光动力疗法对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响

目的 研究血卟啉衍生物(hematoporphyrin derivative,HPD)介导的光动力作用(photodynamic therapy,PDT)对人胆管癌细胞QBC939凋亡的影响及其作用机制.方法 体外培养人胆管癌QBC939细胞株,用不同浓度HPD处理,并用半导体激光治疗仪不同强度光照后,应用CCK8法检测PDT对QBC939细胞生长的相对抑制率.采用流式细胞术检测PDT作用前后QBC939细胞凋亡情况.应用RT-PCR检测PDT作用前后QBC939细胞中血管内皮细胞生长因子-C (VEGF-C)、环氧合酶-2 (COX-2)基因表达情况.用SP免疫细胞化学法测定PDT作用前后QBC939细胞质中VEGF-C、COX-2两种蛋白表达情况.用ELISA法测定PDT作用前后QBC939细胞上清中VEGF-C、COX-2两种蛋白分泌情况.结果 HPD-PDT在体外能够抑制QBC939细胞生长,HPD 10 mg/L经5 J/cm2光照强度时,实验组与空白组A值差异有统计学意义(P＜0.05),细胞生长抑制率达到70％.继续增加药物浓度或光照剂量,差异无统计学意义,细胞存活率降低不明显.流式细胞术显示HPD-PDT明显促进QBC939细胞早期凋亡.RT-PCR显示HPD-PDT能明显抑制QBC939细胞中VEGF-C、COX-2基因表达.SP免疫细胞化学法显示HPD-PDT能抑制QBC939细胞质中VEGF-C、COX-2两种蛋白表达.ELISA法显示HPD-PDT能抑制QBC939细胞VEGF-C、COX-2两种蛋白细胞外分泌.结论 HPD-PDT能抑制胆管癌QBC939细胞生长,促进胆管癌细胞早期凋亡.HPD-PDT对胆管癌QBC939细胞生长的抑制作用可能是通过促进早期凋亡实现的,而VEGF-C、COX-2从基因到蛋白水平低表达可能是促进胆管癌QBC939细胞早期凋亡的途径.     

Survivin 抑制人胆管癌细胞凋亡相关信号通路的实验研究

目的:探讨survivin基因对人胆管癌细胞凋亡信号通路的调节机制.方法:构建针对survivin基因的siRNA和对照siRNA,将QBC939人胆管癌细胞分为3组,分别为siRNA-survivin转染组,对照siRNA转染组和未转染组.转染后,首先用Western blot检测未转染QBC939细胞和QBC939/siRNA(-)细胞及QBC939/siRNA(+)细胞中survivin的表达,验证干扰效果,继而分别用流式细胞仪,激酶活性测定和Western blot检测以上3种状态的QBC939细胞的凋亡情况,caspase-3的活性和caspase-3,caspase-9及procaspase-9凋亡信号分子的表达.结果:QBC939/siRNA(+)细胞survivin蛋白表达量明显低于未转染的QBC939细胞(P＜0.05),而QBC939/siRNA(-)细胞survivin蛋白表达量无明显改变(P＞0.05).与未转染的QBC939细胞比较,QBC939/siRNA(+)细胞凋亡明显增加,caspase-3活性明显升高,caspase-3和caspase-9表达明显上调,而procaspase-9表达降低(均P＜0.05);上述指标在QBC939/siRNA(-)细胞与未转染的QBC939细胞间的差异无统计学意义(均P＞0.05).结论:survivin基因可能通过促进procaspase-9的活化阻止caspase-3和caspase-9的激活,从而抑制胆管癌细胞的凋亡.     

LY294002对胆管癌细胞凋亡的影响

目的：观察PI3-Kinase抑制剂LY294002对人胆管癌细胞QBC939的作用。
方法：MTT法检测LY294002对QBC939细胞的生长抑制作用;流式细胞术检测LY294002诱导的细胞凋亡;免疫印迹法分析LY294002对于PI3-K/Akt信号通路中Akt磷酸化及caspase9的表达作用。
结果：LY294002可抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,促进其凋亡。Western-blotting显示,LY2940022可抑制Akt磷酸化水平,促进caspase3,9的蛋白表达。
结论：LY294002可通过抑制Akt信号通路的活性,上调促凋亡分子caspase3,9的表达,抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,诱导其凋亡。

     

siRNA下调NF-κB p65 基因表达影响人胆管癌QBC939细胞凋亡

目的运用RNA干扰技术下调胆管癌细胞株QBC939中核转录因子κB(NF-κB)p65基因表达对其肿瘤细胞生长的抑制作用。方法以阳离子脂质体Lipofectamine TM 2000作为转染试剂,将体外合成的人NF-κB p65的siRNA转染入胆管癌细胞QBC939。RT-PCR测定细胞内NF-κB p65 mRNA的表达。用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测NF-κB亚单位p65的DNA结合活性的改变。运用免疫组化、流式细胞仪、激光共聚焦法检测p65基因表达下调对QBC939细胞凋亡的影响。结果体外合成的人NF-κB p65 siRNA有效抑制了QBC939细胞中NF-κB p65 mRNA的表达(P0.01),同时ELISA结果显示,靶向NF-κB p65 siRNA组的p65亚单位与DNA结合活性明显低于对照组(P0.05),免疫组化DAPI核染色、流式细胞仪及激光共聚焦检测观察显示下调p65基因表达能够诱导QBC939细胞凋亡。结论 NF-κB p65的siRNA在胆管癌细胞QBC939调控方面起重要作用,通过沉默其表达可诱导胆管癌细胞凋亡抑制其生长增殖。     

华蟾素对人胆管癌细胞系QBC939的作用

目的：探讨华蟾素对人胆管癌细胞株QBC939的抑制作用及可能的作用机制。方法：流式细胞仪检测华蟾素对QBC939细胞凋亡的作用，RT—PCR法研究华蟾素对人胆管癌细胞株QBC939Fas及caspase-3mRNA表达变化的影响。结果：不同浓度华蟾素作用于QBC939细胞48h后，流式细胞仪分析显示，凋亡细胞明显增多，与对照组相比有显著性（P〈0．001）。RT—PCR结果显示：leas、caspase-3mRNA表达实验组与对照组相比增强（P〈0．001）。结论：华蟾素作用于人胆管癌细胞株QBC939，促进其细胞凋亡，而这一作用的实现可能与Fas及caspase-3mRNA表达的上调有关。     

GABA对胆管癌细胞株QBC939增殖及凋亡的影响

目的观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞QBC939增殖及凋亡的影响。方法采用MTT比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,流式细胞术检测GABA对胆管癌细胞QBC939凋亡及其细胞周期的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量。结果GABA抑制胆管癌细胞的增殖,呈剂量依赖性,流式细胞仪检测结果显示,随药物浓度增加,细胞凋亡率显著增加(4.8%增至28.03%,P<0.05),同时促进胆管癌细胞内cAMP含量的增加。结论GABA抑制胆管癌细胞QBC939增殖,诱导细胞凋亡,可能机制是通过受体后信息介导的。     

γ-氨基丁酸抑制胆管癌细胞株QBC939增殖及其机制的研究

目的 观察γ-氨基丁酸(GABA)对胆管癌细胞QBC939增殖、凋亡和端粒酶活性的影响.方法 采用MTT比色法观察GABA对人系胆管癌细胞QBC939增殖的作用,流式细胞术检测GABA对胆管癌细胞QBC939凋亡的影响,PCR-ELISA法观察其对QBC939细胞端粒酶活性的影响,放射免疫分析法检测cAMP含量.结果 GABA抑制胆管癌细胞的增殖(抑制率由2.6%增至26.8%,P<0.05),促进细胞凋亡(凋亡率由4.8%增至28.03%,P<0.05),并且抑制癌细胞中端粒酶的活性(0.82±0.048 vs 0.56±0.054,P<0.05),同时促进胆管癌细胞内cAMP含量的增加[(0.59±0.049)nmol/L vs (0.82±0.033)nmol/L,P<0.05].结论 GABA可能通过受体后信息介导途径,诱导细胞凋亡,并抑制癌细胞端粒酶活性,从而抑制胆管癌细胞的增殖.     

5-氮-2-脱氧胞苷体内外抑制胆管癌细胞生长的研究

目的研究甲基化抑制剂 5 氮 2 脱氧胞苷在体内、体外对胆管癌细胞株生长的抑制作用。方法应用MTT法检测 5 氮 2 脱氧胞苷及其他抗肿瘤药物对胆管癌细胞株QBC939存活率的影响 ,应用流式细胞术观察细胞生长周期及凋亡率的变化。观察 5 氮 2 脱氧胞苷对裸鼠皮下移植肿瘤生长的影响。结果 5 氮 2 脱氧胞苷抑制胆管癌细胞QBC939的增殖 ,细胞周期阻滞于G1期 ,凋亡增加。以上作用与药物浓度及所用时间在一定范围内呈正相关。 5 氮 2 脱氧胞苷与其他肿瘤化疗药物协同可增强对胆管癌细胞的杀伤作用。经 5 氮 2 脱氧胞苷处理后 ,QBC939在裸鼠体内成瘤率下降 ,肿瘤体积缩小。结论 5 氮 2 脱氧胞苷诱导胆管癌细胞凋亡 ,抑制肿瘤生长 ,与其他肿瘤化疗药物有协同作用。     

外源性IL-6对胆管癌细胞的抗凋亡作用及其对Bcl-2 mRNA的调控

目的观察外源性IL-6对胆管癌细胞系QBC939凋亡及对Bcl-2 mRNA表达的影响。方法用MTT法检测外源性IL-6对胆管癌细胞QBC939的促增殖作用;通过annexin V/FITC和PI染色、流式细胞分析检测外源性IL-6对QBC939细胞凋亡的影响,RT-PCR测定Bcl-2 mRNA的表达。结果外源性IL-6能刺激QBC939细胞增殖,且QBC939细胞增殖与IL-6浓度呈正相关(r=1);外源性IL-6处理后,凋亡率显著低于对照组(P0.05),外源性IL-6处理细胞后Bcl-2 mRNA显著高于对照组(P0.05)。结论外源性IL-6在一定剂量范围内促进QBC939细胞生长,并抑制QBC939细胞凋亡;而此作用可能与上调Bcl-2 mRNA表达有关。     

PTEN基因联合奥沙利铂对胆管癌细胞生长抑制的研究

目的探讨脂质体介导PTEN基因转染人胆管癌细胞（QBC939）,联合化疗药物奥沙利铂（L-OHP）,分别进行人胆管癌细胞体外培养和体内接种生长,观察分析该基因对胆管癌细胞生长的抑制情况,探索人类胆管癌的生物治疗的可行性和方法.方法将携带PTEN基因的真核表达载体pBP-PTEN和不含该基因的空载体.转胆管癌QBC939细胞,嘌呤霉素抗性筛选克隆、扩增培养.绘制细胞生长曲线及MTT细胞活性观察;利用免疫组化检测转染前后PTEN阳性表达率;透射电镜扫描观察转染前后及联合奥沙利铂后细胞的超微结构变化;流式细胞分析细胞的周期变化和细胞凋亡情况;体外细胞侵袭力抑制试验;裸鼠体内肿瘤生长,病理学及电镜扫描的观测.结果PTEN基因转染后QBC939细胞稳定表达,阳性表达率升高（P＜0.05）;肿瘤细胞活性下降（P＜0.05）,细胞周期G1～S期抑制,细胞凋亡率增加（P＜0.01）;透射电镜细胞较成熟、分化好;细胞侵袭力明显抑制（P＜0.05）;裸鼠体内肿瘤未转染组生长早,加入奥沙利铂后生长受抑制（P＜0.05）,病理证实为腺癌.结论1.脂质体成功将PTEN基因转染人胆管癌QBC939细胞,并稳定表达.2.PTEN基因转染后细胞生长速度无明显变化;MTT实验活性细胞数有所下降.3.转PTEN基因后的胆管癌细胞超微结构变化显示线粒体增多,细胞较成熟、分化好;流式细胞议分析,细胞周期G1期被抑制,细胞凋亡多,侵袭力受到抑制;4.接种转PTEN基因裸鼠的体内成瘤显著抑制;6.转基因的生物治疗联合奥沙利铂（L-OHP）对人胆管癌细胞生长具有显著的抑制作用.     

重组腺病毒介导的突变型P27kip1基因对胆管癌细胞化疗增敏机制的研究

目的 探讨通过重组腺病毒转导突变型P27kip1至人胆管癌细胞系QBC939中,观察对胆管癌细胞化疗敏感性的影响并探讨可能的机制.方法 重组腺病毒载体Ad-P27mt转染人胆管癌细胞系QBC939,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)﹑Western blot检测P27kip1在胆管癌细胞中的表达;流式细胞术检测细胞周期.通过噻唑蓝比色法及流式细胞仪检测5-氟尿嘧啶(5-FU)﹑丝裂霉素(MMC)﹑环磷酰胺(CTX)对转染P27kip1前后的QBC939细胞生长抑制及凋亡的影响.结果 Ad-P27mt转染人胆管癌细胞系QBC939后,5-FU、MMC和CTX对QBC939细胞生长抑制率分别由41.89%、45.59%和38.91%明显升高为56.15%、55.65%和51.69%;凋亡率也由13.76%±3.03%(5-FU)、11.76%±3.99%(MMC)和10.46%±2.10%(CTX)明显升高为41.39%±4.32%(5-FU)﹑35.94%±2.71%(MMC)和34.46%±2.32%(CTX),差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 突变型P27kip1能显著增强胆管癌细胞对化疗药物的敏感性,为靶向调控细胞周期联合化疗药物治疗胆管癌提供了参考依据.     

Oddi括约肌成型术后患者胆汁促增殖活性的探讨

目的　观察经十二指肠Oddi括约肌成型术 (TS)后患者胆汁 (TSB)对人胆管癌细胞QBC 93 9生长的影响 ,探讨TS与胆管癌发生与发展的关系。方法　应用四唑蓝 (MTT)比色法检测 12份TSB和10份正常胆汁 (NB)对QBC93 9细胞增殖的影响 ,应用流式细胞仪测定细胞周期和凋亡。结果　TSB与NB比较 ,前者明显促进QBC 93 9细胞增殖 (P <0 .0 5 ) ;TSB处理 2 4h的QBC93 9细胞增殖指数显著上升 (P <0 .0 5 )。结论　TSB具有潜在的促增殖活性 ,TS与胆管癌的发生与发展关系密切。     

埃罗替尼和塞来昔布抑制胆管癌生长和血管生成

目的:观察表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂埃罗替尼与环氧合酶(COX-2)抑制剂塞来昔布对胆管癌荷瘤裸鼠的肿瘤生长协同抑制作用。方法:联合EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-selective tyrosine kinaseinhibitor,EGFR TKI)埃罗替尼和COX-2抑制剂塞来昔布作用于胆管癌细胞株QBC939荷瘤裸鼠,评价药物体内作用效果。结果:埃罗替尼、塞来昔布联合用药显著抑制肿瘤生长,与对照组、埃罗替尼、塞来昔布单药组相比,均有显著性差异。抑制肿瘤生长的作用伴随EGFR下游活性蛋白p-MAPK的下调和VEGF、Ki-67表达的降低。肿瘤组织微血管密度降低。结论:埃罗替尼、塞来昔布抑制胆管癌荷瘤生长,抑制肿瘤细胞增殖,同时抑制肿瘤新生血管。两者具协同作用。靶向抑制EGFR和COX-2通路可以作为胆管癌的潜在治疗方法。     

人类肝门部胆管癌裸鼠瘤株的建立及其生物学特性研究

目的建立人肝门部胆管癌裸鼠瘤株模型。方法将人肝门部胆管癌标本进行细胞培养,传代。收集第40代、50代瘤细胞接种于4只裸小鼠皮下,并传至5代。各代瘤株行系列检查并与人肝门部胆管癌标本进行比较,观察肿瘤病理结构;采用实体肿瘤体外直接分散法制备染色体;透射电子显微镜观察癌细胞超微结构特点;酶联免疫定量检测法检测糖链抗原19-9(CA19-9)、糖链原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)及甲胎蛋白(AFP);免疫组织化学(SABC)法测定血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长子(bFGF)、增殖细胞核抗原(PCNA)、bcl-2及P53蛋白。结果原代移植成功率为25%(1/4),传代移植成功率为100%。各代肿瘤外观与原代移植瘤相同,呈低分化腺癌表现。染色体主流范围为69～81条。电子显微镜显示符合恶性肿瘤的特点。细胞内CA19-9>240U/ml,CA125>500U/ml,CEA为54.23ng/ml,AFP为13.92ng/ml,血清中此四项均为阴性。VEGF、bFGF、PCNA、bcl-2及P53蛋白表达强度均为“++”。结论第5代肝门部胆管癌裸鼠瘤株可以作为人肝门部胆管癌的动物模型,为胆管癌的基础研究及治疗提供了实验平台。     

通过核转录因子-кB诱导基质金属蛋白酶的表皮生长因子对胆管癌细胞侵袭的影响

目的探讨表皮生长因子通过核转录因子(NF)-кB诱导基质金属蛋白酶促进胆管癌细胞侵袭的机制。方法检测胆管癌细胞株HuCCT1在表皮生长因子(EGF)同浓度下的细胞侵袭力及细胞增殖情况；采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)及Western blot分析方法,检测基质金属蛋白酶(MMP)-2及MMP-9在不同EGF浓度下的基因和蛋白表达；采用凝胶电泳迁移率试验(EMSA)检测NF-кB在不同EGF浓度下的活性。结果随着EGF浓度的增加,胆管癌细胞株HuCCT1侵袭细胞数也随之增加,具有明显的浓度依赖性。而EGF浓度的变化对HuCCT1细胞的增殖无明显影响。EGF明显上调HuCCT1细胞中MMP-9的mRNA和蛋白表达水平,MMP-2不受影响。EGF增强NF-кB的活性；PDTC和布洛芬明显抑制EGF诱导的HuCCT1细胞侵袭力。结论EGF能够增强胆管癌细胞的侵袭力,其增强的侵袭力可能是通过NF-кB信号传导路径,激活MMP-9而实现的。     

靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响

目的：探讨靶向survivin的shRNA对人胆管癌细胞体外增殖及凋亡的影响。方法：合成具有互补序列的能够编码短发卡RNA（shRNA）的双链寡核苷酸并构建pSilencer2．1真核表达质粒,经稳定转染QBC939细胞后对转基因后胆管癌细胞的生物学行为进行观察。结果：neo基因稳定表达于转染阳性质粒及阴性对照质粒的QBC939细胞中。通过RT—PCR及westernblot检测证实shRNA在mRNA及蛋白质水平抑制survivin表达率分别达68固％和613％。细胞计数及平板克隆形成实验显示转染细胞生长速度及细胞克隆明显减缓（P〈O．01）。流式细胞术测定细胞周期显示转染细胞G1期细胞明显增多,S期细胞明显减少。DNAladder、透射电镜观察及流式细胞定量研究显示转染细胞凋亡明显增多。结论：靶向survivin的shRNA能有效抑制目的基因的表达,通过增加细胞凋亡在体外抑制人胆管癌细胞的生长,为胆管癌的基因治疗提供一定的实验基础。     

塞来昔布(celecoxib)通过前列腺素E2途径影响胆管癌细胞株生长和凋亡

目的：研究塞来昔布（celecoxib)对环氧合酶－2（COX－2）高表达人胆管癌细胞系QBC939和COX－2低表达人胆管癌细胞系SK－Cha-1生长和凋亡的影响及其作用机制。方法：采用四唑盐（MTT）比色法检测细胞增殖，光镜和电镜形态学观察，末端脱氧核苷酸转移酶介导的原位酶标记法（TUNEL）计数细胞凋亡，流式细胞仪测定细胞周期，酶联免疫吸附测定（ELISA）检测前列腺素E2（PGE2）含量。结果：塞来昔布抑制QBC939生长和诱导调亡，这种抗增殖作用能被PGE2拮抗；塞来昔布对结构性低表达COX－2胆管癌细胞SK－Cha-1无显著性作用。结论：塞来昔布通过PGE2途径抑制人胆管癌细胞生长和诱导凋亡。针对COX－2结构性高表达肿瘤塞来昔布可能是一种有效的化学治疗和化学预防药物。     

Gastrin/CCK与胆管癌细胞bcl-2/bax蛋白表达的关系

目的 初步探讨Gastrin/CCK对胆管癌细胞bcl-2/bax蛋白表达的调节作用。方法 原位杂交和免疫组化分别检测Gastrin/CCK受体mRNA和bcl-2/bax蛋白在40例胆管癌组织标本中的表达、分析两者间关系,流式细胞术研究Gastrin/CCK及其受体拮抗剂对QBC939人胆管癌细胞系bcl-2/bax蛋白表达的影响。结果Gastrin/CCK受体 mRNA和bcl-2/bax蛋白在胆管癌组织和细胞系中均有表达;Gastrin/CCK-B受体阳性胆管癌标本bcl-2表达率高于其阴性者（P<0.01）;Gastrin-17或CCK-8S（10~（-8）mol·L~（-1）×48h）能刺激QBC939细胞bcl-2表达、同时加入L365,260或 L364,718（10~（-8）mol·L~（-1））可逆转,CCK-SS还能抑制bax表达、L364,718可逆转（P<0.01或P<0.05）。结论Gastrin/CCK可通过其受体后途径上调胆管癌细胞bcl-2表达,“CCK→CCK-A受体”信号还可能具有抑制bax表达的作用。     

幽门螺杆菌感染的成石胆汁促进人胆管癌细胞增殖的研究

目的探讨幽门螺杆菌感染的成石胆汁对人胆管癌细胞QBC939生长的影响，阐明幽门螺杆菌感染与胆管癌发生、发展的内在关系。方法应用噻唑蓝比色法检测20份幽门螺杆菌阳性胆管结石患者胆汁、20份幽门螺杆菌阴性胆管结石患者胆汁以及20份正常胆汁对QBC939细胞增殖的影响，运用流式细胞仪测定细胞周期与凋亡。结果与幽门螺杆菌阴性胆管结石患者胆汁和正常胆汁比较，幽门螺杆菌感染的成石胆汁明显促进QBC939细胞增殖（P〈0.05），用幽门螺杆菌感染的成石胆汁处理48h的QBC939细胞增殖指数显著上升（P〈0.01），S期细胞比例明显增高（P〈0.05），G0／G1期细胞比例明显降低（P〈0．05）。结论幽门螺杆菌感染的成石胆汁具有强大的潜在促增殖活性，胆道幽门螺杆菌感染与胆管癌的发生、发展关系密切。