体外定向诱导人骨髓间质干细胞分化为成骨细胞的研究

目的:建立体外定向诱导成人骨髓间质干细胞(MSC)分化为成骨细胞的模型。方法:采用Ficoll-Paque淋巴细胞分离液分离成人MSC,体外扩增,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达,应用地塞米松、β-甘油磷酸钠、vitaminC定向诱导MSC分化为成骨细胞,检测碱性磷酸酶(AP)活性、钙沉积、骨桥蛋白的表达鉴定成骨细胞,比较P3和P10代MSC成骨分化的能力。结果:MSC在体外扩增原代可获得(5-6)×10⁵个细胞,10代可获得2×10¹⁰个细胞。流式细胞仪检测结果显示CD29、CD44、CD59、CD105、CD166表达阳性,CD11a、CD14、CD33、CD34、CD45、CD38、CD80、CD86、CD117表达为阴性。加入成骨诱导剂,细胞形态发生变化,AP活性增强,骨桥蛋白表达阳性,钙沉积逐渐出现。P3和P10代的MSC均有良好的分化为成骨细胞的能力。结论:成人骨髓间质干细胞在体外可分化为成骨细胞。     

人骨髓间质干细胞体外扩增和向成骨细胞分化的实验研究

骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在体外不仅可分化为间质类细胞，而且可以分化为非间质细胞。本研究探讨人骨髓间质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件。利用密度为1．073g/ml的Percoll分离骨髓的单个核细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增MSCs，细胞纯度可达95％左右。取第二代和第三代的MSCs，以含有不同浓度的抗坏血酸、β－磷酸甘油、地塞米松的诱导培养基向成骨细胞诱导，诱导向的细胞呈现典型的成骨细胞样改变，免疫组化技术显示其I型胶原染色阳性，ALP染色阳性，表明MSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜力。     

肌糖蛋白TN-C促进人骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

目的 研究肌糖蛋白(Tenascin-c,TN-C)对人骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的诱导作用,为TN-C在骨折愈合中的应用提供理论依据.方法 用全骨髓培养法获取人骨髓基质干细胞(hBMSCs),第6～10代的细胞用于本研究.体外培养的hBMSCs用自行制备的不同浓度重组TN-C (rTN-C)蛋白处理(0、1、10、50和100 nmol/L),于处理后不同时间进行细胞茜素红染色,检测细胞的矿化;或于不同时间收集细胞总RNA进行RT-PCR检测碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN) mRNA水平的变化;同时利用ALP检测试剂盒和骨钙素放射性免疫试剂盒分别检测ALP活性和细胞培养基中OCN含量.结果 1)rTN-C处理hBMSCs 10 d后,rTN-C呈剂量依赖性促进成骨细胞的矿化(P＜0.05);2) rTN-C处理hBMSCs后,细胞ALP活性及培养基上清中OCN含量显著高于未处理对照组(P＜0.05).结论 肌糖蛋白对人BMSC向成骨细胞的分化有一定的促进作用.     

Nucleostemin在大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化中的研究

目的 探讨Nucleostemin(NS)在大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化中的机制及作用.方法 取4～6周龄雄性SD大鼠两侧股骨、胫骨骨髓基质细胞,原代及传代培养.取第3代骨髓间充质干细胞分别用普通和矿化培养基培养,通过相差倒置显微镜观察细胞生长、MTT法检测细胞增殖、碱性磷酸酶和茜素红钙染色了解成骨活性.免疫组化SABC法及免疫荧光法检测NS在细胞中的表达情况,比较NS分别在普通培养基和成骨细胞诱导培养基作用下的表达情况.结果 大鼠骨髓间充质干细胞在矿化培养基诱导下其NS的表达较普通培养基培养下的表达明显减弱,且呈时间依赖性衰减.成骨细胞的NS表达则为阴性.在矿化液作用下,骨髓间充质干细胞可诱导为成骨细胞.MTT显示矿化液培养细胞生长潜伏期长,对数生长期较对照组延长.结论 NS作为核干细胞因子,在干细胞中和某些肿瘤细胞中表达丰富.细胞分化后,其表达明显减少.因此,NS很可能作为大鼠基质干细胞是否具有潜在分化能力的标志性因子.     

兔骨髓间充质干细胞定向诱导分化为脂肪细胞及成骨细胞的研究

用密度梯度离心和贴壁法分离和纯化兔骨髓间充干细胞，建立诱导兔MSCs向脂肪细胞及成骨细胞表型转化的方法及条件。在成脂诱导剂或成骨诱导剂作用下，对原代和第2代兔MSCs进行成脂和成骨诱导培养，并鉴定成脂及成骨表型。结果表明：原代及第2代兔MSCs均有一定的成脂、成骨能力，且第2代细胞的分化能力较原代低。在诱导培养条件下，原代及第2代兔MSCs均能分化，成脂诱导21d，75％的兔MSCs转化为脂肪细胞；成骨诱导21d，75％的兔MSCs转化为成骨细胞。兔MSCs在适当的诱导条件下可快速分化为脂肪细胞或成骨细胞。     

骨膜提取物诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为类成骨细胞

目的 应用骨膜提取物诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为类成骨细胞,为骨组织_丁程提供充足的种子细胞.方法 切取小鼠颅骨骨膜提取物,诱导小鼠骨髓间充质干细胞.诱导分化后的细胞采用ALP染色、RT-PCR、蛋白印迹技术进行检测.结果 形态学观察显示,分化后的MSCs细胞形态从长梭形变成三角形、多角形或立方形;ALP活性...     

不同浓度的骨碎补总黄酮对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响

目的:通过在体外条件下对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)实施干预诱导,探寻骨碎补总黄酮对BMSCs的成骨诱导分化能力及不同浓度下可能存在的剂量效应关系。方法:应用全骨髓贴壁培养法对BMSCs进行分离、纯化,并通过流式细胞术对BMSCs进行鉴定,再通过设立含不同浓度骨碎补总黄酮条件培养基,分组对BMSCs进行干预,观察各组7d和14d碱性磷酸酶(ALP)的表达,同时通过ALP染色和矿化结节染色进行定性分析。结果:用全骨髓贴壁法成功分离获得了均一稳定的BMSCs,各浓度骨碎补总黄酮作用BMSCs7d和14d后,诱导不同程度的ALP表达,经10-5g/L骨碎补总黄酮诱导,ALP染色及矿化结节染色均阳性。结论:低浓度骨碎补总黄酮能促进BMSCs向成骨细胞分化,其ALP生成量随着骨碎补总黄酮浓度的降低大致呈增加趋势。     

体外培养成骨细胞对自体骨髓间充质干细胞定向成骨分化的影响

目的观察体外培养成骨细胞对自体骨髓间充质干细胞（BMSC）增殖和定向成骨分化的影响．探讨此诱导方法作为骨组织工程种子细胞来源方法的可行性。方法应用密度梯度离心联合贴壁筛选法从兔股骨骨髓中分离、纯化BMSC．取第3代BMSC常规培养设为空白对照组,利用含有钙化诱导剂的DMEM培养基诱导培养第3代BMSC．设为钙化对照组。取第3代成骨细胞,1：1的比例和第3代BMSC共同培养．设为实验组。碱性磷酸酶（ALP）染色及钙结节染色鉴定诱导结果．ALP定量测定观察共同培养中成骨细胞对BMSC诱导影响。总蛋白定量测定观测诱导成骨细胞的分化活性．结果成骨细胞与BMSC共同培养24h后．在倒置光学显微镜下可见两种细胞形态混杂生长．共同培养5d后．细胞形态趋于一致,多呈长梭形。诱导培养5d后．实验组与钙化对照组ALP染色均为阳性。诱导培养21d．两组钙结节茜素红染色均呈阳性．而BMSC空白对照组并未见钙结节形成。ALP定量测定,实验组于3、5、7、9d均低于钙化对照组,且差异均具有统计学意义。实验组与空白对照组ALP定量测定,在4个时间段差异也均具有统计学意义。总蛋白定量测定显示实验组于第3天．A值高于钙化对照组,差异具有显著统计学意义（P〈0．01）,而第5天、第7天、第9天时却低于钙化对照组．差异具有显著统计学意义（P〈0．01）。实验组于各时间段均高于空白对照组．差异亦具有统计学意义。结论成骨细胞与BMSC共同培养应用于BMSC的成骨诱导．从诱导效率和诱导后成骨细胞的分化活性方面．都能证实该共同培养方法的有效性。但与钙化诱导方法相比．共同培养的诱导效果差于钙化诱导方法。     

PKH26标记大鼠骨髓间质干细胞的实验研究

目的建立PKH26标记大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）的方法，并探讨标记MSCs的基本生物学活性。方法大鼠MSCs按PKH26标记程序进行标记后培养，采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析仪等观察细胞生长状态和荧光标记活性变化；应用RT-PCR检测标记后MSCs的GAPDH、nucleostemin及Bmi-1基因的表达；选用碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色及骨形成蛋白3（BMP3）基因表达分析等技术，观察标记后MSCs体外分化成骨细胞的特性。结果PKH26标记后细胞呈红色荧光，荧光的强度随着PKH26浓度的增加而递增，并与传代时间和代数相关；标记后细胞生长状态良好，基本生长特性如传代培养和生长曲线无明显改变；细胞GAPDH、nucleostemin及Bmi-1基因表达未见改变；标记MSCs诱导后ALP、Von Kossa染色阳性，呈现典型的成骨细胞形态和生物学特征，并表达BMP3基因。结论PKH26可稳定标记大鼠骨髓MSCs并能传代培养，标记后细胞形态、生长活力及多向分化潜能等无明显影响，该技术可用于追踪MSCs转归、可塑性及干细胞移植方面的实验研究。     

骨髓间质干细胞体外分化为成骨细胞的实验研究

建立猪骨髓间质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)体外分离培养方法。对猪MSCs体外分化为成骨细胞的能力进行研究。抽取猪骨髓 ,体外培养MSCs。取第二代MSCs ,以含有不同浓度的抗坏血酸、β -磷酸甘油、地塞米松及碱性成纤维细胞生长因子等条件培养基进行成骨细胞诱导分化。通过细胞形态变化 ,碱性磷酸酶染色及钙盐沉积对成骨细胞进行鉴定。结果表明MSC细胞形态由长梭形向多边形转变 ,ALP染色阳性 ,VonKossa染色阳性 ,经体外诱导分化后呈典型的成骨细胞样改变。猪骨髓MSCs可在体外长期、稳定培养 ,具有向成骨细胞分化的潜能 ,可以为骨组织工程研究提供较理想的细胞来源和动物模型。     

雷奈酸锶通过上调骨形态发生蛋白2的表达促进骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞

目的: 探讨雷奈酸锶(strontium ranelate,Sr)是否可以通过上调骨形态发生蛋白 2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)的表达而促进大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化为成骨细胞。方法: 对大鼠BMSCs进行分离、纯化、培养及向成骨细胞的定向诱导分化,并在诱导培养时,根据实验目的加入不同浓度Sr以及BMP-2的拮抗剂noggin。用酶标法检测成骨细胞分化和功能成熟的早期标志物——碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的变化,用茜素红染色检测细胞钙化水平,用Western blotting法检测BMP-2蛋白的表达水平。结果: 应用0.1~7 mmol/L Sr处理细胞7 d均可使细胞ALP活性显著增加,其中浓度为3 mmol/L时效果最显著;应用3 mmol/L Sr处理细胞21 d可使细胞钙化结节明显增多;应用0.1~7 mmol/L Sr处理细胞7 d后细胞内BMP-2蛋白水平明显增高;在Sr处理BMSCs前,应用BMP-2拮抗剂noggin预处理细胞2 h不仅抑制Sr对BMP-2表达的上调作用,还拮抗Sr对ALP活性及钙化结节形成的促进作用。结论: 上调BMP-2的表达可能是Sr促进大鼠BMSCs分化为成骨细胞的作用机制之一。     

小鼠骨髓多能成体祖细胞的分离、培养及体外诱导分化为胰岛素分泌细胞的研究

目的：探讨培养骨髓多能成体祖细胞的条件和生物学特性及其向胰岛素分泌细胞分化的可能性。 方法： 采用文献报道的条件培养液培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，观察其细胞形态、生长情况、细胞表面标志及mRNA水平，检测其oct-4基因表达，并以含胰高糖素多肽-1的无血清培养液诱导分化细胞，基因水平检测与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结果： 小鼠骨髓多能成体祖细胞类圆形，细胞核大，胞质少；细胞增殖能力尚可；细胞表面CD13+、CD44-、CD45-、MHCⅡ-；有oct-4基因表达；诱导分化后，可见与胰岛素分泌细胞有关的基因表达。 结论： 成功培养小鼠骨髓多能成体祖细胞，具有与文献报道类似的生物学特征；有被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性。     

微重力对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种多能成体于细胞,是组织工程重要的种子细胞来源之一.微重力对BMSCs成骨分化具有抑制作用,可使骨量减少和骨微结构改变,从而导致骨质疏松症.这一过程受到多条信号通路的调控,如MAPK信号通路、Notch信号通路和Wnt/β-catenin信号通路等,它们协同调节微重力下BMSCs向成骨细胞方向的分化.研究微重力对BMSCs成骨分化的影响,可以阐明骨质流失机理,为相关疾病的治疗提供新的靶点,促进我国太空宇航事业的发展.     

体外培养诱导大鼠骨髓间质干细胞分化为肌样细胞的实验研究

目的:体外培养并诱导大鼠骨髓间质干细胞(MSCs)分化为肌样细胞。方法:采用常规技术对SD鼠MSCs进行体外培养传代、鉴定、诱导分化和免疫组化、透射电镜检测分析。结果:流式细胞仪检测, 细胞表达CD29和CD44, 不表达CD11b和CD45;经一定浓度5-氮杂胞苷和两性霉素B诱导分化后细胞desmin和myoglobin染色阳性;电镜观察肌样细胞胞浆靠胞膜缘可见无细胞器的条状肌丝区带。结论:传代贴壁生长的梭形细胞为MSCs。MSCs可能具有表达肌细胞的特异性启动或分化调控基因;5-氮胞苷等化合物可使DNA的胞嘧啶去甲基化, 从而诱导MSCs向肌源性细胞分化。临床有运用MSCs治疗肌萎缩性疾病的前景。     

低氧影响干细胞成骨分化的研究进展

氧稳态是机体或细胞正常功能所必需的, 低氧是人正常发育的一个重要的生理因素,并参与许多疾病的发生、发展.在骨发育过程中, 组织和细胞缺氧是经常存在的.体内生长板软骨增殖区氧浓度仅为 2%-5%, 肥大区氧浓度为 0.15%-1%[1].机体损伤后,由于损伤部位血流中断或血肿形成,造成局部氧分压降低.在骨折血流中断处,中央部位氧分压甚至降低到0%-2%[2,3].骨折修复需要机体在骨折部位重建血运,以便吸收损伤组织和转运营养物质.     

大鼠心肌匀浆上清液对骨髓间质干细胞诱导分化的影响

目的：探讨心肌匀浆上清液对大鼠骨髓间质干细胞（MSCs）诱导分化的影响。 方法： 体外分离培养大鼠MSCs，检测纯度。于原代培养第3 d加入自体心肌匀浆上清液持续作用1周。3周后，观察细胞形态，采用免疫细胞化学检测肌球蛋白重链和心肌特异性肌钙蛋白-T，RT-PCR方法检测Nkx2.5、α-MHC和ANP基因的表达。 结果： 大鼠MSCs经诱导后，表达肌球蛋白重链、心肌特异性肌钙蛋白-T和Nkx2.5、α-MHC基因，但未表达ANP基因，也未观察到肌管和闰盘样结构。 结论： 心肌匀浆上清液对MSCs具有定向诱导分化作用，但诱导不完全，具体机制仍需深入研究。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞的实验研究

目的通过体外诱导研究大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化,为心衰的干细胞移植治疗提供实验依据。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,采用5-氮杂胞苷定向诱导,通过形态学、免疫细胞化学及磷钨酸苏木素染色(PTAH)鉴定。结果诱导后细胞以梭形、柱状为主;部分细胞有分支,核一个、卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;诱导24h后培养2周,Sarcomeric Actin和Connexin-43表达较弱,以后表达逐渐增强;诱导细胞PTAH阳性。结论骨髓间充质干细胞能在体外被诱导分化为心肌样细胞,有望成为心衰时干细胞移植治疗的理想细胞材料。     

骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的研究

目的目的研究大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮杂胞苷诱导在体外转化为心肌样细胞的情况,为心衰的干细胞移植治疗提供基础。方法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,用不同浓度5-氮杂胞苷诱导不同时间,通过形态学、PAS反应、免疫细胞化学等鉴定。结果诱导细胞以梭形、柱状为主,部分细胞有分支,核一个、卵圆形、居中,类似心肌细胞形态;PAS反应阳性;诱导后培养2周,Sarcomeric Actin和Connexin-43表达较弱,以后逐渐增强。以10×10-6mol/L5-氮杂胞苷诱导24h效果最佳。结论骨髓间充质干细胞在5-氮杂胞苷诱导下可定向分化为心肌样细胞,是自体心肌细胞的一种良好供体来源。     

诱导人卵黄囊间质干细胞向成骨细胞及神经细胞定向分化

目的：分离纯化及体外定向诱导人卵黄囊间质干细胞 (hYS-MSC)分化为成骨细胞及神经细胞。方法： 卵黄囊细胞经贴壁培养、传代纯化得到hYS-MSC，检测其表面抗原表达、对其进行核型分析、细胞周期检测并测定AKP活性；采用地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C作成骨诱导剂、β-巯基乙醇或复方丹参注射液作为神经诱导剂诱导hYS-MSC向成骨细胞及神经细胞定向分化。组织化学方法作成骨检测；免疫组化方法检测NSE、NF及GFAP在经神经诱导hYS-MSC中的表达。结果： hYS-MSC易于纯化，在培养过程中保持正常核型，具有较大增殖能力。hYS-MSC CD29、CD44、CD166及CD105表达阳性, CD34、CD45和CD86为阴性；AKP弱阳性。hYS-MSC经成骨诱导AKP强阳性，诱导两周后形成钙盐沉积形成的矿化区。hYS-MSC经神经诱导可见NSE、NF或GFAP阳性细胞，符合神经元及胶质细胞的生物学特征。结论： hYS-MSC在体外培养过程中具有较大增殖能力并保持正常核型，与成体MSC表型一致，在体外可以诱导分化为成骨细胞、神经元及胶质细胞。