肠出血型大肠埃希菌免疫PCR检测方法的建立

目的建立检测肠出血型大肠埃希菌O157：H7的免疫PCR技术,确定该方法的灵敏度和特异性。方法链亲和素桥联生物素化的二抗和双链DNA指示分子,构建桥联系统,进而建立免疫PCR技术,通过PCR扩增指示分子检测O157：H7。结果免疫-PCR技术最少可检测到10 CFU/ml的纯培养菌,灵敏度较ELISA提高103倍,非O157：H7菌株检测结果均为阴性。结论免疫-PCR技术具有较高的灵敏度和特异性,操作简便、快速,可作为肠出血型大肠埃希菌O157：H7的检测方法。     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌影生物学活性的初步研究

目的制备肠出血性大肠埃希菌O157∶H7细菌菌影,在细胞及动物水平对其生物学活性进行初步评价。方法将包含噬菌体phiX174裂解基因E的重组质粒pLSE转化肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 EDL933及大肠埃希菌DH5α,42℃诱导制备菌影。利用间接免疫荧光实验观察菌影主要抗原结构,并利用电镜观察菌影对Hep-2细胞的黏附。将菌影免疫小鼠后,采用间接ELISA法检测小鼠特异性抗体,并通过小鼠攻毒实验考察菌影的保护效果。结果成功构建了重组质粒pLSE,制备出O157∶H7及DH5α菌影。O157∶H7菌影保留了病原菌的主要外膜抗原,能紧密黏附细胞Hep-2但并不侵入细胞。O157∶H7菌影免疫雄性BALB/c小鼠诱导特异性IgG抗体的产生。攻击试验结果显示小鼠对致死剂量O157∶H7 EDL933强毒株的保护率达到80%。结论 O157∶H7菌影的成功制备及生物学活性的初步析为研制O157∶H7菌影疫苗奠定了基础。     

检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7的环介导等温扩增和PCR法比较

目的建立基于环介导等温扩增(LAMP)技术的肠出血性大肠埃希菌(EHEC)O157:H7快速简便检测方法,并与PCR进行比较。方法针对EHEC O157:H7保守的rfbE基因序列,设计特异性引物,建立LAMP和PCR检测技术并优化其反应条件,比较这两种检测方法的灵敏度、特异性和对实际样品的检测结果。结果成功建立了LAMP和PCR检测体系,灵敏度检测结果显示,LAMP检测限低至10 cfu/ml,PCR检测限为102cfu/ml,LAMP检测灵敏度高于PCR;对39株近源菌进行检测,结果显示,LAMP法仅7株EHEC O157:H7得到阳性结果,非EHEC O157:H7菌株均为阴性,PCR产物则出现非特异性条带,LAMP法特异性比PCR法高。对于32份猪肉样品的检测,LAMP和PCR与常规检测结果一致,3份样品检测阳性。结论 LAMP检测技术的特异性和灵敏度较PCR高,并且操作简便、检测成本低,耗时短,更有望发展成为快速准确检测EHEC O157:H7的有效手段。     

4种感染性腹泻病原菌免疫磁珠-多重PCR快速检测体系的建立

目的基于免疫磁珠分离及多重PCR技术建立出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的快速检测体系。方法根据出血性大肠埃希菌uidA、福氏志贺菌ipaH、空肠弯曲菌hipo及副溶血弧菌tlh的基因序列设计特异性引物,优化免疫磁珠分离过程及多重PCR扩增中的各个环节,建立上述4种病原菌同步快速扩增体系,并鉴定该体系特异性、敏感性。结果发现Mg2+浓度对该体系影响最大,在Mg2+浓度为4 mmol/L时扩增效率最高;该体系对4种病原菌的敏感性分别为:出血性大肠埃希菌2.7×10 cfu/ml、福氏志贺菌6.4×10 cfu/ml、空肠弯曲菌7.6×10 cfu/ml、副溶血弧菌3.6×10 cfu/ml。结论建立了出血性大肠埃希菌、福氏志贺菌、空肠弯曲菌、副溶血弧菌的免疫磁珠-多重PCR快速检测体系,该体系特异性及敏感性高,检测过程简单,结果稳定,可应用于临床诊断及食品卫生监管中致病菌的快速检测。     

Initial research on bioactive of EHEC O157:H7 bacterial ghosts

目的 制备肠出血性大肠埃希菌 O157:H7细菌菌影,在细胞及动物水平对其生物学活性进行初步评价.方法 将包含噬菌体phiX174裂解基因E的重组质粒pLSE转化肠出血性大肠埃希菌O157:H7 EDL933及大肠埃希菌DH5α,42℃诱导制备菌影.利用间接免疫荧光实验观察菌影主要抗原结构,并利用电镜观察菌影对Hep-2细胞的黏附.将菌影免疫小鼠后,采用间接ELISA法检测小鼠特异性抗体,并通过小鼠攻毒实验考察菌影的保护效果.结果 成功构建了重组质粒pLSE,制备出O157:H7及DH5α菌影.O157:H7菌影保留了病原菌的主要外膜抗原,能紧密黏附细胞Hep-2但并不侵入细胞.O157:H7菌影免疫雄性BALB/c小鼠诱导特异性IgG抗体的产生.攻击试验结果显示小鼠对致死剂量O157:H7 EDL933强毒株的保护率达到80%.结论 O157:H7菌影的成功制备及生物学活性的初步析为研制O157:H7菌影疫苗奠定了基础.     

徐州市1999年大肠埃希菌O_(157)∶H_7动物发病及带菌情况调查

目的　了解徐州市不同地区大肠埃希菌O157∶H7出血性肠炎流行季节动物的发病及带菌率。方法　在不同流行强度的地区设调查点 ,调查猪、鸡、牛、羊的发病情况 ;并采集其粪便 ,用免疫磁珠法进行病原分离培养。结果　 6个调查点共调查动物 5 65头 ,发病 3 5头 ,罹患率 6 19% ;共采集猪、鸡、牛、羊等动物粪便标本 90 1份 ,分离出大肠埃希菌O157∶H713 0株 ,总带菌率 14 4% ,其中以牛、羊带菌率较高 ,分别为 2 1 9%、 19 4%。结论　在大肠埃希菌O157∶H7出血性肠炎流行季节各种动物都有不同比例发病 ,不同地区的动物带菌率也不尽相同。提示加强动物大肠埃希菌O157∶H7发病率及带菌率的调查对疫情分析与疾病控制有重要意义。     

网状分枝扩增技术快速检测大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒素大肠埃希菌

目的：建立一种简便、快速、灵敏和特异的检测食品和临床标本中大肠埃希菌O157∶H7及其他产志贺样毒大肠埃希菌(STEC)的方法。方法：设计并合成了检测志贺毒素2(stx2)基因特异的环形探针和捕获探针，确定网状分枝扩增方法（RAM）的灵敏度；含有stx2基因的不同血清型的菌株包括O46∶H38、O22∶H8 、O111∶NM，用于RAM特异度的测定。用RAM检测所有分离的菌株，并进一步对瞬时RAM进行研究。结果：RAM最低能检测10个拷贝的stx2合成靶基因和临床分离的菌株，表明RAM与PCR具有一样的灵敏度。特异度的测定结果表明不同血清型的大肠埃希菌均为stx2阳性，而非致病性大肠埃希菌ATCC23716则为阴性。在32株菌株中，28株细菌含有stx2基因，其余则为阴性， 与PCR检测结果100%一致。瞬时RAM结果也表明最低能检测10个细菌，检测信号的出现依赖于样品的浓度。 结论：RAM的简便和等温扩增特点可替代PCR检测各种标本中大肠埃希菌O157∶H7和STEC。     

长沙市岳麓地区大肠埃希菌O157∶H7宿主动物带菌情况调查

目的:调查湖南省长沙市岳麓地区不同乡镇大肠埃希菌O157:H7宿主动物带菌情况.方法:2011年5月采集长沙市岳麓地区境内鸡、鸭、猪、牛等家畜家禽的粪便标本307份,按国标常规培养法检测大肠埃希菌O157:H7.并采用PCR对分离菌株O157的抗原特异性基因rfb EO157进行检测.结果:307份标本中共检出阳性标本6份,总阳性率为1.95％(6/307),其中散放的鸡、鸭、猪带菌阳性率分别为1.67％(3/180)、14.29％(1/7)、2％(2/100).且分离的6株大肠埃希菌O157:H7特异性基因rfb EO157均为阳性.结论:长沙市岳麓地区家畜家禽已存在大肠埃希菌O157:H7感染,应引起足够的重视.提示加强宿主动物大肠埃希菌O157:H7监测,对疫情的分析和疫情预测具有重要意义.     

肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体的生物学特性

目的：分离并鉴定肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体,对其生物学特性进行研究,为开发抗肠出血性大肠埃希菌O157的生物制剂提供实验依据。方法：以肠出血性大肠埃希菌O157为宿主菌,采用噬斑法从环境污水中分离出针对肠出血性大肠埃希菌O157的噬菌体。噬菌体经超滤浓缩后,电镜观察其大小和形态;将宿主菌和噬菌体以不同的比例混合,测定噬菌体的最佳感染复数并观察其一步生长曲线;利用SDS-PAGE分析噬菌体的结构蛋白和非结构蛋白;提取噬菌体基因组,进行酶切电泳分析。结果：电镜显示噬菌体的头部呈球形、直径40 nm,噬菌体的尾部长约80 nm。噬菌体的最佳感染复数为10^-2,即当宿主菌和噬菌体之间的比例为1∶100时裂解效率最高。一步生长曲线示噬菌体在裂解宿主菌时,潜伏期约为10 min,爆发期约为30 min,裂解量为130。SDS-PAGE凝胶电泳呈现13种蛋白,相
对分子质量为16 000～22 000。 琼脂糖凝胶电泳显示噬菌体基因组大小约23 000 bp。结论：成功分离并鉴定一株针对肠出血性大肠埃希菌O157的噬菌体,是一种裂解性强、特异性高的毒性噬菌体,肠出血性大肠埃希菌O157噬菌体属于有尾病毒目,管尾噬菌体科。     

大肠埃希菌O157∶H7分离鉴定及毒素基因多重PCR检测

目的 了解大肠埃希菌O157∶H7(EHEC O157∶H7)在云南战区感染性腹泻患者及猪粪便中检出情况.方法 将标本接种mEC增菌液中增菌,免疫磁珠磁珠富集后,分别接种科玛嘉显O157显色琼脂和山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂平板培养,MUG初筛,肠杆菌科细菌生化鉴定编码系列(API-20E)和VITEK32全自动微生物生化分析仪鉴定.应用多重PCR扩增检测志贺毒素1、2(SLT1/SLT2)和侵袭相关基因.小白鼠腹腔注射法测定其毒力.K-B法做抗生素药敏试验.结果 从腹泻患者和猪中均检出EHEC O157∶H7,具有志贺毒素SLT1/SLT2和侵袭相关基因的三个毒素基因.毒力试验使小白鼠发病死亡.药敏试验对14种抗生素敏感.结论 云南战区存在EHEC O157∶H7感染.建立和优化的多重PCR方法,能快速、敏感特异的检测EHEC O157∶H7毒素基因,为重大食源性疾病处理、诊治及流行病学调查提供了强有力的技术手段.     

EMA-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7

目的 将叠氮溴化乙锭 （ethidium monoazide bromide,EMA）与PCR技术相结合,建立一种有效、快速检测活肠出血性大肠杆菌O157∶H7的方法。方法 以rfbE为PCR检测靶基因,O157∶H7培养物经EMA处理后制备模板进行PCR检测,并对EMA使用浓度、作用时间等进行优化。结果 不抑制O157∶H7活菌PCR扩增的最大EMA浓度为10 μg/mL;抑制2×107 CFU/mL死菌PCR反应的最小EMA浓度为0.5 μg/mL;该法对O157∶H7检测的灵敏度为2×104 CFU/mL,结果显示能检出混合体系中含有的1%的活菌。结论 EMA-PCR技术能有效检测活的O157∶H7,在突发公共卫生事件的快速检测中具有良好的应用前景。     

南宁市O157大肠埃希菌的监测研究

目的探讨南宁市肠出血性O157大肠埃希氏菌人感染、动物和媒介昆虫带菌状况。方法2008年所采集的腹泻病人粪便、动物粪便和苍蝇等标本,经处理后接种mEC肉汤增菌,先用免疫胶体金标法做初筛,阳性标本用免疫磁珠浓缩目标菌,划线接种CHROMagarO157显色琼脂平板,纯化后进行血清学诊断,然后集中进行系统生化鉴定和毒力检测等。结果共检测1083份标本,检出10株O157大肠埃希菌,总阳性率为0．92％,其中猪粪便为9．38％,牛粪为4．00％。苍蝇为4．35％,鸡粪为0．49％,腹泻病人粪便和鸭粪均未能出O157大肠埃希菌,部分标本中检出与0157大肠埃希菌有相关抗原的致病性大肠埃希菌（EPEC）和未能定型的大肠埃希氏菌;对所检出10株O157菌做SLT1、SLT2、eaeA、hlv44种毒力基因的检测,发现3株菌（同一猪场的1份猪粪便和2份苍蝇中检出eaeA＋hly44阳性,未见含有SLT1 SLT2基因,其他菌株SLT1 SLT2eaeAhlyA．均为阴性。结论南宁市养殖场部分动物体携带有一定程度致病力的O157大肠埃希菌,并已造成了周围环境污染,威胁人们的生命健康,提示加强宿主动物O157大肠埃希菌监测和研究是防止未来大流行的关键。     

徐州市1999年大肠埃希菌O157:H7动物发病及带菌情况调查

目的：了解徐州市不同地区大肠埃希菌O157：H7出血性肠炎流行季节动物的发病及带菌率。方法：在不同流行强度的地区调查点，调查猪、鸡、牛、羊的发病情况；并采集其粪便，用免疫磁珠法进行病原分离培养。结果：6个调查点共调查动物565头，发病35头，罹患率6．19％；共采集猪、鸡、牛、羊等动物粪便标本901份，分离出大肠埃希菌O157：H7 130株，总带菌率14．4％，其中以牛、羊带菌率较高，分别为21．9％、19．4％。结论：在大肠埃希菌O157：H7出血发表怕炎流行季节各种动物都有不同比例发病，不同地区的动物带菌率也不尽相同。提示加强动物大肠埃希菌O157：H7发病率及带菌率的调查对疫情分析与疾病控制有重要意义。     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株的细胞毒性比较

目的 比较肠出血性大肠埃希菌流行菌株的细胞毒性,筛选强毒株,为进一步研究细菌的致病机理提供理论依据.方法 采用PCR技术鉴定菌株的毒力基因E-hlyA、stx2、stxl,Giemsa染色观察细菌的黏附情况,通过测定感染后Vero细胞的乳酸脱氢酶释放情况了解细菌的Vero细胞毒性强弱.结果 肠出血性大肠埃希菌O157∶H7菌株含有的毒力基因不同,均具有较强的黏附能力和Vero细胞毒性,其中国际菌株933W/O,中国流行菌株882364、01H112和日本菌株Cua9的Vero细胞毒性较强.结论 筛选出的流行菌株强毒株,可用于进一步的细菌感染模型构建和毒力基因致病机制研究.     

肠出血性大肠埃希菌O157∶H7黏附HeLa细胞模型的建立

目的 建立肠出血性大肠埃希菌O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制奠定基础.方法 以细菌黏附HeLa细胞数量为指标,分别评价细菌数量、细菌与细胞孵育时间对细菌黏附数量的影响,得到最佳条件,最后肌动蛋白荧光染色(FAS)试验鉴定模型.结果 加入细菌为1×105 CFU,细菌与细胞孵育4 h时,黏附细胞的数量最佳,FAS检测发现该条件下细菌能够引起细胞特异性黏附、擦拭(attaching & effacing, A/E) 损伤,模型建立成功.结论 成功建立O157∶H7体外黏附HeLa细胞模型,为进一步研究其致病机制提供了条件.     

大肠埃希菌O157：H7分离鉴定及毒素基因多重PCR检测

目的了解大肠埃希菌O157：H7（EHEC O157：H7）在云南战区感染性腹泻患者及猪粪便中检出情况。方法将标本接种mEC增菌液中增菌,免疫磁珠磁珠富集后,分别接种科玛嘉显O157显色琼脂和山梨醇麦康凯（S-MAC）琼脂平板培养,MUG初筛,肠杆菌科细菌生化鉴定编码系列（API-20E）和VITEK32全自动微生物生化分析仪鉴定。应用多重PCR扩增检测志贺毒素1、2（SLT1/SLT2）和侵袭相关基因。小白鼠腹腔注射法测定其毒力。K-B法做抗生素药敏试验。结果从腹泻患者和猪中均检出EHEC O157：H7,具有志贺毒素SLT1/SLT2和侵袭相关基因的三个毒素基因。毒力试验使小白鼠发病死亡。药敏试验对14种抗生素敏感。结论云南战区存在EHEC O157：H7感染。建立和优化的多重PCR方法,能快速、敏感特异的检测EHEC O157：H7毒素基因,为重大食源性疾病处理、诊治及流行病学调查提供了强有力的技术手段。     

用RAPD技术分析出血性大肠杆菌O157∶H7

目的应用RAPD技术分析肠出血性大肠杆菌O157∶H7 DNA多态性并对其分型.方法用两条10bp的随机引物对3株肠出血性大肠杆菌O157∶H7和3株其它病原性大肠艾希氏菌进行扩增,扩增产物经凝胶电泳后得到指纹图.结果共得到12个不同的DNA指纹图谱,经统计软件SPSS系统聚类分析得到两个不同的分类树状图.结论 RAPD技术方法简便、快速、分辨力高,在肠出血性大肠杆菌O157:H7分子流行病学研究中有较大的应用前景.     

肠出血性大肠埃希菌O157：H7的分布及特征

目的了解H市外环境（食品、生活污水及菜地土壤）中肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的分布与特性。方法用免疫磁珠富集法进行O157：H7分离;按《全国食品污染物监测相关实验室手册》（细菌学部分）及相关国家标准鉴定分离菌株;标准血清分型;PCR法测定菌株SLT1,SLT2,ereA,hly毒素基因;纸片琼脂扩散（K-B）法测定菌株耐药性。结果自H市外环境标本（食品、生活污水、菜地土壤）检出O157：H7共15株,检出率1.42%～4.34%,鸡肉与生活污水检出率高;农贸市场食物中O157：H7的检出率（2.25%）高于超市（0.56%）;它们中有93.33%（14/15）是携带SLT1、SLT2、eae、hly毒力基因的高致病菌株;食源性O157：H7耐药性严重,耐药菌株多,仅对哌拉西林、亚胺培南敏感。结论H市外环境有O157：H7分布,且检出的多是高致病性强毒菌株,应警惕其流行造成感染的潜在危险。     

四种致泻性大肠埃希氏菌实验室检测研究进展

肠致病性大肠埃希氏菌（EPEC）、肠产肠毒素大肠埃希氏菌（ETEC）、肠侵袭性大肠埃希氏菌（EIEC）、肠出血性大肠埃希氏菌（EHEC）四种致泻性大肠埃希氏菌是引起人体以腹泻症状为主的全球性疾病的常见病原菌,也是我国绝大多数地区引起腹泻的主要病原菌,因此快速准确地检测这四种病原菌对预防和控制由其引起腹泻有着十分重要的作用。本文介绍了这四种致泻性大肠埃希氏菌实验室检测技术的研究进展,主要包括细菌分离培养、免疫学检测、多重PCR、实时荧光PCR等分子生物学方法。