体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞分化的实验研究

目的：探讨体外诱导骨髓基质细胞向心肌细胞转化的条件。方法：分离大鼠骨髓，体外培养、传代得到骨髓基质细胞，观察不同浓度的诱导剂5-氮胞苷对骨髓基质细胞的生长和诱导作用，进行形态学和免疫组织化学鉴定。结果：5-氮胞苷诱导骨髓基质细胞转化为心肌样细胞，在诱导后2周转化率为29％。心肌特异性肌钙蛋白T(TnT)免疫组织化学染色阳性。结论：MSCs在体外条件下经5-氮胞苷诱导可分化成心肌样细胞。     

急性心肌梗死后经冠脉移植骨髓基质干细胞对心功能的影响

目的：通过对犬骨髓基质干细胞进行分离、诱导及培养,并经冠脉移植诱导好的骨髓基质干细胞,探讨自体骨髓基质干细胞修复受损心肌的能力。方法：12只杂种犬,依手术日期随机分为两组,Ⅰ组：对照组（6只）,仅移植与干细胞组等量的细胞培养液;Ⅱ组：移植组（6只）,移植培养好的自体骨髓基质干细胞;结扎犬冠状动脉前降支制备急性心肌梗死模型,细胞移植组将体外分离、诱导及培养的自体骨髓基质干细胞经标记后在心肌梗死后1～2 h经冠状动脉植入心脏;对照组植入等量培养液;所有动物在手术后7天、11周分别行超声心动图检查;实验完成后取犬心脏行免疫组织化学分析。结果：骨髓基质干细胞（MSSCs）移植后11周,与对照组相比,移植组左室射血分数（LVEF）明显增加（P〈0.05）。免疫组织化学检测示：移植组可以检测到5-溴脱氧尿核苷（B rdu）标记阳性细胞,对照组5-溴脱氧尿核苷（B rdu）免疫组化检测为阴性,位于5-溴脱氧尿核苷（B rdu）标记阳性细胞同一部位的连续组织切片处肌钙蛋白Ⅰ（Tropon inⅠ）染色阳性和连接蛋白43（Connexin43）染色阳性。结论：急性心肌梗死后经冠脉移植的骨髓基质干细胞（MSSCs）可改善心肌的血流灌注与代谢,改善心功能,提高左室射血分数（LVEF）。     

大鼠骨髓间质干细胞定向诱导分化为心肌细胞

目的 体外定向诱导成年大鼠骨髓间质干细胞(BMMSCs)分化为心肌细胞。方法 贴壁筛选法分离大鼠骨髓间质干细胞，进行体外扩增。10μmol／L5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导24小时，继续培养3周，免疫细胞化学染色鉴定心肌细胞。结果 5-aza诱导后3周部分细胞横纹肌肌动蛋白染色阳性，细胞密度大的视野可见连结蛋白43染色阳性的闰盘样结构。部分肌管样结构上可见明显的横纹。结论 骨髓间质干细胞是骨髓中具有自我更新和多向分化潜能的干细胞，在5-aza诱导下可分化形成心肌样细胞，有望成为细胞心肌成形术(CCM)合适的种子细胞。     

心肌内环境对骨髓干细胞转化成心肌细胞的影响的研究

目的 探讨心肌内环境对骨髓基质干细胞(MSCs)向心肌细胞转化的影响。方法 利用梯度离心法分离大鼠MSCs;然后将MSCs分别移植到正常和疤痕心肌组织中,在10d和20d时观察移植细胞的情况。结果 移植的细胞在正常心肌组织中存活并向心肌细胞转化。HE染色结果：胞浆嗜酸性,胞核居细胞中央,免疫组化染色鉴定BrdU阳性;心肌特异性抗体(肌钙蛋白和肌凝蛋白重链)结果呈阳性。在疤痕心肌组织中未见骨髓基质干细胞向心肌细胞的转化。结论 正常的心肌组织内环境能促进干细胞向心肌细胞转化,在疤痕组织中不能实现骨髓干细胞向心肌细胞的转化,因此,利用骨髓干细胞进行细胞移植时,要根据不同的治疗方法和目的,选取不同状态(诱导否)的干细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞的体外诱导分化

目的 通过体外药物诱导骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化，进一步验证其多能分化特性。方法 分离培养大鼠MSCs，5－脱氧杂氮胞苷（5－Aza－cdR）作用24h后继续培养4wk，电镜超微结构观察，免疫细胞化学染色鉴定。结果 5－Aza-cdR诱导4wk后的部分大鼠骨髓间充质干细胞α-Actinin,Troponin T阳性表达，电镜观察可见横纹样结构形成，核呈卵圆形，位于细胞中央位置，胸质中可见富集的糖原颗粒及大量线粒体。结论 MSCs是存在于骨髓中的多能干细胞，能在体外条件下经5－Aza-cdR诱导分化成心肌细胞。     

5-氮胞苷诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化观察

目的：探讨5-氮胞苷（5-aza）对纯化培养的骨髓间充质干细胞（MSCs）向心肌样细胞分化的影响.方法：取雄性Wistar大鼠下肢长骨骨髓进行体外培养和连续传代,取第3代MSCs以10 μmol/L 5-aza诱导作用24 h后,用含体积分数为5%胎牛血清的完全培养基继续培养,观察细胞形态学变化,并在4周后行免疫细胞化学染色鉴定α-Actin,Desmin及心肌特异性肌钙蛋白T（cTnT）的表达.结果：5-aza作用MSCs 7d后细胞形态及排列发生变化,14～21 d左右细胞数量较诱导前明显减少,28 d后细胞稀落,周围伸出多个长的突起,细胞体积大小不等.经抗α-Actin抗体、抗Desmin抗体、抗cTnT抗体鉴定部分细胞出现阳性染色,阳性细胞率分别为20%,19%和10%.结论：骨髓间充质干细胞在体外特定的诱导条件下可以向心肌样细胞分化,有望成为缺血性心脏病细胞移植治疗的细胞材料.     

大鼠骨髓间质干细胞定向诱导分化为心肌细胞

目的体外定向诱导成年大鼠骨髓间质干细胞(BMMSCs)分化为心肌细胞。方法贴壁筛选法分离大鼠骨髓间质干细胞,进行体外扩增。10μmol/L5-氮杂胞苷(5-aza)体外诱导24小时,继续培养3周,免疫细胞化学染色鉴定心肌细胞。结果 5-aza诱导后3周部分细胞横纹肌肌动蛋白染色阳性,细胞密度大的视野可见连结蛋白43染色阳性的闰盘样结构。部分肌管样结构上可见明显的横纹。结论骨髓间质干细胞是骨髓中具有自我更新和多向分化潜能的干细胞,在5-aza诱导下可分化形成心肌样细胞,有望成为细胞心肌成形术(CCM)合适的种子细胞。     

体外诱导兔骨髓基质细胞向心肌样细胞方向分化

目的：用兔骨髓基质细胞体外由5-氮胞苷诱导，使其定向分化，以获取心肌样细胞。方法：抽取兔骨髓后，体外培养、传代得到骨髓基质细胞，用5-氮胞苷(5-azacytidine)诱导24h，继续培养10天后，行免疫组织化学和RT-PCR鉴定。结果：诱导后部分细胞出现形态学改变，心肌特异性肌钙蛋T(cardiac isoform of Tropnin T,cTnT)、α横纹肌肌动蛋白(α-Sarcomericactin)免疫组织化学染色阳性。RT-PCR表明诱导后细胞表达心肌特异性β肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain)。讨论：骨髓间质细胞在体外5-氮胞苷诱导下部分可向心肌细胞方向分化，但分化的阳性率还不高，需要进一步研究。     

大鼠骨髓间充质干细胞向软骨、脂肪和神经元样细胞分化的研究

目的：探讨体外大鼠骨髓间充质干细胞（rMSCs）多向分化潜能。 方法：从大鼠骨髓中获得间充质干细胞,体外培养传代。通过地塞米松、TGF-β1和维生素C诱导rMSCs向软骨细胞分化,甲苯胺蓝染色和免疫细胞化学检测Ⅱ型胶原进行鉴定。通过地塞米松和胰岛素诱导rMSCs向脂肪细胞分化,采用苏丹Ⅳ染色鉴定。在含IBMX、GDNF和IL-1β的培养基中诱导rMSCs向神经元样细胞分化,免疫细胞化学方法检测神经细胞特异标志NSE和MAP-2a,b。 结果：rMSCs被诱导7 d后,分化成软骨细胞,甲苯胺蓝异染阳性、Ⅱ型胶原阳性。被诱导10 d后,分化成脂肪细胞,苏丹Ⅳ染色阳性。被诱导7 d和15 d后,分化成神经元样细胞,表达NSE和MAP-2a,b,15 d后NSE阳性率是(20.060±0.790)%,MAP-2a,b阳性率是(17.364±5.738)%。 结论：体外rMSCs被诱导分化成软骨细胞、脂肪细胞和神经元样细胞,证明其具有多向分化潜能, 是组织工程研究中最有前途的种子细胞之一。     

骨髓间质干细胞体外与阿霉素损伤的心肌细胞共培养时的定向分化

目的：研究兔骨髓间质干细胞(menseuchymal stem cells，MSCs)在体外以不同方式与阿霉素损伤后的仔鼠心肌细胞共培养时的定向分化情况，为心肌病细胞移植治疗提供基础．方法：体外分离培养兔骨髓间质干细胞，经5-氮杂胞苷诱导和DAPI标记后，与阿霉素预处理的乳鼠心肌细胞一起共培养，分别在共培养后的第14，21，28日，采用透视电镜观察超微结构，免疫细胞化学方法鉴定，并用流式细胞仪检测α-sareomeric actin阳性或DAPI和Cy3双阳性细胞所占百分比．取仅经5-氮杂胞苷诱导的的骨髓间质干细胞作为对照组．结果：21，28d时Millicell组和对照组可见小部分α-sareomeric actin、desmin阳性细胞，直接接触组内DAPI标记的MSCs细胞部分免疫荧光反应阳性．电镜观察可见横纹样结构形成，核呈卵圆形，位于细胞中央，胞质中可见富集的糖原颗粒．流式细胞仪检测结果示直接接触组中双阳性细胞百分比高于其余两组．结论：骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞，在体外病理性心肌细胞微环境中可顺利分化为心肌样细胞．同细胞液因子相比，细胞间的直接接触对MSCs的定向分化有更重要的促进作用，MSCs可与周围的心肌细胞形成某种连接．MSCs可能成为细胞移植治疗心肌病的一种新的细胞来源．     

兔骨髓间充质干细胞自体移植治疗急性心肌梗塞

目的 :了解骨髓间充质干细胞 (mesenchymalstemcells ,MSCs)在缺血心肌中转化为心肌细胞并改善心功能的可行性。方法 :结扎兔左前降支制作急性心肌梗塞 (acutemyocardiuminfarction ,AMI)模型 ,骨穿抽取骨髓 ,分离、培养、扩增骨髓间充质干细胞。术后 2周进行心肌梗塞瘢痕处移植 5 溴脱氧尿嘧啶 (Bromodeoxyuridine,Br dU)标记的骨髓间充质干细胞 ,对照组注射培养基。AMI术前、AMI术后 3d及移植后 4周做超声心动图检测心功能 ,移植后 4周用导管检查法测左室压力变化 ,随后处死动物取左室标本切片 ,采用免疫荧光方法鉴定植入细胞。结果 :细胞移植组左室切片中可见BrdU染色阳性细胞即植入细胞 ,对照组未见BrdU染色阳性细胞。超声心动图检查证实MSCs移植后 4周左室收缩末期直径 (LVESD)、舒张末期直径 (LVEDD)均小于对照组 (分别为P <0 .0 1及P <0 .0 5 ) ,小轴缩短率 (△D % )、射血分数 (EF)均大于对照组 (均为P <0 .0 1 )。导管测压显示MSCs移植组左室舒张末期压 (LVEDP)低于对照组、左室压上升及下降最大速率 (±dp/dt)高于对照组 (均为P <0 .0 1 )。 结论 :缺血心肌内注射骨髓间充质干细胞可依赖组织微环境转化为心肌细胞修复梗塞心肌 ,显著改善心功能 ,可用于心肌梗塞的治疗。     

骨髓间充质干细胞移植对猪心肌梗死后TGF-β1、MMP-1的影响

目的 研究经冠状动脉注射自体骨髓间充质干细胞对心肌梗死后左心室舒缩功能和血清TGF-β1、MMP-1的影响.方法 10只太湖梅山猪通过介入栓塞冠状动脉建立心肌梗死动物模型.随机分为移植组,梗死4周后注射MSCs;对照组,梗死4周后注射DMEM;每组5只.抽取实验猪髂骨骨髓体外分离、培养、纯化,得到MSCs,通过介入法将约1.0×107的MSCs注入梗死4周的实验猪冠状动脉栓塞远端.观察移植后1周、4周时的左心室舒缩功能变化,观察不同时点血清TGF-β1和MMP-1的含量.结果 MSCs移植后4周,+dp/dtmax、-dp/dtmax较移植前和对照组明显提高(P<0.01);干细胞移植后不同时点的血清TGF-β1含量不断减少但到2周时达谷值(P<0.01),对照组仅有轻度的下降趋势;干细胞移植后1周时的血清MMP-1含量增加,2周后达到高峰(P<0.01),而对照组则稳定维持在移植前水平.结论 经冠脉自体MSCs移植能够明显改善心肌梗死后左心室的舒缩功能,降低TGF-β1在血清中的水平,同时促进MMP-1的合成、分泌.     

丹酚酸B预处理EPCs联合BMSc移植对AMI大鼠心功能的影响

[目的]通过建立大鼠急性心肌梗死模型,将中药丹酚酸B预处理的内皮祖细胞(EPCs)按不同比例与骨髓基质细胞(BMSc)进行混合后注射至缺血局部,观察细胞移植后大鼠急性心肌梗死模型心功能的改善情况。[方法]应用密度梯度离心法和贴壁筛选法培养、纯化EPCs与BMSCs;采用结扎大鼠左冠状动脉前降支,制作大鼠急性心肌梗死模型。丹酚酸B最佳药物浓度处理的EPCs,以不同比例(1:1,2:1,4:1,8:1)与BMSc混合,在大鼠心肌梗死区周边分5点注射。[结果]各细胞移植组均能不同程度的改善心肌梗死大鼠心室结构,增强心功能。超声心动图结果:同一时间细胞移植组均能不同程度的改善心肌梗死大鼠心室结构,增强心功能,与模型组相比,4:1组、8:1组左室射血分数及心输出量明显升高(P<0.05)。[结论]丹酚酸B预处理的EPCs联合BMSc的移植促进了AMI大鼠左室功能的恢复。     

一种在体标记成体大鼠室管膜/室下区细胞的方法

目的 研究正常成体大鼠侧脑室注射DiI标记室管膜/室下区(SVZ)细胞的方法.方法 50只雄性SD大鼠随机分为5组,每组10只,均接受2 g/L的 DiI 10 μL右侧脑室注射.采用H33258染色和激光共聚焦显微镜检测DiI注射后6 h、12 h、24 h、36 h和48 h时左侧脑室壁的标记细胞以及标记组织厚度.结论 右侧脑室DiI注射后24 h,DiI标记细胞位于左侧脑室的室管膜层; DiI注射后48 h,DiI标记细胞限定于左侧室的管膜层和室下区.此外,左侧室管膜/中隔室下区(SVZspt)和室管膜/神经节隆起的生后对应物(SVZge)部位荧光标记组织的厚度分别在DiI注射12 h和24 h后维持于稳定水平,而且,在相应各时间点上,室管膜/SVZge部位荧光标记组织的厚度都厚于室管膜/SVZspt部位(P＜0.05).结论 2 g/L 的DiI 10 μL注射于正常大鼠侧脑室后24～48 h,可能仅标记室管膜/室下区细胞.     

骨髓干细胞动员对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的探讨应用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)动员大鼠自体骨髓干细胞治疗心肌梗死,对心功能的影响及其可能机制.方法用异丙肾上腺素(ISO)制作大鼠心肌梗死模型,用骨髓干细胞动员剂G-CSF动员自体骨髓干细胞释放和迁移至心肌梗死灶,于用ISO后24,48 h杀死大鼠,取出心脏;用ISO后4周,先用MPA-V多导生理仪检测大鼠血流动力学、心功能指标,随后杀死大鼠,取出心脏,通过免疫组化、HE染色和VG染色方法观察大鼠心梗灶的CD34 细胞的浸润及心肌再生、心肌纤维化的情况.结果用ISO后4周,G-CSF动员组大鼠血流动力学指标、心功能参数均比对照组改善.用ISO后24h后,动员组大鼠心梗区可见CD34 细胞浸润,并有CD34 阳性的新生心肌细胞生长,4周后瘢痕组织少,心肌纤维化程度轻,心肌基本结构得到保护.结论急性心梗发生后,应用G-CSF能动员自体骨髓干细胞向心梗灶内迁移、存活和向心肌细胞、血管内皮细胞等分化;并通过心肌再生、抑制缺血心肌纤维化和保护缺血心肌基本结构,而改善心功能.     

经心外膜向心肌移植自体骨髓单核细胞治疗急性心肌梗死的实验研究

目的 在小型猪动物模型上探讨自体骨髓单核细胞移植到心肌梗死局部对心功能和梗死心肌代谢的影响.方法 结扎小型猪冠状动脉前降支建立急性心肌梗死动物模型.分为3组:空白对照组、心肌梗死1周后处理组及心肌梗死2周后处理组,处理组经心外膜向心肌注射自体骨髓单核细胞.然后检测各项指标.结果 空白对照组与处理组心尖室间隔下部室壁增厚率差异具有统计学意义.显影细胞区域冰冻切片免疫组化测定,证实自体骨髓单核细胞分化细胞转化为心肌或内皮细胞并证实其存活增殖功能.结论 经心外膜向梗死区域的心肌移植自体骨髓单个核细胞,可以改善梗死区域心肌的收缩功能.移植的单个核细胞可以在梗死区域中存活,增殖,分化和迁移,增加梗死区域的微血管数量,再生、再造心肌.     

BrdU标记的骨髓来源间充质干细胞在心脏移植部位数量的变化

目的 :观察BrdU对骨髓来源间充质干细胞的标记率及移植后的骨髓来源间充质干细胞在心脏移植部位不同时间中的数量变化情况。方法 :酶标仪分别测出骨髓来源间充质干细胞及BrdU阳性间充质干细胞光密度值 ,计算标记率。将经BrdU标记后的骨髓来源间充质干细胞注射入冠状动脉左前降支中段结扎处的大鼠左心室壁内 ,术后第 5、10、15、2 0天行抗BrdU抗体免疫组织化学染色。结果 :BrdU对骨髓来源间充质干细胞的标记率约为 4 1.4 1%。移植后第 5天BrdU阳性细胞数多于移植后第 10天 (P <0 .0 5 ) ,而移植后第15、2 0天与第 10天相比BrdU阳性细胞数无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论 :BrdU能对骨髓来源间充质干细胞起到较好的标记和“跟踪”作用 ,移植入心脏壁内的间充质干细胞数量第 10天比第 5天减少 ,以后基本稳定的变化过程。     

Chemokine stromal cell-derived factor 1/CXCL12 increases homing of mesenchymal stem cells to injured myocardium and neovascularization following myocardial infarction

Background Heart failure due to ischemic heart disease is still a major health problem. Myocardium regeneration emerges as a novel therapeutic method for treating myocardial infarction （MI）. However, it is affected by many factors. The present study was aimed to investigate the effect of chemokine stromal cell-derived factor 1 （SDF-1）/CXCL12 on mesenchymal stem cells （MSCs） homing to injured myocardium in a rat myocardial infarction model. Methods A rat myocardial infarction model was established by permanent left anterior descending branch ligation. Mesenchymal stem cells from donor rats were cultured in IMDM and labeled with bromodeoxyuridine. The rats were divided into two groups. SDF-1 expression was measured by in situ hybridization and immunohistochemistry in the sham operated or infarcted hearts at 1, 2, 4, 7, 14 and 28 days post operation in the SDF-1 detection group. The rats in the intervention groups were injected with SDF-1, anti-SDF-1 antibody or saline 4 days after myocardial infarction. Then, a total of 5×10^6 cells in 2.5 ml of phosphate-buffered saline were injected through the tail vein. The number of the labeled MSCs in the infarcted hearts was counted on the 3rd day post injection. Cardiac function and blood vessel density were assessed on the 28th day post injection. Results Self-generating SDF-1 expression was increased at the first day post MI, peaked at the 7th day and decreased thereafter while it remained unchanged in sham operated hearts. The MSCs enrichment in the host hearts were more abundant in the MI groups than in the non-MI group （P=0.000）; the MSCs enrichment in the host hearts were more abundant in the SDF-1 injected group than in the anti-SDF-1 antibody and saline injected groups （P = 0.000）. Cardiac function was improved more in the SDF-1 injected group than in the anti-SDF-1 antibody and saline injected groups （P = 0.000）. Neovascularization in the SDF-1 injected group increased significantly compared to the other groups （P= 0.000）. Conclusion Myocardial SDF-1 expression was increased only in the early phase post MI. SDF-1 may enhance MSCs homing to the injured heart and improve cardiac function by promoting neovascularization. Chin Med J 2009; 122（2）： 183-187     

移植的间充质干细胞与宿主心肌匹配整合实验研究

目的 探索间充质干细胞(MSCs)分化的心肌样细胞与宿主心肌匹配的解剖结构基础.方法 采用成年近交系Wistar大鼠,经左冠状动脉前降支结扎1 h建立心肌缺血再灌模型.术后1周,将来自同种供体、经体外扩增和Rt-GFP转染MSCs后植入梗死区.移植后4周测定心脏功能.随后取材、连续冰冻切片,观察心肌组织形态学的变化及MSCs分化的心肌样细胞缝隙连接(Connexin-43)的表达.结果 植入梗死区中的MSCs表达Connexin-43.移植组梗死区面积缩小,左心室壁厚度增加,心脏功能改善.结论 移植的MSCs通过分化为心肌样细胞,并与宿主心肌细胞形成电机械匹配结构即缝隙连接(Connexin-43),使新增加的心肌细胞能够与宿主心肌同步收缩,从而更有效改善心脏功能.     

Monocyte chemotactic protein 1 increases homing of mesenchymal stem cell to injured myocardium and neovascularization following myocardial infarction

Objective：To investigate the effect of MCP-1 on mesenchymal stem cells（MSCs） homing to injured myocardium in a rat myocardial infarction（MI） model. Methods：Rat myocardial infarction model was established by permanent left anterior descending branch ligation. Mesenchymal stem cells from donor rats were cultured in IMDM and labeled with BrdU. The Rats were divided into two groups. Monocyte chemotactic protein I（MCP-1） expression were measured by in situ hybridization and immunohistochemistry in the sham operated or infarcted hearts at 1, 2, 4, 7, 14 and 28 days post operation in MCP-1 detection group. The rats were injected with MCP-1, anti-MCP-1 antibody or saline 4 days after myocardial infarction in intervention group. Then, a total of 5 × 10^6 cells in 2.5 ml of PBS were injected through the tail vein. The number of the labeled MSCs in the infarcted hearts was counted 3 days post injection. Cardiac function and blood vessel density were assessed 28 days post injection. Results：Self-generating MCP-1 expression was increased at the first day, peaked at the 7^th day and decreased thereafter post MI and remained unchanged in sham operated hearts. The MSCs enrichment in the host hearts were more abundant in the MI groups than that in the non-MI group（P= 0.000）, the MSCs enrichment in the host hearts were more abundant in the MCP-1 injected group than that in the anti-MCP-1 antibody and saline injected groups （P = 0.000）. Cardiac function was improved more in MCP-1 injected group than anti-MCP-1 antibody and saline injected groups（P= 0.000）. Neovascularization in MCP-1 injected group significantly increased compared with that of other groups（P = 0.000）. Conclusion： Myocardial MCP-1 expression was increased only in the early phase post MI. MCP-1 may enhance MSCs homing to the injured heart and improve cardiac function by promoting neovascularization.