血管内皮生长因子165核酶的合成及其体外活性

目的 探讨抗血管内皮生长因子165（VEGF165）核酶的设计合成及其生物学活性。方法 利用计算机辅助设计针对VEGF165的锤头状核酶，构建核酶的自剪切转录载体pGEMRz212，体外转录合成核酶Rz212及其相应的底物VEGF165mRNA，在无细胞体系中观察核酶对靶RNA的切割作用。结果 构建的自剪切转录载体在转录的过程中发生了自身剪切，并释放出目的核酶Rz212，该核酶具有切割VEGF165 mRNA的作用。结论 计算机辅助设计的VEGF165锤头状核酶体外可有效切割靶RNA，具有较高的生物活性。     

抗HIF-1αmRNA锤头状核酶设计及其基因克隆

目的 设计一个抗缺氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA的锤头状核酶，并构建它的基因表达载体，以便用于肿瘤的基因治疗。方法 用RNA结构分析软件预测HIF-1α mRNA的二级结构并选择合适的核酶作用靶点，以选定的靶点设计相应的锤头状核酶，合成编码核酶的DNA并克隆到载体pSP72上，酶切及DNA测序鉴定核酶序列。结果 HIF-1α mRNA的72位含有GUC三联体，可以作为核酶的切割靶点，设计的核酶包括22nt的催化活性中心和16nt的侧翼序列。计算机辅助预测证明此位点为合适的靶点，限制性内切酶和DNA测序证实核酶基因正确插入载体pSP72上。结论 成功设计并构建抗HIF-1α mRNA锤头状核酶基因表达载体，为进一步运用核酶切割HIF-1α mRNA基因，从而抑制肿瘤生长提供了必要条件。     

主要组织相容性复合物Ⅱ类分子转录激活因子核酶的克隆及其活性

目的探讨主要组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子转录激活因子(CⅡTA)核酶抑制MHCⅡ类分子的表达。方法设计并合成针对人类CⅡTA的一组核酶,通过体外制备和活性鉴定,筛选出活性较高的核酶一Rz464。将Rz464克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP,简称为pRz464,并稳定转染Daudi细胞株(pRzA64一D),流式细胞术检测经典的MHCⅡ(HLA-DR、-DP、-DQ)类抗原表达,RT—PCR检测CⅡTA mRNA水平。结果 pRz464-D与无关核酶组比较,HLA—DR、-DP、-DQ抗原表达分别降低了88．4％、83．5％、93．4％;同时CⅡTA的mRNA含量明显减少。结论提示抗CⅡTA锤头状核酶抑制了自身mRNA含量,从而阻止了其调控的MHCⅡ类分子的相应表达。     

抗人组织金属蛋白酶抑制剂1的核酶高表达载体的构建及体外活性鉴定

目的:构建特异性切割人组织金属蛋白酶抑制剂1(tissue inhibitor of metalloproteinases1,TIMP-1)的锤头状核酶的真核表达载体并在体外进行活性鉴定,为应用于瘢痕基因治疗奠定基础.方法:设计并合成针对人组织TIMP-1 mRNA的锤头状核酶基因Rz182、Rz358和Rz412及相应的点突变核酶基因,将核酶基因克隆于可在体内高表达核酶的载体pBSKneoU6中,制备嵌合于U6 snRNA分子的核酶基因克隆.逆转录聚合酶链式反应获得全长TIMP-1 mRNA基因片段并克隆至T载体.体外转录法大量制备以α-32P UTP 标记的核酶及靶RNA,进行体外切割实验.结果:核酶基因克隆制备正确,在体外成功转录出嵌合于U6 snRNA的核酶和靶RNA. 37℃的生理温度下,U6Rz182和U6Rz358成功切割了靶RNA,U6Rz182切割效率为49.23%,Km=29.7 nmol/L,Kcat=0.32 min-1.U6Rz358切割效率为55.21%.Km=39.6 nmol/L,Kcat=0.21 min-1.U6Rz412及突变核酶均未显示切割活性.结论:本研究中制备的U6Rz182和U6Rz358有良好的特异催化切割活性,有望在瘢痕成纤维细胞内抑制人TIMP-1的表达,成为新的抗瘢痕核酸药物.     

c-myc基因mRNA核酶对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用

目的：构建特异性切割c-myc基因mRNA的锤头状核酶（Ribozyme)真核表达载体。探讨核酶对血管平滑肌细胞（VSMCs)增殖的影响。方法：计算机分析大鼠c-myc基因mRNA的二级结构，选择第2029位点作为锤头状核酶的切割位点并设计相应的核酶。采用DNA合成仪合成核酶基因，以克隆技术将核酶基因构建人pGEM3Zf( )体外转录载体，以Sanger双脱氧末端终止法测定核酶基因的序列后，通过亚克隆将核酶基因构建入pcDNA3真核表达载体；核酶真核表达载体以阳离子脂质体LipofectAMINE作为介导，转染体外培养的第5代SD大鼠VSMCs，经G418筛选出细胞克隆，流式细胞仪测定VSMCs的细胞周期。结果：核酶基因准确克隆入pGEM3Zf( )载体，DNA序列测定表明所克隆入的核酶基因序列正确；经过亚克隆将核酶基因准确克隆入pcDNA3载体（pcDNA-Rz);pcDNA-Rz转染VSMCs经G418筛选出多个抗性细胞克隆，扩大培养获得转染细胞；细胞周期分析显示，pcDNA-Rz转染细胞的细胞周期有明显变化，S期和G2/M期比率明显减少，细胞生长阻滞于G0/G1期，细胞增殖指数明显降低。结论：特异性切割c-myc基因mRNA核酶对体外培养VSMCs的增殖具有明显的抑制作用。     

tRNA~(val)-CTE复合核酶真核表达载体构建

目的构建tRNA^val—CTE复合核酶真核表达载体，为进一步研究打下基础。方法用RT—PCR法扩增CTE DNA；合成含tRNA^val启动子和HCV5-NCIK区195住的核酶以覆内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ序列，通过退火连接到pPUR质粒的BamHⅠ和EcoRⅠ的酶切位点之间，构建质粒pPHCV—Rz；用KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切后，将CTE cDNA定向插入表达载体pPHCV—Rz多克隆位点中，构建成重组表达质粒，并用酶切分析和序列测定进行了鉴定。结果酶切鉴定和测序证实tRNA^val启动子和HCV5-NCIK区195住的核酶基因以覆CTE cDNA被正确克隆入真核表达载体pPUK。结论tRNA^val-CTE复合核酶真核表达载体的成功构建，为开展利用tRNA^val-CTE复合核酶切割HCV RNA的研究奠定了基础。     

锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性的影响

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ 交换器（NHE）-1表达和活性，pHi的影响。方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达，pHi和Na^ /H^ 交换活性变化。结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE-1mRNA表达减少，Na^ /H^ 交换活性降低，同时伴有pHi降低。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE-1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化。     

抗血管内皮生长因子多位点核酶的合成及其体外切割作用

目的: 设计合成血管内皮生长因子多位点核酶,探讨其对靶RNA的切割作用.方法: 利用计算机辅助设计针对VEGF165的3个单位点核酶 (Rz1, Rz2, Rz3) 和联合型多位点核酶 (Rz123),构建其自剪切转录载体,观察多位点核酶对靶RNA的切割作用.结果: 构建的多位点核酶自剪切转录载体在体外转录中,顺式核酶发生了自身剪切,并释放出正确的目的核酶,多位点核酶可切割靶RNA,且效率高于单一核酶,其切割效率分别为 (37±10)% (Rz1), (51±8)% (Rz2 ), (68±15)% (Rz3) 和(88±11)% (Rz123).结论: 抗血管内皮生长因子多位点核酶体外可联合切割靶RNA,具有较高的生物活性.     

锤头结构核酶在HHCC细胞对丙型肝炎病毒基因表达的抑制作用

为了研究抗丙型肝炎病毒 (HCV )锤头结构核酶 (Rz)在人肝癌细胞 HHCC内对 HCV的抑制作用 ,通过计算机辅助设计 ,应用基因重组技术构建 Rz真核表达载体 ,应用脂质体介导的基因转染方法 ,分别或共转染含 Rz基因和融合 luc的靶基因真核表达载体于 HHCC,应用液闪计数仪检测荧光素酶报告基因的表达活性 .结果表明 :1选择设计出针对 HCV5 NCR的 Rz2 13(CUC)和 Rz2 6 0 (GU A) ,C区的 Rz40 7(GUC)和 Rz498(CUU) 4个锤头结构 ,并成功建立 Rz2 13和 Rz2 6 0载体 ;2 Rz2 13和Rz2 6 0均能在 HHCC细胞内有效的抑制 luc基因的表达 ,…     

核酶对大鼠肺动脉平滑肌NHE-1活性及细胞增殖的作用

目的 探讨锤头状核酶对大鼠肺动脉平滑肌细胞Na^ /H^ ’交换器-1表达和活性、pHi的影响，及其与细胞增殖的关系.方法 构建含锤头状核酶序列的pLXSN反转录病毒重组载体，将其转染体外培养的大鼠肺动脉平滑肌细胞，G418筛选后获取含有重组载体的细胞克隆。检测细胞NHE-1mRNA表达、PHi、pHi恢复速率、^22Na摄取量和^3H—TdR掺入量变化.结果 与转染pLXSN空载体的细胞和正常对照组细胞比较，转染了重组载体的肺动脉平滑肌细胞中NHE—1 mRNA表达、^22Na摄取量减少，同时伴有pHi降低、pHi恢复速率下降和^3H—TdR掺入量减少。结论 所设计的锤头状核酶可对NHE—1mRNA进行特异性切割，减少其表达，使其活性下降，从而诱导细胞酸化，抑制肺动脉平滑肌细胞增殖。     

麻疹的双相移位研究进展

近年新生儿、婴儿、成人麻疹患者逐年增加,临床表现一般仍较典型,成年人麻疹患者全身中毒症状较重。麻疹抗体检测结果阳性是主要的诊断依据。麻疹发病的双相移位的机理可能是,免疫保护力不足,婴儿出生时麻疹抗体力低。孕期母传胎的麻疹抗体减弱,母经乳汁传给婴儿的抗体减弱,成人麻疹抗体水平逐年下降。预防措施是怀孕前给予育龄妇女麻疹疫苗接种,鼓励母乳喂养,麻疹疫苗计划免疫适当提前,在成人追加麻疹疫苗的免疫,加强病毒变异的研究等。     

尿液pH值对红细胞检验影响的探讨

[目的 ]通过尿液 pH值对红细胞检验影响的观察 ,更加科学、准确地诊断血尿和血红蛋白尿。[方法 ]采用干化学分析仪检测和尿液显微镜红细胞计数 ,观察 180例正常人尿标本加入正常人血标本后 ,不同 pH值 ,不同时间内 ,观察红细胞溶解情况。 [结果 ]pH <5 .5以下时 ,随着时间的延长 ,红细胞溶解现象明显。 1h后观察有显著性差异 (P <0 .0 5 ) ;2h后有非常显著性差异 (P <0 .0 1)。[结论 ]pH <5 .5时对红细胞计数影响较大 ,易致红细胞发生溶解现象 ,出现假性血红蛋白尿 ,对血尿和血红蛋白尿很难区分 ,给临床诊断造成不便 ,更易引起漏诊和误诊。     

阴道炎1236例病原检查分析

对１２３６例阴道炎患者的阴道分泌物作直接镜检和病原菌分离培养检查；结果，细菌感染９００例，念珠菌２３４例，滴虫１０２例。９００例细菌经鉴定；葡萄球菌３００例，阴道加特纳菌２７６例，淋病奈瑟菌１７０例，其它细菌１２４例。结果表明，葡萄球菌，阴道加特纳菌，淋病奈瑟菌是细菌性阴道炎最常见的致病菌。     

碱量法测定壳多糖脱乙酰度的方法探讨

目的：评价壳多糖脱乙酰度测定的减量法的影响因素。方法：通过实验评价碱量法的精准度及样本含潮量等因素对测定结果的影响,并对汪氏推荐计算公式和本文作者提出的改良公式作出评价。结果：碱量法测定壳多糖脱乙酰度受样本性状、含潮率、反应体系中酸量的影响。改良公式更能反映样本实际脱乙酰度。结论：碱量法简便易行,评价指标在可接受范围,可用于壳多糖研制中的质量评价。     

喉癌主癌灶手术切缘的临床特点分析

目的探讨研究喉癌主癌灶手术的安全切缘在临床上的特点。方法回顾性分析2007年6月—2011年3月已经确诊喉癌的患者100例,随机分成A、B两组,A组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取镜下观察分析;B组为观察组50例,主要采取手术切缘后,然后采取肉眼观察分析,将结果进行临床特点分析比较。结果早期的喉癌患者和晚期的喉癌患者的阳性切缘例数,差异无统计学意义（P〉0.05）;晚期的阳性切缘发生次数高于早期的阳性切缘发生次数,差异有统计学意义（P〈0.05）。声门上区[SG]2、3和5、10mm;跨声门型[TG]2、3mm和5、10mm的切缘对比,差异有统计学意义（P〈0.05）。SG、G、TG、IG的2mm和3mm,5mm和10mm对,差异无统计学意义（P〉0.05）。肉眼阳性切缘观察39个,镜下阳性切缘观察43,两者差异无统计学意义（P〉0.05）。结论依据原发不同部位、不同分期和不同范围选取适合的切线,就可以有效地减少阳性切缘的发生。     

腰椎间盘突出症再次手术的原因分析

目的解决腰椎间盘突出症手术中神经压迫。方法对1980～1998年再手术资料进行统计分析,讨论分析再手术原因,再次手术前影像学检查,观察病理变化以确定再手术方法。结果对11例随访6个月～1年,优7例(68．4％),良3例(36．8％),差1例(2．8％)。结论初次手术前详细查体和分析X线片,术中用导尿管和神经剥离探查,尽量避免髓核遗留,手术范围不宜太大,尽量减少对软组织和脊柱结构的破坏,避免形成硬膜囊与神经根粘连而致单纯形疤痕。     

扩张兔皮肤超微结构的变化

目的：动态观察扩张兔皮肤超微结构的变化。方法：选用2--3kg新西兰大白兔64只，分为2大组，快速扩张组和常规扩张组，每组32只，每大组再分为4组，为扩张完成后即时、1周、12周、24周组。每组8只，其中4只为实验组，另4只植入扩张器不扩张作为对照组。透射电子显微镜观察各组皮肤超微结构的变化。结果：表皮扩张后经历--由扩张刺激引起的创伤至完全修复的过程。扩张后即时真皮中成纤维细胞大量增生，功能由静止转向活跃，胶原纤维碎裂成片，弹力纤维部分断裂，炎症细胞浸润；扩张后1周常规扩张组基底膜连续性基本恢复。显示成纤维细胞合成功能活跃。扩张后12周、24周，成纤维细胞趋于稳定、形态狭长，部分胶原排列紊乱，部分有似癜痕样改变。结论：扩张刺激可致兔皮肤创伤。扩张后真皮不可完全修复。     

儿童腹痛328例病因诊断及分析

目的：根据儿童急性腹痛的特点,诊断儿童腹痛应综合临床及相关检查提供的依据,做出准确诊断,给予适当治疗。方法：对临床328例腹痛患儿进行选择性辅助检查和分析。结果：小儿腹痛病因复杂,腹腔内疾病占64．63％,共17种病因;腹腔外疾病占35．37％,共6种病因。结论：仔细询问病史、认真体格检查、密切观察病情、针对性地选择辅助检查,在儿童腹痛的诊断上具有重要的意义。     

芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用

目的观察芹黄素对大鼠缺血视网膜功能恢复的作用。方法30只Long-Evans大鼠用动脉结扎法造成视网膜缺血模型,其中治疗组20只腹腔注射芹黄素,对照组10只注射溶媒二甲基亚酚。用视觉电生理仪检查视网膜功能恢复情况。结果芹黄素治疗组视网膜功能恢复明显好于对照组(P<0.05)。结论芹黄素能促进大鼠缺血视网膜的功能恢复。      

手术治疗髋臼骨折45例效果观察

目的:探讨髋臼骨折患者的手术治疗效果。方法:系统性回顾收治的45例髋臼骨折患者手术治疗效果。结果:本组患者随访2～8年,治疗的总优、良患者38例,总优良率达到84%,手术切口全部愈合,未发生切口感染及深部感染,在患者中5例出现并发症:1例坐骨神经损伤,1例股骨头坏死,1例异位骨化,2例创伤性关节炎。结论:充分的术前计划,恰当的手术时机,正确的入路选择以及良好的术后锻炼,是治疗髋臼骨折的有效方法。