pDsRed-hAPJ质粒载体构建及在人HEK293细胞中的表达

背景:Apelin/APJ系统具有广泛的生理作用,但其在细胞内信号转导,特别是apelin受体的脱敏,内化、复敏降解等方面仍无一致性见解.目的:构建人apelin受体APJ与红色荧光蛋白pDsRED-express-C1融合的真核表达载体并检测其在人胚胎肾293细胞中的表达.方法:以质粒pcDNA3.1-hAPJ为模板,扩增人APJ,用EcoR I和BamH I分别酶切扩增的产物和pDsRED-express-C1载体,常规连接、转化感受态大肠杆菌TOP10.提取质粒,进行酶切鉴定,最后进行测序.将测序正确的重组载体用脂质体法转染,PI染色,激光共聚焦显微镜观察.结果与结论:PCR扩增出约1.2 kb的片段,与预期的人APJ大小序列相符,酶切结果显示重组质粒被切成2条片段,其中一条为pDsRED载体大小,另一条为目的片段大小.共聚焦显微观察显示APJ主要表达在细胞膜上.说明实验成功构建了pDsRed-hAPJ真核重组质粒,此表达载体为研究人APJ的亚细胞区域的位移、内吞定位提供了重要的工具.     

SV2A基因真核表达质粒构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建鼠突触囊泡蛋白2A(SV2A)基因的真核表达质粒,并瞬时转染至人胚肾细胞(HEK293T)中,对其表达进行鉴定。方法以APP/PS1双转基因小鼠海马组织的cDNA为模板,扩增得到长2239 bp的SV2A基因编码序列,将此序列插入到真核表达载体p3×Flag-CMV-10多克隆位点区域中,得到真核表达质粒p3×Flag-CMV-10-SV2A,转化后挑取单克隆菌落经双酶切鉴定后送公司测序,将构建成功的重组质粒转染至HEK293T细胞中,利用蛋白质印迹法(Western blot)检测SV2A基因的表达情况。结果成功构建p3×Flag-CMV-10-SV2A重组质粒,并在转染至HEK293T细胞后,验证了相应蛋白表达。结论利用分子克隆技术成功构建了p3×Flag-CMV-10-SV2A真核表达质粒并在HEK293T细胞中正确表达,为后续实验奠定了基础。     

TLR4在肾移植受者中的表达及其临床意义

目的:研究肾移植患者术后早期外周血单核细胞中Toll样受体4(TLR4)的表达改变及其与急性排异反应的关系.方法:首次接受肾移植手术受者60例,流式细胞术测定受者肾移植术前及术后第7、14、21天外周血单核细胞TLR4、CD80表达的百分率;根据肾移植术后两周内发生排斥与否将患者分为排斥组(13例)和非排异组(47例).20例健康成年志愿者标本为正常对照组.急性排异反应诊断标准依据临床表现、实验室检查、超声及移植肾穿刺活检等综合判断.结果:术前外周血单核细胞中TLR4、CD80即有表达,TLR4与对照组相比有统计学意义;术后1周两者表达到达顶峰,其后逐渐下降,排斥组外周血单核细胞TLR4、CD80表达峰值较肾功能正常组明显升高(P＜0.05),且持续时间较长.结论:TLR4、CD80在肾移植术后早期表达升高,并可增加肾移植术后急性排斥反应发生的风险.     

TLR4基因的shRNA对内毒素刺激下RAW264.7细胞TLR2表达的影响及机制

目的 观察针对Toll样受体4的发夹结构RNA(short hairpin RNA,shRNA)对内毒素刺激后小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞Toll样受体2表达的影响,并探讨其机制.方法 将携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)及shRNA克隆位点的质粒pEGFP/TLR4-siRNA,运用脂质体Lipofectamine2000转染至小鼠巨噬细胞系RAW264.7.转染24 h后予新霉素(G418)筛选获取稳定转染细胞株.然后将细胞分为三组:空白组(Blank group),未转染细胞LPS刺激组(LPS group)和稳定转染细胞LPS刺激组(LPS-TLR4-siRNA group),采用荧光定量PCR及流式细胞学方法检测各组细胞TLR2 mRNA和蛋白的表达,Western blot检测NF-κB p65的表达,同时用ELISA方法检测细胞分泌的TNF-α水平的变化.结果 将pEGFP/TLR4-siRNA转染至RAW264.7细胞后,增强型荧光蛋白的表达为(45.25±9.23)%.LPS-TLR4-siRNA组细胞的TLR2mRNA及蛋白的表达均明显低于LPS组(P＜0.05),同时NF-κB p65表达下调及分泌TNF-α的水平下降(P＜0.01).结论 针对TLR4 mRNA的shRNA能降低LPS刺激下的RAW204.7细胞TLB2的表达.     

TLR4在博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型肺组织中的表达

目的探讨Toll样受体4(TLR4)在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型肺组织中的表达。方法将60只小鼠随机分为两组:对照组(气管内注入生理盐水)和纤维化组(气管内注入博来霉素5 mg/kg)。处理后用实时定量PCR和免疫蛋白印迹法分别在7、14、21 d观察肺组织中TLR4m RNA和蛋白质的表达。此外,通过HE染色判断肺纤维化的程度。所有数据均用均数±标准差(sx±)表示,两组之间比较采用t检验,多组之间比较采用方差分析。结果 14、21 d纤维化组TLR4 m RNA表达明显高于对照组(P<0.05),且在第21天达到高峰。与对照组相比,纤维化组TLR4蛋白表达增加,21 d达高峰。结论在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中,TLR4的表达与炎症和肺纤维化均密切相关。     

脓毒症患者单个核细胞Toll样受体4表达与内毒素耐受的关系

目的观察革兰阴性菌感染所致脓毒症患者外周血单个核细胞Toll样受体4(TLR4)的表达与内毒素耐受之间的关系。方法以重症监护病房治疗的32例革兰阴性菌感染所致脓毒症患者为研究对象,另选20例为健康对照组。两组入选人员均晨起空腹采血,分离外周血单个核细胞,采用流式细胞仪技术检测单个核细胞表面TLR4的表达;另一部分外周血分离单个核细胞,并加入1μg/ml脂多糖(LPS)培养24h,同样进行流式细胞仪检测单个核细胞表面TLR4的表达。并应用放射免疫法测定血清及外周血单个核细胞培养液中TNF-α、IL-6的浓度。结果 (1)脓毒症组外周血单个核细胞表面TLR4表达、血清细胞因子TNF-α、IL-6浓度均明显高于健康对照组(均P<0.001)。(2)脓毒症组患者外周血单个核细胞经LPS刺激后培养上清液中TNF-α、IL-6的浓度显著低于健康对照组(均P<0.05),脓毒症组患者外周血单个核细胞经LPS刺激后TLR4表达较刺激前轻度下调,但刺激前后组间无统计学差异(P>0.05)。结论脓毒症患者外周血单个核细胞体外给予大剂量LPS刺激后可以产生内毒素耐受,但这种现象不能单纯用TLR4的表达下调解释,其可能存在更复杂的机制。内毒素耐受状况下,单个核细胞表现为促炎因子表达的明显下调。     

Toll样受体4在急性肺损伤中的作用

目的观察Toll样受体4(toll-like receptor 4,TLR4)基因突变型小鼠与野生型小鼠内毒素攻击致急性肺损伤(acute lung injury,ALI)的差异,分析TLR4在ALI中的作用。方法采用TLR4基因突变小鼠(C3H/HeJ品系,TLR4~(-/-)及野生型小鼠(CBA品系,TLR4~( / )),用内毒素攻击复制小鼠ALI模型,用显微病理及肺干湿重比(W/D)分析肺损伤程度,检测肺组织髓过氧化物酶(MPO)水平,探讨损伤差异的可能机制。结果用1,5 mg·kg~(-1)LPS溶液经尾静脉注射复制ALI模型,结果示TLR4突变小鼠肺组织大体及显微病理损伤较野生型小鼠减轻,同时肺组织水肿(W/D)亦较野生小鼠减轻,尤其是在大剂量(5mg·kg~(-1))时,差异有显著性[(4．08±0．1)vs．(4．55±0．2),n=10,t=12．71,P＜0．01]。突变小鼠肺组织PMN浸润水平较野生型低[MPO：1 mg·kg~(-1)组,(20．73±4．58)vs．(39．97±3．66),n=10,t=13．43,P＜0．01];5 mg·kg~(-1)组,[(24．0±3．94)vs．(48．5±4．07),n=10,t=15．33,P＜0．01],且两者均较假手术组高。结论TLR4可能通过介导中性粒细胞肺内聚集而导致ALI的发生发展。     

Toll样受体4在人胰腺导管腺癌组织中的表达及其临床意义

目的：探讨人胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC）组织中Toll样受体4（Toll-like receptor 4,TLR4）蛋白的表达及其临床意义.方法：收集2009年1月-12月在复旦大学附属中山医院行胰腺手术切除的6例非糖尿病（DM）的PDAC患者、6例PDAC合并DM患者的胰腺组织标本,采用免疫组化法检测TLR4蛋白在胰腺组织中的表达,并分析TLR4蛋白的表达与临床病理特征的关系.结果：非DM的PDAC患者的癌旁组织中TLR4蛋白的阳性表达率（15.8％）,与PDAC合并DM患者的癌旁组织中TLR4蛋白的阳性表达率（25.4％）,差异有统计学意义（P＜0.05）.PDAC患者癌组织中TLR4蛋白的表达较癌旁组织明显升高（67.6％比29.4％,P＜0.05）.TLR4蛋白阳性表达的PDAC患者其肿瘤最大径明显大于TLR4蛋白阴性表达的PDAC患者[（39.12±15.92）mm比（27.25±12.82）mm,P＜0.05].结论：TLR4蛋白高表达与DM及PDAC的发生、发展密切相关,且可能有促进肿瘤生长的作用.     

冠心病患者外周单核细胞TLR4表达及其与血浆P选择素的相关性

目的探讨冠心病（CHD）患者外周血单核细胞Toll样受体4（TLR4）表达及其与血浆P选择素（P-selectin）水平的相关性和临床意义。方法选择研究对象139例,其中稳定性心绞痛（SAP）39例、不稳定性心绞痛（UAP）66例、急性心肌梗死（AMI）34例、正常对照组30例,比较各组间TLR4、P-selectin表达的差异。采用流式细胞术检测外周血单核细胞TLR4表达,采用酶联免疫吸附试验检测血浆P选择素水平。结果对照组、SAP组、UAP组与AMI组外周血单核细胞TLR4的表达和血浆P选择素水平依次增高;各组表达量均高于对照组（P〈0.05）,TLR4表达与血浆P选择素各组间两两比较差异均有统计学意义（P〈0.05）,TLR4与血浆P选择素水平呈正相关（P〈0.05）。结论冠心病患者TLR4表达上调,促进炎症前体细胞因子的分泌,提示TLR4及其介导的炎性反应与冠心病的发生、发展有关;冠心病患者P-selectin水平升高,客观反映病情的严重性,预示心血管事件的危险性增加。     

类风湿性关节炎患者早期外周血单个核细胞Toll样受体2、4表达及意义

目的探讨类风湿性关节炎(RA)早期患者外周血单个核细胞(PBMC)Toll样受体(TLR)2、TLR4对其配体双糖链蛋白多糖(BGN)、脂多糖(LPS)的刺激反应性,阐明PBMC TLR2、TLR4在RA疾病早期中的作用。方法采用流式细胞术、实时荧光定量逆转录(RT)-聚合酶链反应(PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)分别检测BGN和LPS刺激前后,RA组和健康对照组外周血CD14+单核细胞TLR4+细胞频率、PBMC TLR2 mRNA和TLR4mRNA及上清液白细胞介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量变化。结果 RA早期患者TLR2 mRNA明显升高、TLR4 mRNA下降(P<0.01);经LPS刺激后,RA患者TLR4 mRNA升高3.50倍,而健康对照组下降到0.11倍;LPS和BGN促进了各组PBMC产生IL-6、TNFα,但RA早期患者组上升的倍数明显高于健康对照组。结论 PBMC TLR2、TLR4参与早期RA的发生、发展。     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景:阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于(-淀粉样多肽的异常.目的:构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株.方法:采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞(SH-SY5Y)的总cDNA中,扩增出约1.0 kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达.结果与结论:人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株.     

真核表达质粒pcDNA3.1-tau的构建及在HEK293细胞中的稳定表达

背景：阿尔茨海默病患者的痴呆症状严重程度与脑组织中的神经原纤维缠结数量呈正相关,神经原纤维缠结的主要蛋白成分为过度磷酸化的蛋白tau,tau蛋白的病理改变出现在痴呆症状之前并独立于β-淀粉样多肽的异常。目的：构建tau基因的真核表达质粒,建立稳定表达tau的稳转细胞株。方法：采用反转录-聚合酶链反应方法,从反转录反应合成的人成神经瘤细胞（SH-SY5Y）的总cDNA中,扩增出约1.0kb的tau cDNA片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后定向克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,用限制性内切酶酶切分析和DNA序列分析鉴定重组质粒;用脂质体介导法将质粒转染入培养的人胚肾细胞,并利用G418进行稳定表达tau的稳转细胞株的筛选,免疫印迹和免疫荧光细胞化学方法检测tau基因的表达。结果与结论：人tau cDNA已克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中;免疫印迹和免疫荧光细胞化学结果显示人tau基因在人胚肾细胞中获得表达,tau蛋白表达的阳性信号主要位于细胞胞质,说明成功构建了pcDNA3.1-tau的真核表达质粒,建立了稳定表达tau的稳转细胞株。     

人Toll样受体4胞浆内段融合蛋白表达载体的构建与表达

目的：构建人Toll样受体4胞浆内段（hTLR4C)His融合蛋白表达载体并在原核表达与纯化，以研究其功能及鉴定与其相互作用的蛋白。方法：采用PCR方法扩增hTLR4基因编码区的胞浆内段，并将其重组于pET-DsbA2.0载体中。重组质粒经酶切、序列鉴定分析后，转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果：用异丙基β－D硫代半乳糖（IPTG）诱导产生hTLR4胞浆内段的His-DsbA融合蛋白，继而纯化获得了分子量约42kd的融合蛋白。结论：本研究成功地构建了hTLR4胞浆内段融合蛋白表达载体并获得高效表达，为进一步研究提供了重要的实验材料。     

Toll样受体4小干扰RNA表达载体的构建及鉴定筛选

目的构建并筛选到能有效抑制TLR4基因表达的小干扰RNA表达载体,用于研究TLR4基因功能。方法 RNA干扰采用体外构建小干扰RNA表达载体法,将构建好的表达载体转染单核细胞株,分别用流式细胞术和实时荧光定量RT-PCR法检测TLR4蛋白和mRNA表达变化,筛选抑制效率最高的小干扰RNA表达载体。结果成功构建了TLR4小干扰RNA表达载体,并经电泳及测序证实;编号为S8-1的载体转染入细胞后,TLR4阳性率为27.03%,显著低于对照组的35.12%;流式细胞术和实时荧光定量RT-PCR法检测均证实编号为S8-1小干扰RNA表达载体的抑制效率最高,可用于后续实验。结论本实验所构建的编号为S8-1小干扰RNA表达载体可有效抑制TLR4基因表达,小干扰RNA表达载体法能够抑制体外培养细胞株TLR4的表达,可用于研究TLR4基因功能。     

趋化因子受体CXCR4 miRNA真核表达载体的构建

目的构建趋化因子受体4（CXCR4）的特异RNA干扰载体。方法在GenBank数据库查询CXCR4基因的登陆号为NM-003467。使用Invitrogen公司的在线设计软件Invitrogen’sRNAi Designer,设计miR RNAi,选择713这个位点设计成相应的Oligo DNA,退火DNA oligos生成双链oligos,应用T4DNA连接酶连接双链oligos与表达载体pcDNA^TM6．2-GW／EmGFP-miR。酶切鉴定和测序鉴定。结果合成的基因序列完全正确并成功克隆到真核表达载体上。结论CXCR4miRNA真核表达载体构建成功,可作为进一步研究该基因的功能和探索肿瘤的基因治疗的工具。     

小鼠感染肺炎衣原体后肺组织TLR2、TLR4基因表达的变化及意义

目的通过建立小鼠肺炎衣原体感染的模型,探讨小鼠感染肺炎衣原体后肺脏组织Toll样受体(TLR)2、4mRNA表达及意义。方法Icr雄性小鼠60只,随机分为实验组、对照组,实验组鼻内接种肺炎衣原体,对照组接种二磷酸蔗糖(2sp)缓冲液,再分别按预定的处死时间1、3、5、7、14d各分为5小组,取肺脏组织。应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)半定量方法检测肺组织TLR2mRNA、TLR4mRNA的表达变化。结果小鼠感染肺炎衣原体后,引起TLR表达明显变化。其中TLR2mRNA表达水平在3、5、7、14d其密度值(0.849±0.107、0.981±0.104、0.926±0.116、0.905±0.046)显著高于对照组(0.375±0.149、0.340±0.069、0.314±0.074、0.302±0.010,P<0.01),并在第5天达到高峰;而TLR4mRNA表达水平在第1、3、5、7、14天均低于对照组,但无明显的统计学意义。结论肺炎衣原体感染与TLR的变化有密切的联系,主要在TLR2上表达变化,TLR的变化增强了机体非特异免疫能力,并随着肺炎衣原体感染程度的加重与减轻,TLR2mRNA的表达变化上调或下降。     

真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B的构建及在293T细胞中的表达

[摘要] 目的: 构建人基因PDGF-B真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B,并在293T细胞中进行瞬间表达。方法: 采用PCR方法从购自美国典型培养物保藏中心含有PDGF-B基因全长cDAN序列的质粒中扩增出PDGF-B的cDAN片段，并与真核表达载体pIRES-EGFP连接，双酶切鉴定，最后采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000将pIRES-EGFP-PDGF-B转入293T细胞中，利用荧光显微镜和Western blotting进行表达鉴定。结果: 成功克隆了PDGF-B基因全长cDAN，真核表达载体pIRES-EGFP-PDGF-B被成功构建，双酶切鉴定正确，表达载体能在293T细胞内正确地表达成熟的PDGF-B蛋白，并可分泌到细胞外。结论: 成功构建了pIRES-EGFP-PDGF-B真核表达载体，为进一步利用PDGF-B对脊髓损伤进行基因治疗奠定基础。     

重组质粒pEGFP-Brn-4的构建与鉴定

目的构建神经同源盒基因Brn-4真核表达重组质粒。方法从新生SD大鼠脑组织提取总RNA,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）的方法扩增编码鼠Brn-4的基因片段,应用基因重组技术将鼠Brn-4基因片段克隆到真核表达载体pEGFP-C2中,经BamHI、EcoRⅠ双酶切和单酶切证实所构建的载体。结果 RT-PCR方法获得鼠Brn-4的基因片段,限制性内切酶酶切分析和PCR法鉴定表明为正确重组子。结论新构建的真核表达重组质粒pEGFP-Brn-4通过鉴定,结构正确,为后续研究在神经干细胞中表达及其体内研究奠定了基础。     

弓形虫致密颗粒蛋白GRA4真核表达质粒的构建

目的构建弓形虫致密颗粒蛋白GRA4的真核表达重组质粒。方法设计合成GRA4引物,运用PCR方法扩增其基因片段,经克隆至pMD18-T载体后,亚克隆至真核表达质粒pcDNA3.1(-)而构建重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4。结果PCR扩增GRA4基因序列正确,构建的重组表达质粒pcDNA3.1-GRA4经PCR、EcoRⅠ/HindⅢ双酶切和测序鉴定正确。结论成功获得真核表达重组质粒pcDNA3.1-GRA4,为进一步研究弓形虫疫苗的免疫保护性奠定基础。