DHPLC在X-连锁肾上腺脑白质营养不良分子诊断中的应用(附12例报告)

目的探讨DHPLC在X-连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)分子诊断中的应用。方法提取12个X-ALD家系及成员的外周血基因组DNA,分15个片段扩增ABCD1基因的10个外显子,应用DHPLC技术对其进行突变筛查,并对出现异常洗脱峰的PCR产物进行DNA序列测定,证实突变位点的存在。结果12个X-ALD家系存在12种不同的ABCD1基因突变,包括8个错义突变、2个移码突变和2个无义突变,即P534R、G343V、R259W、A141T、R401Q、K276E、Y174C、A314P、fs E471、fs A247、S108X和Q177X。结论DHPLC筛查结合DNA序列测定能快速有效检测出ABCD1基因突变。不同的X-ALD家系有不同的ABCD1基因突变位点,突变类型和表型之间无特殊相关关系。     

基因芯片技术在创伤骨科研究领域的应用进展

基因芯是将大量的DNA片段按预先设计的排列方式固化在载体表面，并以此为探针，在一定的条件下与样品中待测的靶基因片段杂交，通过检测杂交后的信号，实现对靶基因信息的快速检测。基因芯片可以分为很多种类，常见并广泛应用的有cDNA微点阵和寡核苷酸原位合成芯片。基因芯片能对微量样品中的核酸序列进行检测和分析，其高通量、快速、并行化采集生物信息的特点更是优于其他传统的技术方法。笔者概述了近年来基因芯片技术在骨科创伤机制、创伤修复及在骨组织工程领域研究中的应用进展。     

CHO细胞高效表达载体的优化

目的：研究分析中国仓鼠EF1—α基因的转录调控序列，以构建新型高效表达载体。方法：利用常规分子生物学技术，构建了一系列基于CHEF1—α基因的非翻译区调控序列元件的新型真核表达载体。以组织型纤溶酶原激活剂突变体（k2tPA）作为报告基因，利用本室已建立的CHO-dhfr^--Z^＋定点整合表达系统比较载体表达外源基因的能力，挑选表达量高的载体。进一步添加翻译增强子（H213及V163）序列，再进行评价。结果：CHEF1-α5′UTR及启动子＋3′UTR1．65kb、CHEF1-α5′UTR及启动子＋3′UTR2．7kb这2种组合均可有效提高目的基因tPA的表达，表达效率与对照载体相比分别提高了65．9％和54．5％。在添加翻译增强子V163后，载体pMCEdEF53Ⅲ-163frt-k2tPA的表达效率为对照载体的2．65倍。结论：该载体系统在重组蛋白药物的研发方面具有良好的应用前景。     

人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR序列包含潜在蛋白结合位点

目的：检测中国人端粒酶催化亚基(hTERT)基因第2内含子VNTR多态性，探询VNTR序列是否具有潜在的蛋白结合位点，从而为进一步研究这些VNTR的功能提供线索。方法：采用PCR方法扩增健康中国人外周血淋巴细胞基因组hTERT基因第2内含子多态性VNTR片段，克隆并鉴定，以多态性重复单元做为探针进行凝胶延迟实验，以确定该片段是否存在蛋白结合位点。结果和结论：hTERT基因第2内含子内上游的一个VNTR序列(VNTR2-1st)存在一个潜在蛋白结合位点，该蛋白能够与多态性VNTR DNA序列形成复合物，蛋白结合的关键位点处于42bp重复单元c端的典型E-box基序(CACGTG)，但是c-myc并不参与结合该VNTR2-1st重复单元。此外，利用第6内含子内上游的VNTR(VNTR6-1st)的重复单元做为探针，结果发现该38bp VNTR6-1st重复单元不能与HeLa细胞核蛋白因子结合，从而提示了不同VNTR序列功能的多样性。     

中国南海新型甜芋α-螺毒素Iml．6的克隆及合成、

目的从中国南海堂皇芋螺（Conusimperialis）中克隆出新的芋螺毒素序列并用化学方法合成该毒素。方法根据A超家族保守的信号肽序列设计引物,采用cDNA的3’端快速扩增方法（3’RACE）,从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因。固相法合成线性多肽,折叠形成目标产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式。结果发现一种新的α-芋螺毒素cDNA序列Iml．6,其编码的成熟肽序列为GccDIPDCYNKNREQc—NH：,二硫键连接方式为“c1．c3,c2．C4”。结论Iml．6是一种新的α4／7型芋螺毒素,其氨基酸序列与报道的α-一芋螺毒素显著不同。     

中国南海新型α-芋螺毒素Im1.6的克隆及合成

目的从中国南海堂皇芋螺(Conus imperialis)中克隆出新的芋螺毒素序列并用化学方法合成该毒素。方法根据A超家族保守的信号肽序列设计引物,采用cDNA的3'端快速扩增方法(3'RACE),从芋螺毒腺管中克隆出新的毒素基因。固相法合成线性多肽,折叠形成目标产物,用两步氧化折叠法测定多肽的二硫键连接方式。结果发现一种新的α-芋螺毒素cDNA序列Im1.6,其编码的成熟肽序列为GCCDIPDCYNKNREQC-NH2,二硫键连接方式为C1-C3,C2-C4。结论 Im1.6是一种新的α4/7型芋螺毒素,其氨基酸序列与报道的α-芋螺毒素显著不同。     

小尾寒羊促卵泡素受体基因5''''端序列的TaqI酶切多态性分析

采用PCR-RFLP技术，TaqI酶切、分析了38头份样品的小尾寒羊FSHR基因5‘端转录启动调控区序列。检测结果未发现多态性，在牛FSHR基因5‘端-387→-384位点，中国西门塔尔牛表现TaqI酶切多态的位点，小尾寒羊表现为无TaqI酶切序列的B等位基因类型，所有个体均为BB型。由于小尾寒羊的双羔率在100%以上，通过比较表明：FSHR基因转录启动调控区的B型DNA序列对提高双胎率有正效应。     

基因芯片结合可环化探针对单碱基突变的检测

目的：将基于连接反应的可环化探针(circularizable oligonucleotide probe，C-probe)技术用于基因芯片对单碱基突变的检测。方法：可环化探针是一种检测核酸分子中单碱基突变的线性寡核苷酸分子，中间部分是通用引物结合区(约40mer)，5’端与3’端是两段与待检测的DNA分子中靶序列互补的目标序列识别区(各约20mer)。与靶序列互补结合后，可环化探针的两个末端在空间靠近并在DNA连接酶的作用下连接形成环状分子，利用荧光分子标记的通用引物对连接产物进行PCR扩增，再利用基因芯片检测荧光标记的PCR产物，从而确定所检测的核苷酸位点的性质。本实验以检测CYP3A4基因外显子5中14026位点的单核苷酸多态性为例，优化了连接反应、荧光标记通用引物的PCR扩增以及探针杂交检测等条件，并用该方法对合成模板和人基因组DNA标本进行检测。结果：以合成的寡核苷酸序列为模板进行10倍系列稀释，确定可环化探针的检测灵敏度，PCR产物的凝胶电泳结果表明，检测灵敏度达到10^3拷贝；可环化探针对合成的野生型和突变型模板具有良好的区分效果。用该方法检测人基因组DNA标本，芯片检测结果与测序结果符合，证实了该方法的可行性。结论：连接反应是最具特异性的酶促反应，将其与基因芯片技术结合用于单碱基突变检测，有助于简化荧光标记过程，提高检测结果的准确性。     

RNA干涉抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达

目的：通过抑制肺癌细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)的表达，从而部分恢复抑癌基因的表达。方法：采用RNAi技术来抑制DNMT1的活性。应用体外转录的方法，共合成了5个针对DNMT1不同靶位的siRNA序列，并转染人肺癌细胞NCI-H157。采用MSP-PCR、COBRA等方法对抑癌基因RASSF1A进行甲基化分析，半定量RT-PCR检测DNMT1 mRNA的敲降与RASSF1A基因的表达。结果与结论：5个靶位的siRNA序列中有两个靶位能够有效地抑制DNMT1的表达，且呈剂量依赖效应。人肺癌细胞NCI-H157中抑癌基因RASSF1A发生了高度甲基化，在抑制DNMT1活性后，RASSF1A基因去甲基化而恢复表达。     

南宁市2685例贫血患儿α-地中海贫血基因诊断分析

目的 了解南宁地区贫血患儿α-地中海贫血（地贫）发生情况、基因类型及频率.方法 采用单管多重PCR体系扩增结合琼脂糖凝胶电泳和反向点杂交技术,对诊断为贫血的患儿2685例进行常见α-地贫基因检测,对HbA2和HbF升高者再进行β-地贫基因检测.结果 2685例患儿中,检出α-地贫1243例（46.29%）,22种基因类型,主要为--sea /αα（23.76%）,其次为-α3.7/αα（4.69%）,--sea/-α3.7（3.84%）,--sea/αCSα（3.17%）;包括6种等位基因1563个,主要为--sea（56.62%）,其次为-α3.7（15.74%）和αCSα（14.52%）;α复合β地贫检出率为5.18%.结论 南宁地区贫血患儿α-地贫基因突变率、中间型α-地贫及复合β地贫发生率均较高,应在该类患儿中进行基因诊断,为该类患者的病因诊断和治疗提供依据.     

白细胞介素1β基因单核苷酸多态性分析

目的 检测中国人白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）β基因多态性，并初步预测调控区单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）对IL-1β功能的影响。方法 对来自中国人群有代表性的10个民族27名个体的基因组DNA作为样本，采用直接测序的方法检测IL-1β基因的5’区、编码区、部分内含子区和3’区序列，以确定中国人群中IL-1β基因多态性的位置和类型，用生物信息学方法对5’区SNPs的功能进行初步预测。结果 在4610bp的测序片段中，共发现了6个SNPs，包括5’区3个，内含子区3个，其中5’区的-511T／C、-31C／TSNP国内外已有报道，而-1470G／CSNP未见相关报道。生物信息学分析其中5’区的3个SNP均不在5区的重复区，且3个位点都是与IL-1β转录有关的核因子结合的区域。结论 IL-1β调控区3个SNPs可能对IL-1B表达产生影响，有待进一步深入研究。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在COS-7细胞中的表达

目的：构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体，并检测其在COS-7细胞中的表达。方法：将目的基因4-1BBL克隆人pUCl9载体中并进行酶切鉴定和DNA序列测定。亚克隆入真核质粒pIRES2-EGFP，构建真核表达载体pIRES2-EGFP-m4-1BBL。用脂质体法将重组质粒转入COS-7细胞，以RT-PER和观察细胞内荧光的方法检测m4-1BBL的表达。结果：酶切鉴定和序列分析证实，重组质粒含有人4-lBBL全长cDNA编码序列，转染实验表明4-lBBL基因能在COS-7细胞中表达。结论：鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在COS-7中的表达均获成功，为进一步研究奠定了基础。     

小反刍动物慢病毒通用PCR检测方法的建立与初步评价

为建立通用的小反刍动物慢病毒(山羊关节炎-脑炎病毒和梅迪-维斯纳病毒)病原学检测技术方法,本研究对Gen Bank公布的31株小反刍动物慢病毒前病毒基因组序列进行比对,筛选出vif基因上约150 bp的序列作为诊断标记物并设计简并引物;通过全基因合成方法获得该序列作为PCR反应的阳性对照模板,以此建立了小反刍动物慢病毒PCR检测方法,研究结果初步证实其可用于山羊关节炎-脑炎病毒和梅迪-维斯纳病毒野毒株RNA和前病毒DNA的检测,说明该方法有望用于我国小反刍动物慢病毒病的检测与流行病学调查。     

鼠疫耶尔森菌DNA标识序列的鉴定及其应用研究

目的确定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,以用于鼠疫耶尔森菌的快速检测和鉴定。方法通过芯片比较基因组杂交和PCR验证,鉴定鼠疫耶尔森菌DNA标识序列,针对标识序列设计特定的PCR引物。结果鼠疫耶尔森菌基因组中存在3个区段,共28条基因,均是鼠疫耶尔森菌DNA标识序列。针对其中3条基因设计PCR引物,能特异性扩增出鼠疫耶尔森菌,与来自其他非鼠疫耶尔森菌的DNA无交叉反应。结论鼠疫耶尔森菌存在DNA标识序列,并能用于鼠疫耶尔森菌的快速检测与鉴定。     

抑制差减杂交筛选辐射致癌差异表达基因

目的筛选研究辐射诱发小鼠肿瘤相关差异表达基因。方法以^60Coγ射线照射诱发的小鼠白血病动物模型为研究对象，采用抑制差减杂交技术构建辐射致癌差异表达基因cDNA文库，鉴定后挑取阳性克隆测序，并与GeneBank数据库进行同源性比对分析。结果抑制差减杂交筛选得到102个阳性克隆，随机挑选30个克隆进行菌液PCR，扩增得到28个特异性插入片段，DNA测序结果经与GeneBank数据库比对发现代表了24个已知基因，其中3个为重复检出基因，暂未发现有未知序列基因。结论成功建立辐射致癌差异表达基因cDNA文库，初步筛选获得24条表达上调的差异片段，该结果将有助于充实完善辐射致癌的分子机制。     

原子力显微镜观察早先辐射事故受照射者染色体易位

目的探求原子力显微镜(AFM)在辐射诱发染色体畸变分析和结构观察等方面应用的优势，为深入探讨辐射损伤和癌变形成机理奠定基础。方法利用染色体核型自动分析系统，研究上海“6．25”事故受照射者照射后12年易位染色体的断裂点分布情况，选择断裂点好发部位的畸变进行AFM分析和结构观察，并与光学显微镜分析结果比较。结果对易位畸变的AFM分析，不仅准确地判定断裂点的确切部位，还提供了损伤热点的高分辨三维结构。结论AFM能够对辐射诱发染色体畸变的研究提供更多更确切的信息，其中损伤热点结构的观察为基因水平的深入研究提供了三维结构的依据。     

中国人γ-IFN对放射性肺纤维化的防治作用

目的 研究中国人γ-干扰素对放射诱导的人肺成纤维细胞（HLF）异常增殖的抑制作用，探讨其对放射性肺纤维化的防治作用及机理。方法 MTT法检测细胞增殖，免疫细胞化学（SP）法观察成纤维细胞α—SMA的表达及Col Ⅳ的合成。结果 ①^60Coγ射线能够诱导HLF的异常增殖，γ-IFN呈浓度依赖性抑制照射所致的HLF的异常增殖；②照射后HLF胞浆内有明显的α-SMA的表达，表明照射可以诱导FB向MFB转化；③照射后ColⅣ的表达增高，照射前给予γ-IFN，ColⅣ的表达相对单纯照射组明显降低。结论 ^60Coγ射线通过直接促进HLF增殖、诱导FB向MFB转化和促进ColⅣ的分泌来诱导肺纤维化的发生；γ-干扰素通过抑制HLF的异常增殖和ColⅣ的分泌，对放射性肺纤维化具有防治作用。     

急性乙肝患者HBV特异性CD8T细胞受体基因的克隆分析

目的探讨急性乙肝患者HBV特异性CD8 T细胞受体(TCR)参与免疫应答的分子机制。方法分离HLA-A2阳性急性乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMCs),用荧光标记的CD3、CD8抗体和五聚体染色,流式细胞仪检测HBsAg183-191和HB-sAg335-343特异性CD8 T细胞频率。取6例患者PBMCs,用HBsAg335-343表位多肽诱导培养3~4周,用磁珠分选出CD8 T细胞后再用流式细胞术分选HBV特异性CD8 T细胞,经IL-2/CD3抗体/CD28抗体扩增后提取细胞mRNA,用cDNA5′末端快速扩增技术获取TCR分子α链和β链全长可变区基因片段并进行克隆和测序,每个样本的克隆测序数≥50个。确定TCRα、β链基因家族并比较CDR3区序列特点。结果 6例患者样本600多个TCRα、β链克隆基因序列分析结果表明,HBV特异性CD8 T细胞均呈现TCR分子α、β链基因家族优势表达特点,每例患者样本以2~4种α链和1~4种β链家族为主,其中α2、α14、α15、β3、β13和23链家族同时出现在1例以上患者,有1例患者所有克隆分析的β链基因均为β13家族。同一患者同一家族α、β链CDR3区序列趋于一致,而不同患者同一家族α、β链CDR3区序列相差较大。结论经HBV抗原表位多肽诱导增殖的特异性CD8 T细胞具有明显的TCRα、β链取用优势特点,这种TCR链的优势表达特点可能是影响抗HBV感染特异性细胞免疫力的重要分子基础。     

应用辣根过氧化物酶化学发光检测毒素原性大肠杆菌方法的建立

利用活化酶标复合物（HRP－PBQ－PEI^ －NH3^ ）直接标记毒素原性大肠杆菌不耐热肠毒素（ETEC－LT）基因片段（0.8kb)作探讨。HRP在戊二醛作用下与单链靶DNA形成DNA和酶的共价复合物，与DNA探针结合的辣根过氧化物酶（HRP）催化相应的发光剂，经增强型化学发光反应（ECL）在普通X胶片上自显影（CPD）检测ETEC－LT。结果可检测到0.03pg的纯质粒DNA和10^3的ETEC菌细胞，dot blot杂交证明该酶标基因探针仅与产生LT肠毒素的ETEC杂交，其余均未见杂交阳性反应，结果表明酶（HRP）标基因探针化学发光法检测ETEC是一种简便，快速，安全，高度敏感和特异的非放射性标记基因探针检测技术。     

人、鼠胰星状细胞3种细胞标志物desmin、GFAP、α-SMA的表达

目的 研究人和大鼠胰星状细胞(PSCs)在培养过程中细胞标志物表达的动态变化。方法 人和大鼠胰腺组织经胶原酶、链霉蛋白酶E和DNase Ⅰ联合消化后，采用Nycodenz不连续密度梯度离心方法分离PSCs，获得的细胞采用离心淘洗技术进行纯化。用激光共聚焦扫描显微镜观察新鲜分离细胞的维生素A(VitA)自发荧光现象，用免疫组化法检测细胞标志物——结蛋白(desmin)、神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和α-平滑肌动蛋白(α-SMA)的表达。细胞接种培养后，观察细胞形态和生长特性，采用Western和Northem分析分别检测细胞标志物和Ⅰ型前胶原α1链基因表达的动态变化。结果 采用离心淘洗技术获得的人和大鼠PSCs纯度分别可达85％以上和95％以上。新分离的人和大鼠PSCs胞浆内有VitA自发性蓝绿色荧光。新分离大鼠PSCs表达desmin和GFAP，不表达α-SMA，而人PSCs均不表达desmin、GFAP或α-SMA。在体外培养过程中，大鼠PSCs表达desmin和GFAP逐渐减弱，但人和大鼠PSCs均开始大量表达α-SMA蛋白和Ⅰ型前胶原基因。结论 利用离心淘洗技术可获得高纯度的人和大鼠PSCs。人和大鼠PSCs细胞标志物表达存在种属差异，但它们活化后均高表达α-SMA蛋白和Ⅰ型前胶原基因。