急性喘息儿童感染HBoV的临床分析

目的分析研究急性喘息儿童人博卡病毒(HBoV)感染的临床特征。方法对219例因急性喘息就诊的患儿采用实时荧光定量PCR法对鼻咽部抽吸物(NPA)进行博卡病毒(HBoV)检测,阳性病例采用实时荧光定量PCR对其DNA载量进行测定,并结合其临床特征进行综合分析。结果 HboV感染患儿22例,总阳性率为10.05%,平均检出年龄为1岁7月,未见明显季节性及性别差异。HBoV感染重症喘息患儿(7.9×108拷贝/ml)与非重症喘息患儿(3.4×10~8拷贝/ml)HBoV的病毒载量差异无统计学意义(P>0.05),HBoV协同感染(4.5×10~8拷贝/ml)与独立感染(2.7×10~8拷贝/ml)患儿病毒载量差异无统计学意义(P>0.05)。结论博卡病毒是小儿急性喘息性疾患的重要病原体,常年均可检出,HBoV可能不是小儿急性喘息的唯一致病因素。     

实时荧光定量RT-PCR快速检测四种呼吸道病毒的研究

目的利用实时荧光定量RT-PCR建立快速检测人腺病毒(HADV)、人博卡病毒(HBoV)、人偏肺病毒(HMPV)、人呼吸道合胞病毒(HRSV)等四种呼吸道病毒的方法。方法寻找四种呼吸道病毒的相对保守序列,针对该序列分别设计4对引物对及其相应的Taqman探针,将此保守序列作为目的基因片段,使用一步法RT-PCR试剂盒建立、优化反应体系;采用10倍稀释体外转录RNA,检测建立的体系的灵敏度和重复性并建立反应体系标准曲线;通过临床样本检验体系的特异性。结果 HADV、HBoV、HMPV、HRSV四种病毒的检测灵敏度均为10 copies/μl,标准曲线的决定系数分别为:HADV R2=0.9998,HBoV R2=0.9981,HMPV R2=0.9981,HRSV R2=0.9947和0.9965,扩增效率分别为:HADV 105.08%,HBoV 107.81%,HMPV 102.08%,HRSV FAM荧光106.38%及CY5荧光107.95%。荧光RT-PCR反应体系检测体外转录的RNA的各个拷贝数浓度的变异系数均较低,对临床样本检验的特异性为100%。结论本研究建立的实时荧光定量RT-PCR体系可快速、准确地检测人HADV、HBoV、HMPV、HRSV等四种呼吸道病毒,且重复性较好,特异性高。     

广州地区流感病毒和人博卡病毒感染的流行病学调查

【目的】 调查2010-2011年广州地区发热呼吸道感染病人的流感病毒(IFV)和人博卡病毒(HBoV)的流行状况和流行特点。【方法】 采集2010-2011年广州市5家哨点医院共3 460例符合条件的有发热伴呼吸道感染症状患者的咽拭子标本,同时进行相关临床信息的收集和分析,采用普通和巢式PCR方法检测IFV和HBoV的核苷酸,分析IFV和HBoV的流行情况和时间、人群分布特点,对IFV和HBoV均为阳性的样本进一步进行副流感病毒等5种常见呼吸道感染病毒的检测,以了解多重感染的状况。【结果】 3 460例病例中,IFV和HBoV的阳性检出率分别为21.13%和1.68%;731例IFV阳性标本中,甲、乙、丙型流感病毒(FluA、B、C)的比例为558∶172∶1,其中481例(66.75%)诊断为上呼吸道感染,58例HBoV阳性病例中44例诊断为下呼吸道感染(75.86%),IFV和HBoV病毒的检出均与年龄关联,检出率最高的年龄组分别为15 ~ 34岁和0.5 ~ 1岁,IFV和HBoV的发病高峰分别为7~8月和5~6月,5例检出HBoV与IFV的混合感染,混合感染率为0.64%,其中1例为IFV、HBoV和人冠状病毒(HCoV)的三重感染,HBoV阳性的成人患者的混合感染率为50%。【结论】 2010-2011年甲型流感病毒仍是广州地区发热呼吸道症候群的主要病原之一,青壮年检测率较高,夏季为流行高峰;人博卡病毒为全年散发,5-6月发病率较高,婴幼儿中发病率较高,成人病例中人博卡病毒与流感病毒的混合感染率较高。     

人细小病毒B19实验诊断技术研究

目的建立一种快速、准确、特异和定量检测人细小病毒B19的实验检测方法。方法以B19病毒NS1基因为靶序列,设计并合成引物和Taqman探针,优化引物与探针比例,调整镁离子浓度,建立对细小病毒B19进行荧光定量检测的实验方法。同时利用荧光定量PCR技术检测本院收集的490例孕妇血清。结果引物与Taqman探针比例为1∶4,镁离子浓度为2.5mmol/L时,反应的本底最低,荧光信号最强。该方法的灵敏度为1.0×101拷贝,有较好的特异性和重复性。检测的490例临床孕妇血清标本,人细小病毒B19DNA阳性为44例,感染率为8.9%(44/490)。结论使用Taqman探针技术的荧光定量聚合酶链反应,能够准确快速定量检测血清中的人细小病毒B19。     

肺炎衣原体荧光PCR检测方法的建立和应用

目的采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法。方法对GenBank登录的肺炎衣原体的基因序列进行生物信息学分析,针对保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR检测方法。对来自本院的560份临床咽拭子样本和肺泡冲洗液样本进行检测。采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价。结果本实时荧光PCR方法对甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒无特异性反应。本院的临床样本检出26份,其中咽拭子9份,肺泡冲洗液17份。结论肺炎支原体荧光PCR检测方法可用于肺炎衣原体感染的辅助诊断。     

实时荧光PCR和RT—PCR方法检测登革病毒的比较研究

目的通过2种检测登革病毒方法的比较，以提高检测登革病毒的灵敏度和特异性。方法利用Taqman MGB技术，根据登革病毒3’端非编码区的一段高度保守序列，设计登革1～4型荧光PCR通用引物和TaqmanMGB探针，以登革热毒株作为标准，以乙脑毒株作对照，建立实时荧光PCR检测登革病毒的快速方法。并对10份ELISA法检测阳性的临床血清标本进行RT—PCR及荧光PCR扩增。结果RT—PCR检测10份临床血清标本，2份阳性，阳性率为20％。实时荧光PCR检测登革病毒与乙脑病毒无交叉反应，检测10份临床血清标本，5份阳性，阳性率为50％。从RNA提取到检测结果仅需4h。结论Taqman MGB实时PCR检测方法快速、敏感性高、特异性强，可作为登革病毒的快速检测方法，应用于登革热的临床早期诊断。     

小儿人博卡病毒感染临床与实验研究

目的 研究人博卡病毒检测方法与小儿感染的临床特征,以提高对小儿人博卡病毒感染的诊治技术。方法 采用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹技术检测患者鼻咽部抽取物、咽拭子和血清标本中的人博卡病毒DNA及特异性抗体,并全面分析感染患儿的各种临床症状、体征及常规实验室检测,同时做远期随访。结果 240例急性下呼吸道感染患者的标本中检出人博卡病毒DNA阳性7例,阳性率为2．92％,其临床表现以高热、阵咳为主,实验室检查外周血白细胞、C-反应蛋白、血沉和血生化指标大多正常。X线胸片表现无特异性,远期随访心肺功能良好。结论 人博卡病毒是引起小儿急性呼吸道感染的重要病原之一,荧光定量PCR和蛋白免疫印迹是灵敏、特异的检测技术。     

血清中HBV cccDNA定量检测方法的建立及临床应用

目的 建立一种以TaqMan为探针检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA（cccDNA）的实时定量PCR检测方法。方法 根据rcDNA与cccDNA结构差异,在缺口两侧设计引物,应用TaqMan探针分析,对实时PCR产物进行克隆、测序以证实产物为目的片段;同时对89例符合病毒性乙型肝炎诊断标准的血清样本进行HBV cccDNA和HBV DNA含量检测,3例未感染乙肝病毒的血清作为阴性对照。结果 测序结果显示扩增产物为目的片段,检出下限为500 copies/mL;89例样本检测HBV cccDNA的阳性率为55.0%,HBeAg阳性患者阳性率为67.8%,HBeAb阳性患者阳性率为30.0%,HBeAg阳性的样本的平均HBV cccDNA水平高于HBeAb阳性的样本（P<0.05）,阴性对照组未检测出HBV cccDNA。应用ROC曲线图评价HBV cccDNA在抗病毒治疗中的价值,其价值为0.927。结论 以TaqMan为探针检测血清HBV cccDNA的实时PCR检测方法的建立,具有快速、敏感、特异性高等特点,应用该方法检测HBV cccDNA含量可作为判断临床抗病毒治疗效果的重要参考指标,指导临床用药。     

昆明地区5岁以下儿童博卡病毒和偏肺病毒感染的临床流行病学调查

目的 了解昆明地区5岁以下急性呼吸道感染患儿中人类博卡病毒(HBoV)和人类偏肺病毒(hMPV)的流行状况、混合感染情况以及主要的临床表现特点.方法 按照病例纳入标准,采集2009年9月至2010年9月在昆明地区6所不同区域医院就诊患儿的鼻咽拭子标本550份,应用多重PCR技术,检测HBoV和hMPV及其它常见引起儿童呼吸道感染的21种病原体.同时收集所有患儿的临床资料以供分析研究.采用Epidata软件创建数据库和管理数据,利用SPSS软件进行数据分析.结果 550份呼吸道感染患儿的鼻咽拭子标本检出HBoV阳性标本18份,检出率为3.3％;检出hMPV阳性标本29份,检出率为5.3％.在18例HBoV阳性的标本中,与其它病原体混合感染的有17例,占阳性标本的94.4％; 29例hMPV阳性标本中与其它病原体混合感染率为58.6％;与HBoV和hMPV混合感染的常见病原体依次有呼吸道合胞病毒、鼻病毒、甲型流感病毒和流感嗜血杆菌;HBoV及hMPV感染无性别差异;HBoV以0～1岁患儿感染率最高;hMPV感染没有明显的年龄组差异.HBoV和hMPV的检出率高峰均为秋冬季.2种病毒感染的主要临床表现均为咳嗽、发热和喘息.结论 HBoV和hMPV是昆明地区儿童急性呼吸道感染的重要病原;在昆明地区的流行季节主要为秋冬季;临床上以咳嗽、喘息和发热为主要表现.     

检测肺炎支原体的实时荧光PCR方法的建立

目的 采用Taqman探针技术,组建肺炎支原体荧光PCR基因检测方法.方法 对GenBank登录的肺炎支原体的基因序列进行生物信息学分析.针对16s核糖体蛋白基因的保守区域设计引物和探针,组建实时荧光PCR方法检测.采用流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒和腺病毒进行特异性评价.采用倍数稀释的方法进行灵敏度的评价.对来自南方医院的522份临床咽拭子样本进行检测.结果 用实时荧光PCR方法检测甲型流感病毒(甲型、乙型)、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道腺病毒均无特异性反应.该方法可以检测出稀释浓度约为103/mL的肺炎支原体样本.对本院的临床样本检出39份.结论 实时荧光PCR检测肺炎支原体具有较高的特异性和灵敏度,可用于肺炎支原体感染的诊断.     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用

目的建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008～2012年期间采集的1 344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1 344份标本进行检测,结果 TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40 min。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好(Kappa值为0.916,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。     

基于AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性检测方法的建立

目的：探讨AllgloTM探针检测IL-1单核苷酸多态性的实用性。方法：采用AllgloTM 探针实时荧光PCR对IL-1β基因SNP进行基因分型。设计其3954C＆gt;T位点AllgloTM探针序列和PCR扩增引物,按照PCR产物特异性和扩增效率,对退火温度、引物浓度等条件进行优化。结果：结果显示AllgloTM探针实时荧光PCR检测体系最适引物浓度为0.4μM,退化温度为58.9℃两步法PCR。在同一条件体系下,检测100例健康体检者IL-1β基因3954C＆gt;T位点,并进行基因分型,测序验证其分型结果。结论：AllgloTM探针实时荧光PCR检测IL-1β基因SNP是一种值得推广的高通量、低成本、常规化的基因分型方法。     

利用荧光定量RT-PCR和PCR方法检测结核分枝杆菌复合群

目的 建立一种新的检测结核分枝杆菌复合群的荧光定量试验方法 （R/P分析）,探讨R/P分析检测临床标本中结核分枝杆菌复合群的应用价值.方法 根据结核分枝杆菌复合群基因保守序列设计引物和探针构建质粒标准品.运用R/P分析检测54例确诊结核病人临床样本,检测的结果 同时与培养法、荧光定量PCR法进行比较.结果 不同临床标本用R/P分析诊断结核病,其敏感性高于荧光定量PCR法和培养法,阳性检出率分别为96.3%、83.3%和55.6%.结论 R/P方法 是一种快速、特异的直接检测方法,它可以区分结核分枝杆菌复合群的死菌与活菌,因此可以更好的指导医生进行治疗,更准确地做出公共卫生决策.     

实时荧光核酸恒温扩增技术在淋球菌检测中的应用分析

目的采用统计学方法评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)在临床淋球菌检测中的应用。方法以淋球菌培养法为标准对照,采用实时荧光核酸恒温扩增技术同时对150例疑似患者的生殖道拭子标本和尿液标本进行检测,对结果进行统计学分析比较,并用PCR法进行验证。结果使用SAT检测的生殖道拭子和尿液阳性检出均为110例,培养法阳性检出为108例,其中培养法检出阴性的2例通过PCR验证为阳性。两种取样方式的SAT检测法和培养法三者阳性率差异均无统计学意义(P0.05);以培养法为金标准,SAT检测拭子的敏感度为100.0%,特异度为95.2%;SAT检测尿液标本的敏感度为100.0%,特异度为95.2%。结论采用实时荧光核酸恒温扩增技术对生殖道拭子和尿道标本的检测效果与培养法相比,阳性率高,敏感度较高,且尿道标本收集方法比较简便,患者依从性好,可代替拭子道取样方法,此方法可在临床推广应用。     

Rapid detection of Haemophilus influenzae and Haemophilus parainfluenzae in nasopharyngeal swabs by multiplex PCR

Objective To establish multiplex PCR-based assays for detecting H.influenzae and H.parainfluenzae.And the PCR-based assays were applied to detect the carriage rates of H.influenzae and H.parainfluenzae in nasopharyngeal swab specimens which were collected from healthy children.Methods Multiplex primers for species-specific PCR were designed by using DNAstar soft based on the sequences of 16S rRNA genes from genus Haemophilus to detect H.influenzae and H.parain fluenzae.Results The sensitivity of the 16S rRNA PCR assay for detecting H.influenzae and H.parainfluenzae was 97.53％ and 100％ respectively,and the specificity was 95.89％ and 96.63％ respectively.Youden's Index on the ability to detect H.influenzae and H.parainfluenzae was 0.9342 and 0.9663 respectively.666 nasopharyngeal swab specimens were collected from healthy children.The detection rates of H.influenzae and H.parainfluenzae were 14.11％ and 16.07％ respectively by using isolation and culture methods.The detection rates of H.influenzae and H.parainfluenzae were 43.54％ and 57.96％ respectively by 16S rRNA PCR assays.The carriage rates of serotypes a,b,c,d,e,f and non-typeable isolates were 0％ (0/666),0.15％ (1/666),1.20％ (8/666),0.15％ (1/666),1.20％ (8/666),1.80％ (12/666),95.50％ (636/666) respectively.Conclusion The multiplex PCR assays were very rapid,reliable and feasible methods for detection of H.influenzae and H.parainfluenzae in pharyngeal swab specimens which were compared to conventional isolation and culture methods.95.5％ of H.influenzae strains in healthy children were nontypeable.The encapsulated or typable strains were mainly three serotypes which was c,e,and f serotype.     

急性呼吸道感染患儿人类博卡病毒检测与分析

目的 探讨人类博卡病毒（HBoV）与儿童急性呼吸道感染（ARTI）的关系。方法 RT-PCR检测2006年11月-2008年4月连续2个冬春季儿科418例呼吸道感染鼻咽分泌物标本的HBoV。结果 HBoV阳性率为5．0％（21／418）。阳性者年龄在4月～5岁。下呼吸道感染HBoV阳性率11．1％（17／153）显著高于上呼吸道感染的1．5％（4／265）（χ^2=18．741,P〈0．001）。结论 HBoV是本地区冬春季儿童呼吸道感染、尤其是下呼吸道感染的的重要病原之一。     

辽阳市手足口病患者标本肠道病毒检测结果

目的 通过对辽阳市2016年手足口病的临床诊断病例的咽拭子标本和粪便标本进行肠道病毒核酸检测和病毒分离培养,比较不同病毒分型下两种标本类型阳性率的差异,探究不同类型标本对手足口病实验室诊断的指导意义。方法 收集107例辽阳市2016年手足口病的临床诊断病例的咽拭子和粪便标本,提取样本核酸,用实时定量PCR法检测肠道病毒通用引物、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型,通过McNemar检验以及Kappa检验对检测结果进行统计学分析。结果 配对采集病例两种类型标本共214份,肠道病毒通用引物、肠道病毒71型和柯萨奇病毒A组16型的咽拭子标本核酸检测阳性率分别为48.6%、8.4%、22.4%;粪便标本的核酸检测阳性率分别为59.8%、11.2%、18.7%。PE、EV71病毒的粪便标本的检出率均大于咽拭子标本的检出率,但CV-A16病毒的粪便标本的检出率却小于咽拭子标本的检出率。其他肠道病毒的咽拭子标本和粪便标本的病毒检出率差异有统计学意义（P<0.05）,粪便标本肠道病毒检测阳性率高于咽拭子标本,同时显示较差的一致性（P<0.05）。结论 在手足口病实验室肠道病毒检测中,粪便标本的肠道病毒检测阳性率高于咽拭子标本,今后的手足口病防治工作中为提高标本检测阳性率,若时间紧迫应首先考虑选择采集粪便标本加以检测。