体外检测近交系小鼠HBsAg特异性细胞毒T淋巴细胞方法的建立

通过磷酸钙法用含ＨＢＶＳ基因的质粒ｐＲｃ／ＣＭＶＳ与含筛选标记基因－ｎｅｏ基因的质粒ｐＳＶ２－ｎｅｏ对ＢＡＬＢ／Ｃ近交系小鼠肥大细胞瘤细胞株Ｐ８１５细胞进行了质粒共转染，并经Ｇ４１８筛选得到了Ｇ４１８抗性细胞，即Ｐ８１５－Ｓ细胞，斑点杂交和免疫组化实验分别证实Ｐ８１５－Ｓ细胞内有ＨＢＶＳ基因的存在；Ｐ８１５－Ｓ细胞浆内和膜上有ＨＢｓＡｇ的表达。表明了Ｐ８１５－Ｓ细胞要作为体外检测ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠Ｈ     

HBsAg体外冲击的慢性乙肝患者树突状细胞对HBV特异性CTL的诱导作用

目的 :研究 HBs Ag冲击的慢性乙肝患者单核细胞来源的树突状细胞 (DCs)体外对 HBV特异性 CTL的诱导作用 ,初步探讨诱导特异性抗 HBV细胞免疫的途径。方法 :分离慢性乙肝患者外周血单核细胞 ,以 GM-CSF + IL -4 + TNF -α培养诱导DCs,加入 HBs Ag冲击以诱导 HBV特异性 DCs。采用 LDH法检测 DC诱导的患者外周血 T细胞对 Hep G2 2 .2 .15 (转染 HBVDNA)、Hep G2肝癌细胞株及 K5 62白血病细胞株的细胞毒作用。结果 :HBs Ag冲击的 DC可有效地诱导自体 CTL 对转 HBV基因的Hep G2 2 .2 .15细胞高效特异性杀伤作用 (P<0 .0 1)。结论 :慢性乙型肝炎患者单核细胞来源的 DCs经 HBs Ag抗原冲击后 ,可有效地诱导对 HBV特异性反应的 CTL     

特异性体外扩增人γδT淋巴细胞及其生物学特性的研究

探讨人γδＴ淋巴细胞体外特异性激发的方法，及其杀伤肿瘤细胞的分子机理。方法采用人多发性骨髓瘤细胞株ＸＧ－７细胞作为刺激细胞，与人外周血单个核细胞体外共同培养，激发和扩增人γδＴ淋巴细胞。以流式细胞仪或间接免疫荧光技术分析细胞表型；再以５１Ｃｒ４小时释放试验检测γδＴ淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤效应。结果（１）采用本培养系统，可以使来自健康人或肿瘤患者的外周血γδＴ淋巴细胞得以选择性激发和扩增，由４．８％±３．４％增加至４６．０％±８．３％，在白细胞介素２（ＩＬ－２）的作用下，能迅速、大量地增殖，３周内可达１０１０以上数量级。（２）所扩增的γδＴ淋巴细胞，对肿瘤细胞株（天然杀伤细胞敏感株Ｋ５６２和淋巴因子激活的杀伤细胞敏感株Ｄａｕｄｉ）皆可介导高效杀伤活性，而对正常淋巴母细胞则无明显细胞毒作用。（３）抗热休克蛋白（ＨＳＰ）－７０单克隆抗体可阻断γδＴ淋巴细胞对ＸＧ－７细胞的反应。结论本室建立的人γδＴ淋巴细胞体外激发、扩增的方法，具有简便、迅速、重复性好的特点，对肿瘤细胞具有广谱的细胞毒活性，在肿瘤的过继免疫治疗中具有潜在的临床应用价值。     

同种抗原特异性T淋巴细胞克隆方法的建立

目的 建立抗原特异性T淋巴细胞克隆的方法。方法 以供体脾细胞作同种抗原,刺激受体外周血单个核细胞,用有限稀释法进行T淋巴细胞克隆。结果 获得3个T淋巴细胞株。经免疫组化分析,有2个细胞株为CD3^ CD4^-CD8^ 。另一个细胞株为CD3^ CD4^-CD8^-。后者经流式细胞仪分析纯度为97％。抗原特异性检测表明：用供体细胞刺激,克隆T细胞发生增殖作用;用无关个体细胞刺激,无增殖作用。结论 成功地建立了抗原特异性T淋巴细胞克隆方法。     

细胞毒性T淋巴细胞在乙型肝炎中的作用研究进展

乙型肝炎病毒(HBV)感染后，决定病情严重程度及病程转归的一个主要因素是机体的免疫反应能力。由于患者体内抗病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)在清除病毒方面发挥重要的功能，下面就CTL在乙型肝炎中作用研究近况综述如下。     

细胞毒性T淋巴细胞活性的检测及应用

细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的测定是了解机体细胞免疫功能的重要方法,在表位鉴定、疫苗效果评价、预测移植排斥反应等研究中广泛应用,因此有效地检测其功能非常重要,本文综合叙述了主流的检测方法及其各自应用。     

骨肉瘤特异杀伤性T淋巴细胞的体外扩增

目的 研究骨肉瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）体外扩增培养的方法，并进行细胞毒检测。方法 抽取骨肉瘤患自身的外周血，分离淋巴细胞，用IL-2体外短期刺激方法提高对骨肉瘤细胞的免疫性，再按一定比例体外与多西紫杉醇处理的骨肉瘤细胞及巨噬细胞混合培养（MTLC）可获得骨肉瘤的特异性CTL细胞，进行鉴定并观察其杀伤特性。结果 混合培养4d后，即可扩增出大量淋巴细胞，流式细胞仪证实主要是CD8^ 细胞，这些具有杀伤活性的CTL细胞体外对自身肿瘤细胞有很强的细胞毒作用。结论 在IL-2作用下，应用巨噬细胞、自体肿瘤细胞及淋巴细胞体外混合培养，是体外扩增特异性细胞毒性T淋巴细胞的较好方法，CTL作为新的特异性免疫治疗方法有望提高骨肉瘤的免疫治疗效果。     

树突状细胞体外刺激对HBV特异性细胞毒T细胞影响的研究

目的探讨通过聚肌胞体外作用树突状细胞后改善慢性乙型肝炎患者树突状细胞功能,并在体外活化自身T细胞获得高频数HBV特异性细胞毒性T细胞(CTL)的方法。方法分离慢性乙型肝炎病人外周血单个核细胞,在粒巨噬细胞集落刺激因子(GM CSF)和白细胞介素4(IL4)的诱导下培养树突状细胞。培养的第7天加入聚肌胞刺激获得成熟树突状细胞,经HBVcore1827肽负载后与自身T淋巴细胞共培养,通过酶联斑点计数法(Elispot)及MHC肽四聚体法(Tetramer)比较病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组、经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组、经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组中HBV特异性的CTL的功能和频数。结果慢性乙型肝炎病人外周血单核细胞体外经GM CSF和IL4诱导可转化为树突状细胞,树突状细胞转化过程中聚肌胞的刺激可显著上调树突状细胞表面分子CD80、CD83的表达(P<0.01),促进树突状细胞的成熟。Elispot法检测分泌IFNγ的CTL的频数病人T细胞未经自身树突状细胞刺激组分泌频数为(9～28)/1×105T细胞,均值16;经HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(30～67)/1×105T细胞,均值为46;经聚肌胞促成熟的HBVcore1827肽负载的自身树突状细胞刺激组频数为(59～130)/1×105T细胞,均值为98。三组数据     

细胞外尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸对小鼠细胞毒T细胞的影响

将小鼠细胞毒Ｔ细胞用含有不同浓度尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸的ＲＰＭＩ１６４０液进行孵育，观察尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸对细胞毒Ｔ细胞的增殖及细胞毒性的影响。结果显示：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸对细胞毒Ｔ细胞的增殖及细胞毒性均产生明显抑制作用，而且这种抑制作用在去除了尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸后仍持续存在。     

EBV特异性细胞毒淋巴细胞的体外诱导和对鼻咽癌细胞的杀伤活性

目的 探索体外诱导和扩增EBV特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的方法,探讨其应用于鼻咽癌(NPC)治疗的可能性.方法 用EB病毒转化的B淋巴细胞系为抗原递呈细胞及抗原刺激剂,经照射灭活后刺激自体外周血单个核细胞(PBMC),产生EBV特异性CTL,以抗人CD3抗体OKT-3/同种异体PBMC法扩增.并检测其对NPC细胞的特异性杀伤.结果 在体外有效诱导和扩增了EBV特异性的CTL.扩增前CTL对自体BLCL的杀伤率为76%,对同种异体BLCL的杀伤率为13%,对自体肿瘤细胞的杀伤率为51%,对CNE鼻咽癌细胞的杀伤率为27%.扩增后的杀伤率分别为63%、25%、49%、33%.扩增后CTL对肿瘤杀伤力没有明显下降.结论 EBV特异性CTL能在体外有效地诱导,对NPC细胞有特异性的杀伤力,能在体外大量地扩增,且扩增后对肿瘤的杀伤力没有明显下降,有望成为NPC患者有效的过继免疫治疗方法.     

噬菌体呈现疫苗诱导乙型肝炎病毒特异性细胞毒性T细胞反应

目的 研究噬菌体呈现颗粒作为亚单位疫苗是否能在体诱导乙型肝炎特异性细胞毒性Ｔ细胞反应。方法 构建呈现ＭＨＣＩ类分子（Ｈ－２＾ｄ）限制性表位ＨＢｓ２８－２９的噬菌体颗粒,小剂量、无佐剂接种ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ－２＾ｄ）小鼠。结果 重组噬菌体呈现颗粒在体诱导Ｈ－２＾ｄ限制的ＨＢｓ２８－２９特异性细胞毒性Ｔ细胞反应。结论 丝状噬菌体疫苗有效诱导细胞毒性Ｔ细胞反应,能用于发展抗病毒疫苗。     

BALB/c小鼠腹腔接种HBV表面S抗原疫苗引起的CTL反应

目的研究BALB/c小鼠免疫接种HBV表面S抗原疫苗(HBV small surface vaccine, S-HBsAg)能否引起特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应。方法分别给BALB/c小鼠腹腔内接种0~6 μg S-HBsAg,两周后加强一次,4周后分离小鼠脾细胞,体外用S-HBsAg特异性CTL表位多肽刺激;用特异性多肽、51Cr标记的P815细胞作为靶细胞;4 h51Cr释放实验检测CTL反应。结果分别接种0、0.65、1.25、2.5、5μg S-HBsAg的小鼠,其脾淋巴细胞CTL特异性释放率分别为31.21%±9.23%、42.36%±19.32%、91.21%±22.97%、69.25%±24.13%、51.49%±21.661%;只接受一次免疫接种的小鼠,其脾淋巴细胞CTL特异性释放率分别为27.34%±14.25%、32.27%±15.35%、56.28%±24.35%、44.34%±18.65%、40.76%±56%。结论BALB/c(H-2d)小鼠腹腔内接种S-HBsAg引起剂量依赖性特异性CTL反应,加强免疫能够提高CTL反应。     

斑点免疫酶法快速检测人血清中HBsAg

建立斑点免疫酶夹心法检测人血清中乙肝病毒表面抗原(HBsAg),并对方法的特异性、敏感性、结果的稳定性以及四种不同洗涤液、不同作用时间——做了比较。采用本法与常规ELISA法同时检测了250份临床标本。两者符合率为98.8％。二者比较无显著性差异(P>0.05)。本法以硝酸纤维素薄膜为载体,仅需血清2～3μl,耗时仅90 min,简便适用,可用于流行病学的调查以及应用于末梢血的检测。     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL杀伤K562细胞体外实验研究

目的 研究体外负载K562细胞冻融抗原的树突状细胞（DC）诱导细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的特异性杀伤作用。方法 联合应用细胞因子从外周血单个核细胞（PBMC）诱导培养出DC,在体外负载K562细胞冻融抗原。采用乳酸脱氢酶释放法,对比K562冻融抗原致敏DC组、未致敏DC组、淋巴细胞组、前列腺癌PC3冻融抗原致敏DC组分别激活的CTL对K562细胞的杀伤作用。结果 培养出具有典型特征的DC;在效靶比为10：1及20：1时。K562冻融抗原致敏DC组诱导的CTL对K562细胞的杀伤率分别为55．9％土22．0％、90．2％＋24．8％,均高于其他3组（p,0．05）。结论 K562细胞冻融抗原致敏DC可诱导激活CTL,具有明显杀伤K562细胞作用。并具有特异性。     

Frequencies and characterization of HBV-specific cytotoxic T lymphocytes in self-limited and chronic hepatitis B viral infection in China

Hepatitis B virus （HBV）-specific cytotoxic T lymphocytes （CTLs） are believed to play a major role in viral clearance and disease pathogenesis during HBV infection. To clarify the differences in host immune responses between self-limited and chronic HBV infections, we constructed three HLA-A＊0201/HBV tetramers with immunodominant epitopes of core18-27, polymerase 575-583 and envelope 335-343, and analyzed the HBV-specific CTLs in peripheral blood mononuclear cells （PBMCs） from patients infected with HBV. The frequencies and expansion ability of HBV-specific CD8＋T cells in most self-limited HBV infected individuals were higher than those in chronic HBV-infected patients. HBV-specific CD8＋T cells could be induced by in vitro peptide stimulation from chronic patients with a low level of serum HBV-DNA but not from those with a high level of serum HBV-DNA. In chronic infection, no significant correlation was found either between the frequencies of HBV-specific CD8^＋ T cells and the viral load, or between the frequencies and the levels of alanine transaminase. Our results suggested that the frequencies of HBV-specific CTLs are not the main determinant of immune-mediated protection in chronic HBV infection and immunotherapeutic approaches should be aimed at not only boosting a HBV-specific CD8^＋T response but also improving its function.     

Effect of oxymatrine on specific cytotoxic T lymphocyte surface programmed death receptor-1 expression in patients with chronic hepatitis B

Background  Oxymatrine has certain antiviral effects in the treatment of chronic hepatitis B (CHB), but its exact mechanism is unclear. The objective of the present study was to explore oxymatrine’s antiviral mechanism by studying its effect on the hepatitis B virus (HBV) specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) surface programmed death receptor-1 (PD-1) expression in CHB patients.

Methods  Sixty-five CHB patients who had HBV DNA³10⁴ copies/ml, positive HBeAg, positive human leukocyte antigen (HLA)-A2, alanine aminotransferase (ALT) >2´upper limit of normal value (ULN) were randomly divided into two groups: treatment group (n=33), treated with an intravenous infusion of 600 mg oxymatrine in glucose solution once a day for a month, then with a 200 mg oxymatrine oral capsule three times a day, and a 200 mg silibin meglumine tablet three times a day; control group (n=32) patients were treated only with silibin meglumine tablet, method and dosage were the same as those of treatment group. Three months later, peripheral blood HBV-specific CTL surface PD-1 expression, HBV-specific CTL level, HBV DNA, HBeAg, and results of liver function tests were analyzed and compared.

Results  Three months post-treatment, in the treatment group, peripheral blood HBV-specific CTL surface PD-1 expression ((19.42±15.94)%) decreased significantly compared to the pretreatment level ((31.30±24.06)%; P <0.05), and decreased significantly compared to that of control group three months after treatment ((29.45±21.62)%; P <0.05). HBV-specific CTL level ((0.42±0.07)%) significantly increased compared with the pretreatment ((0.29±0.15)%; P <0.01), and the control group posttreatment level was (0.31±0.15)% (P <0.05). HBV DNA level in 11 cases became negative (HBV DNA<500 copies/ml, 33.33%), which was higher than that of the control group after treatment (two cases, 6.25%; χ²=7.45, P <0.01), HBeAg of nine cases turned negative (27.27%), which was higher than that of the control group after treatment (one case, 3.13%; χ²=7.27, P <0.01).

Conclusion  Oxymatrine could downregulate peripheral blood HBV-specific CTL surface PD-1 expression in CHB patients, increase HBV-specific CTL level, which may be one of the possible mechanisms by which oxymatrine clears or inhibits HBV in CHB patients.

     

HBsAg在T7双质粒系统转染真核细胞中的表达

目的：研究双质粒T7表达系统在真核细胞中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的情况。方法：脂质体介导的T7双质粒共转染真核细胞，以斑点酶免疫试验(DOT-EIA)检测HBsAg表达情况。结果：HBsAg在质粒转染细胞后24h开始表达，72h达高峰。结论：T7双质粒表达系统能在体外培养的真核细胞中高效表达HBsAg，该系统可能在乙型肝炎病毒(HBV)基因免疫、外源性蛋白的制备等方面发挥重要作用。     

LDH检测BALB/c小鼠CTL活性的初步研究

目的 建立一个简便易行的动物模型及细胞毒性T细胞(CTL)检测体系，为HCV感染中CTL作用研究莫定理论基础。方法 用SP2／O作为靶细胞，LDH检测HCV核心区多肽免疫BALB／c小鼠的CTL活性。结果 HCV核心区多肽免疫BALB／c小鼠后，可用LDH检测其CTL活性，CTL活性可被CPAl0(5-23位氨基酸)增强及被CPA9(39-74位氨基酸)抑制。结论 LDH可稳定检测BALB／c小鼠的CTL活性。     

妊娠期特异性beta1糖蛋白9HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞表位的鉴定

目的:鉴定来自食管癌细胞中特异性高表达的妊娠期特异性betal糖蛋白9(PSG9)的HLA-A3限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位.方法:首先运用RT-PCR方法检测PSG9 mRNA在食管癌细胞EC9706、EC-1及EC-109中的表达情况.然后通过Bimas和syfpeithi预测,再结合NetCTL 1.2...