人α1抗胰蛋白酶基因的克隆及在COS-7细胞中的表达

目的克隆人α1抗胰蛋白酶(α1-AT)基因并在真核细胞中表达。方法以人α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)基因的总RNA为模板，采用反转录PCR法得到α1-AT的编码区cDNA，构建真核表达载体pcDNA3．1( )-α1-AT，在脂质体介导下转染非洲绿猴肾细胞系COS-7，经G418压力筛选建立稳定转染人α1-AT的细胞系，用Western印迹检测其在COS-7细胞中的表达。结果获得的人α1-AT cDNA序列与文献报道的核苷酸序列一致，Western印迹证实稳定转染人α1-AT的COS-7细胞系中有α1-AT的表达。结论构建了人α1抗胰蛋白酶的真核表达载体，并在COS-7细胞中获得稳定表达。     

HER2/neu过表达通过PI3K/Akt通路对乳腺癌细胞MCF7中p53基因表达及细胞生长和放疗敏感性的影响

目的 研究HER2／neu基因过表达通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)通路对乳腺癌细胞MCF7野生型p53基因表达、细胞增殖及对γ射线照射敏感性的影响。方法 以脂质体介导的HER2／neu基因转染MCF7细胞,用G418筛选阳性克隆。通过Western blot鉴定HER2／neu蛋白的表达,并检测p53、信号转导分子Akt和p-Akt蛋白含量的变化及PI3K通路抑制剂LY294002对上述蛋白表达水平的影响。以MTT法检测细胞增殖以及细胞对γ射线照射的敏感性。结果 共获得18个稳定转染HER2／neu基因的阳性克隆,其中1个克隆有HER2／neu基因过表达。过表达HER2／neu的MCF7细胞p-Akt蛋白含量升高,p53蛋白含量低于对照组细胞,LY294002能够抑制p-Akt蛋白和p53蛋白的变化。同时,过表达HER2／neu基因的MCF7细胞生长速度高于对照组细胞,对γ射线照射治疗的敏感性降低,而LY294002能够抑制细胞生长并增强放射治疗的敏感性。结论 MCF7细胞中HER2／neu基因的过表达,能够通过激活PI3K通路导致野生型p53蛋白含量减少、细胞增殖加快及放疗的敏感性降低,这可能是某些p53蛋白为野生型的肿瘤患者对治疗产生抗性的原因。     

缺氧对人小细胞肺癌H446细胞DNA错配修复基因MLH1、MSH2表达的影响及其机制探讨

背景与目的:缺氧对DNA错配修复系统(mismatch repair, MMR)活性的调控是肿瘤细胞遗传不稳定的重要原因,但其机制尚不完全清楚.本研究拟观察缺氧状态下人小细胞肺癌H446细胞DNA错配修复基因MLH1、MSH2的表达变化,初步探讨DNA甲基化在其中的作用.方法:应用RT-PCR、Western blot等方法检测H446细胞在缺氧状态下以及甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)处理后MLH1、MSH2基因的表达水平,同时,采用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测MLH1、MSH2基因启动子CpG岛甲基化状态.结果:缺氧状态下,H446细胞MLH1、MSH2基因在转录和翻译水平均显著性降低.同时,随着缺氧时间延长,MLH1基因启动子逐渐由非甲基化状态、部分甲基化状态转变为完全甲基化状态,而MSH2基因启动子则直接由非甲基化状态转变为完全甲基化状态.甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR可使MLH1、MSH2基因表达水平有所恢复,但去除5-Aza-CdR后其表达再次下调.结论:启动子甲基化可能是缺氧诱导H446细胞显著性下调MLH1、MSH2基因表达的重要机制,甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR可恢复其表达.     

辐射诱导Egr-1调控腺病毒介导Smad 7基因在体表达的实验研究

目的研究辐射诱导下Egr1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达与放射剂量及放射后时相间的关系。方法将Egr1基因启动子的放射敏感元件和Smad7cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内,制备成AD.EgrSmad7。小鼠气管内给AD.EgrSmad7,24h后单次全胸照射。324只小鼠随机分组进入实验,γ线8Gy照射后不同时间取肺组织测定Smad7蛋白含量,研究照射后Smad7基因肺内表达的时效关系。108只小鼠随机分组进入实验,以不同剂量照射后5h取肺组织测定Smad7蛋白含量,研究Smad7基因肺内表达与放射剂量的关系。采用Westernblot印迹法检测小鼠肺组织Smad7蛋白表达。结果γ线照射可明显诱导Egr1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Smad7基因表达量与照射剂量和照射后间隔时间有关,单次照射0～12Gy间Smad7蛋白表达量随剂量升高而增加,15Gy时下降。照射后2～9hSmad7蛋白表达量最高(P<0.05),而后降低,15h降至接近正常水平。结论以腺病毒为载体,经射线诱导Egr1基因启动子能够调控Smad7基因体内表达,Smad7基因表达量与放射剂量及放射后间隔时间有关。     

NGX6对结肠癌细胞系HT-29基因表达谱的影响

背景与目的:结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,其发病机制仍未完全明了。本研究在前期工作的基础上探讨候选抑瘤基因NGX6对结肠癌细胞系HT-29基因表达谱的影响。方法:通过脂质体介导的基因转染构建稳定表达NGX6的结肠癌细胞系pcDNA3.1( )/NGX6/HT-29,以NGX6转染组为实验组,空白质粒转染组为对照组,利用高通量的表达谱芯片BiostarH-80sx1筛选差异表达基因,RT-PCR验证部分基因芯片的实验结果。结果:NGX6基因转染结肠癌细胞系HT-29后引起该细胞系基因表达谱广泛地改变,其中表达差异3倍以上的基因共377个,这些差异表达基因的功能涉及多个方面,包括细胞信号转导﹑细胞周期调控﹑细胞凋亡﹑细胞骨架和运动﹑基因转录和翻译、DNA损伤修复﹑蛋白质合成和代谢等。其中包括一些非常重要的信号转导通路上的分子改变,如Wnt/β-catenin信号通路上的DKK1、ILK、MMP1、COL11A1,ILK信号通路上的ILK,Eph-Ephrins信号通路上的EpHB2,RhoA信号通路上的ROCK2,RanGTPase信号通路上的RANBP1,以及RB/RBBP1信号通路上的RBBP1等。结论:NGX6转染引起了一些非常重要的信号转导通路上的分子改变,可能通过参与调节这些信号转导通路而发挥其抗肿瘤增殖和转移的作用。     

未知基因KH的真核表达载体构建及其对细胞增殖的影响

目的 构建未知基因KH的开放阅读框架(KH-ORF)的真核表达体系,初步探讨未知基因KH对细胞增殖的影响。方法 采用DNA重组技术构建KH-ORF的表达载体pCI-neo-KH-ORF,通过脂质体法转染COS-7细胞和K562细胞,RT-PCR检测目的基因的表达。采用流式细胞术检测：KH-ORF对COS-7细胞和K562细胞周期的影响,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测KH-ORF对COS-7细胞增殖速度的影响,生长曲线与乳酸脱氢酶(LDH)活性测定检测KH-ORF对K562细胞增殖速度的影响。结果 (1)KH-ORF在COS-7细胞与K562细胞中获得表达。(2)KH-ORF对COS-7细胞的细胞周期与增殖速度无明显影响。(3)流式细胞术检测显示,KH-ORF使K562／pCi-KH-ORF细胞周期中S期细胞增多;生长曲线显示,KH-ORF促进K562／pCI-KH-ORF细胞增殖;LDH活性测定结果表明,K562／pCI-KH-ORF细胞LDH比活性上升,高于对照组细胞。结论 KH基因可能是一个与K562细胞增殖有关的白血病未知基因。     

线粒体融合素基因-2对人乳腺癌MCF-7细胞株增殖与化疗敏感性的影响

背景与目的:线粒体融合素基因-2(mitofusin-2 gene,mfn2)是作用于线粒体外膜的一种增殖抑制基因,mfn2过表达可抑制血管平滑肌细胞的增殖.本研究探讨外源性mfn2对人乳腺癌细胞MCF-7增殖以及化疗敏感性的影响.方法:将含有mfn2 cDNA的质粒在阳离子聚合物的介导下体外转染MCF-7细胞,Western blot法检测绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达,细胞计数及MTT法检测mfn2对MCF-7细胞增殖的影响,流式细胞术检测MCF-7细胞周期分布及喜树碱处理前后细胞凋亡的变化.结果:转染mfn2基因的MCF-7细胞可以稳定高表达GFP.MTT实验提示转染mfn2 cDNA后,MCF-7细胞增殖明显受到抑制,DNA直方图显示细胞停滞于S期,转染mfn2 cDNA组S期细胞比率为(42.7±1.3)%,高于转染空质粒组的(17.2 2.0)%和空白对照组的(19.6±1.7)%(P＜0.05).mfn2基因转染后诱导的细胞凋亡率从(3.6±0.6)%升高到(16.0±0.3)%;加入喜树碱4 h后转染mfn2基因的细胞凋亡率为(69.6 4.3)%,高于转染空质粒组的(31.0±1.8)%和空白对照组的(23.4 2.8)%(P＜0.05).结论:转染mfn2基因可以明显抑制MCF-7细胞的增殖,增强MCF-7细胞对喜树碱的敏感性.     

Smad4和Smad7在人脑胶质瘤中的表达及意义

目的探讨Smad4和Smad7在人脑胶质瘤中的表达及意义.方法采用免疫组化方法,对临床经过石蜡包埋的30例胶质瘤和8例正常脑组织标本进行定位和定性检测.结果 Smad4 和 Smad7蛋白在胶质瘤中有不同程度的表达,在正常脑组织、低、高级别胶质瘤中Smad4的阳性表达分别为44.80±16.19,25.81±9.48,6.73±3.71,P<0.05.Smad7的阳性表达分别为6.69±3.86,18.22±7.84,41.95±17.27,P<0.05.差别均有显著意义.且Smad4与Smad7的表达水平呈负相关,r＝-0.82,P<0.01.结论 Smad4随胶质瘤的病理分级增高阳性表达降低,对胶质瘤的进展有抑制作用.Smad7则相反,可能参与了胶质瘤的恶性进展.     

Smad4蛋白与蛋白激酶在非小细胞肺癌信号传导通路中的作用

目的探讨Smad4在非小细胞肺癌（NSCLC）中的表达,研究其与有丝分裂激活的蛋白激酶（MAPK）各亚族的关系和临床意义。方法应用Western印迹分析和RT-PCR方法,检测42例手术切除的肺癌标本和正常肺组织中Smadd的表达;应用免疫组化法,检测71例肺癌蜡块标本中Smad4和MAPK的亚族p38、ERK1、JNK1的表达。对各因子进行生存分析,判断对NSCLC预后的影响。结果在肺癌组织中,Smad4蛋白和mRNA的表达均低于正常组织（P〈0．05）;p38、ERKI和Smad4的表达与病理分期有关（P=0．000;P=0．000;P=0．005）;JNK1的表达与肿瘤位置（P=0．028）和病理分期（P=0．000）有关;Smad4和p38（P=0．000）明显相关。单因素分析显示,Smad4（P=0．0001）、p38（P=0．0000）、JNK1（P=0．0208）、肿瘤分化（P=0．0059）和病理分期（P=0．oooo）与预后相关。多因素分析显示,Smad4（P=0．019）、p38（P=0．044）、肿瘤分化（P=0．003）和病理分瓤P=0．020）与预后明显相关。p38阴性而Smad4阳性的肺癌患者预后较好（P=0．000）。结论Smad4的表达在NSCLC的发生发展中可能起重要意义。在NSCLC中,ras—MAPK信号通路、转换生长因子p（TGF—p）／Smad4信号通路的主要蛋白密切相关,p38和ERK1抑制Smad4的表达。Smad4和p38可用于判断NSCLC的预后。     

放射线诱导Smad 7基因表达阻断放射性肺纤维化离体实验研究

目的研究含Egr-1基因启动子和Smad 7 cDNA的重组腺病毒在细胞水平表达Smad 7蛋白，是否具有阻断转化生长因子-β1(TGF-β1)信号传导通路从而阻断胶原合成的生物学活性。方法重组腺病毒感染成纤维细胞(3T6)，经深部X线照射后通过免疫细胞化学方法检测Smad 7蛋白在细胞内的表达定位。成纤维细胞再经TGF-β1刺激后通过^3H-胸腺嘧啶核苷(^3H-TdR)和^3H-脯氨酸(^3H-Pro)结合法检测比较实验组和对照组细胞增殖能力和胶原合成情况，采用液体闪烁计数法测定每分钟闪烁计数(cpm)值进行定量比较。结果细胞免疫化学结果显示Smad 7蛋白表达定位于细胞浆内。同位素^3H—Pro检测结果显示实验组cpm值为3287，对照组cpm值为5690，两者差异有统计学意义(P=0．026)。空白组cpm值为3625，与实验组无差别(P=0．741)，说明实验组成纤维细胞胶原合成量明显低于对照组，与基础水平相当。^3H—TdR检测结果显示各组间细胞增殖能力无明显差别(P=0．312)。结论通过重组腺病毒在成纤维细胞内表达的Smad7蛋白具有在细胞浆内阻断TGF-β1信号传导通路从而抑制胶原合成的生物学活性，其抑制胶原合成可能是在转录水平实现的。     

水通道蛋白1基因过表达对K562细胞红系分化和增殖的影响

目的:探讨水通道蛋白1(aquaporin-1,AQP1)过表达对人慢性髓细胞白血病(chronic myeloidleukemia,CML) K562细胞红系分化和增殖的影响.方法:以人脑cDNA文库为模板,通过PCR扩增出AQP1基因的编码序列,构建pBABE-puro-AQP1真核表达载体;感染K562细胞,筛选建立稳定过表达AQP1基因的K562细胞株(命名为K562-AQP1);实时荧光定量PCR法、细胞免疫荧光染色法及蛋白质印迹法分别检测AQP1转录和蛋白表达水平.通过MTT法检测细胞生长增殖、实时荧光定量PCR法检测γ珠蛋白表达和分光光度法检测血红蛋白含量,研究AQP1过表达对K562细胞红系分化和增殖的影响.结果:与空载体对照组相比,pBABE-puro-AQP1转染入K562细胞后AQP1 mRNA和蛋白表达水平皆有显著升高(P＜0.01),K562-AQP1细胞中红系分化指标γ珠蛋白和血红蛋白表达水平明显增加,同时细胞生长速度明显降低(P＜0.05).结论:AQP1过表达可以显著促进K562细胞向红系分化,同时抑制细胞增殖.推测AQP1可能成为临床诱导分化治疗CML的基因靶点之一.     

辛伐他汀抑制肿瘤细胞增殖及其可能的机制

目的研究辛伐他汀对肿瘤细胞增殖的抑制作用及其可能的机制。方法将U87、Hela、HCT-116（p53＋／＋）和HCT-116（p53-／-）4种肿瘤细胞在不同浓度的辛伐他汀溶液中培养48h，二苯基溴化四氮唑蓝（MTT）法检测肿瘤细胞的增殖情况；将4种肿瘤细胞在100μmol／L的辛伐他汀溶液中培养24、48、72和96h，观察肿瘤细胞的增殖情况；流式细胞仪检测辛伐他汀对4种肿瘤细胞细胞周期的影响；Westernblot法检测p21、ERK1／2、p38、JNK和Akt蛋白的表达以及ERK1／2、p38、JNK和Akt的磷酸化水平。结果与对照组和溶媒组比较，辛伐他汀可明显抑制4种肿瘤细胞的生长，并呈明显的剂量和时间依赖性（P〈0．05）；辛伐他汀使肿瘤细胞停滞于细胞周期的G1期，并且通过p53非依赖性途径上调p21的表达。Westernblot结果显示，辛伐他汀显著上调了p38和JNK的磷酸化水平，但是对信号转导通路中的蛋白激酶ERK1／2和Akt的表达和磷酸化水平并没有明显影响。结论辛伐他汀有显著的抗肿瘤作用，其作用机制可能与促进p21蛋白的表达有关，而p38和JNK也可能在辛伐他汀抑制肿瘤细胞的增殖过程中起着重要作用。