新型的构建方法.方法 将多聚左旋赖氨酸(poly-L-lysine,PLL)修饰于山羊脱钙骨基质(demineralized bone matrix,DBM)制备成基质材料(PLL-DBM);以山羊横突间隙为植骨模型,观察PIL-DBM富集骨髓细胞构建的组织工程骨(Ⅰ A组)的成骨能力;对照组为自体髂骨组(Ⅰ B组)、DBM富集骨髓组(Ⅱ C组)、空白DBM组(Ⅱ D组).于术后第16周取融合段标本行X线片、三维CT及CT值检测和生物力学检测,对比分析、评价其成骨能力.结果 X线表现:ⅠA组、Ⅰ B组融合范围基本相同,明显较ⅡC组宽,Ⅱ D组基本无融合.三维CT:Ⅰ A组的CT值为(696.76±102.75)HU,ⅠB组的CT值为(766.03±69.24)HU,二者差异无统计学意义(P>0.05),均明显较ⅡC组高(P<0.05),Ⅱ C组CT值较ⅡD组高(P<0.01).生物力学性能:Ⅱ A、Ⅰ B两组最大载荷、抗弯强度比较差异均无统计学意义(P>0.05),ⅠA组较Ⅱ C组高(P<0.01,0.05),Ⅰ B组较ⅡC组高(P<0.01),ⅡC组较ⅡD组高(P<0.01). 结论 PLL-DBM术中富集骨髓干细胞快速构建的组织工程骨是一种理想的组织工程骨,其成骨能力与自体髂骨相当.     

组织工程脱细胞角膜基质联合干细胞诱导分化制备异体角膜移植材料研究

目的研究脱细胞角膜基质联合干细胞制备异体角膜移植材料的安全性和有效性。方法应用酶-深低温法对猪角膜基质进行处理,制备猪脱细胞角膜基质。采用微注射法注入骨髓间充质干细胞进行共培养,制备异体角膜移植材料,并将其植于角膜病变的新西兰大白兔,评价术后组织工程角膜的系统性功能。结果脱细胞角膜基质的显微结构显示板层结构完整,未见细胞残留。共培养后光镜观察角膜基质细胞可于脱细胞角膜基质内生长,细胞形态具有纤维细胞特征,但分布不够均匀。移植术后,组织工程角膜愈合良好,未见明显的炎症及排斥反应。结论脱细胞角膜基质联合干细胞诱导分化制备异体角膜移植材料具有免疫排斥率低,组织相容性佳的特性。     

脂肪来源间充质干细胞研究进展

间充质干细胞最早发现于骨髓中,脂肪来源的间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的生物学特性和分化潜能,并且具有很多优势,有望成为组织工程和基因治疗的新型靶细胞,具有广阔的应用前景.本文综述了脂肪来源间充质干细胞的分离培养、生物学特性及其应用等进展,并对其研究前景进行了探讨.     

血管内皮祖细胞促血管化组织工程骨修复兔大段骨缺损的效果评价

目的 评价血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)促血管化组织工程骨修复兔桡骨大段骨缺损的效果.方法 选用68只新西兰大耳白兔,以数字随机法分为3组.实验组:EPCs+经成骨诱导的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)+脱钙骨基质(decalcified bone matrix,DBM);自身对照组:BMSCs+DBM;阴性对照组:单纯DBM.将上述材料置入桡骨中段15 mm骨缺损区,术后12,16周摄X线片行骨密度、组织学光镜、骨钙素免疫组化染色及生物力学测试.结果 实验组的骨痂生长、塑形、髓腔再通、骨愈合速度及力学强度等方面均明显优于对照组.结论 EPCs促血管化组织工程骨成骨能力强,能有效促进骨愈合,是修复大段骨缺损的有效方法.