PCR-MASA检测胰腺癌外周血K-ras基因点突变的研究

目的了解胰腺癌外周血中K-ras基因点突变检测的临床价值.方法采用PCR-MASA法检测胰腺癌患者外周血中K-ras基因点突变.结果胰腺癌外周血标本中K-ras基因点突变率为38.1%(8/21),而所有被检测的急、慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、十二指肠乳头癌、胆管癌及胆石症患者外周血标本均无K-ras基因突变.结论(1)PCR-MASA方法简捷、特异、敏感,扩增产物只需常规电泳、染色即可观察结果,无需酶切、杂交、放射性和非放射性显影;(2)对外周血标本检测K-ras基因第12位密码子有无突变,具有临床实用性,有助于判断胰腺病变良恶性及胰腺癌的早期诊断.     

K-ras基因点突变对胰腺癌的诊断价值

背景传统的放射或超声检查早期诊断胰腺癌非常困难.目的研究胰腺良、恶性病变中的K-ras基因12密码子点突变情况,探讨K-ras基因点突变对早期胰腺癌的诊断价值.方法取23例胰腺癌和12例胰腺良性病变标本,经DNA提取后,行半巢式聚合酶链反应(PCR),扩增产物借助聚丙烯酰胺凝胶电泳检测有无K-ras基因点突变.结果胰腺癌和胰腺良性病变石蜡包埋组织的K-ras基因12密码子点突变率分别为65.2%(15/23)和33.3%(4/12)(P＜0.05).结论K-ras基因12密码子点突变的检测可能有助于胰腺癌,尤其是早期胰腺癌的诊断.     

顺序特异性引物法快速检测胰腺癌K—ras基因点突变

目的：研究简捷、特异、敏感的检测胰腺癌K－ras基因点突变的方法及其在胰腺疾病中定性诊断的价值。方法：采用针对K－ras基因点突变方式（CGT、GAT、GTT）设计的顺序特异性引物（SSP），先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液进行多聚酶链反应（PCR），扩增产物借助常规电泳和染色检测有无K－ras基因突变及突变方式。结果：胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液中K－ras基因点突变率分别为74．2％、95．1％、91．4％及94．1％，而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、十二指肠乳头癌及外伤胰腺的组织标本和胰液标本均无K－ras基因突变发生。结论：该检测法简便、快速、特异、敏感，具有临床实用性，可以作为鉴别胰腺肿块良恶性和诊断胰腺癌的一种方法。     

胰腺癌正反义K—ras基因片段的分离和定向克隆

目的 分离及克隆胰腺癌基因组中K—ras基因片段，构建重组正反义K-ras基因逆转录病毒载体并探讨其临床意义。方法 设计两对PCR引物，分别在上下游引物中引进BamHl和EcoRl位点，以胰腺癌细胞基因组DNA为模板扩增K—ras基因外显子4B及侧翼序列，并采用重组DNA技术将目的基因分别定向插入逆转录病毒载体LZRSpBMN—Z中。重组克隆通过菌液PCR和重组质粒限制性内切酶酶切鉴定。结果 正反义K—ras基因外显子4B及侧翼序列成功地克隆入LZRSpBMN—Z中。结论 LZRSpBMN—Z是胰腺癌反义基因治疗中新型候选载体之一。应用PCR方法获取反义K—ras基因方便可行，可用于重组反义K—ras基因逆转录病毒载体的构建。     

喉癌组织中ras基因点突变的研究

近年来的分子生物学研究发现 ,多种癌基因在人类恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用 ,癌基因 ras(包括 H- ras、N- ras、K- ras)就是研究较多的一种基因 ,它对人类多种恶性肿瘤具有重要影响作用。为探讨 ras基因突变在喉肿瘤生物学行为中的作用 ,我们采用 PCR- RFLP方法检测     

应用PCR—SSCP银染技术检测HBV基因点突变

目的：为了对乙型肝炎患者HBV基因突变进行大大面积筛检,建立简便 可靠的检测HBV基因突变的方法。方法：采用单链构象多态性（SSCP）银染技术,检测HBV Pre-C基因突变。结果：在10份HBeAg阳性标本中,有8份PCR阳性,SSCP显示有2份标本有HBV Pre-C基因突变,直接测序证实为非终止密码突变。48份抗－HBe阳性标本中,有12份为PCR阳性,有8份SSCP显示PCR产物单链泳运动状态异常,其中4份标本经直接测序证实在1898位发生了G→A变异,出现了TAG终止密码突变。结论：PCR－SSCP银染技术检测HBV Pre-C基因点突变有很高的特异性和敏感性,该方法稳定、简便、快速,能基本满足临床大面积大样本筛检的需要。     

胰腺癌组织K-ras基因第12密码子突变的定量检测

目的 检测胰腺癌及相应癌旁组织K-ras基因第12密码子的突变量,分析其与胰腺癌临床病理参数的关系.方法 应用肽核酸(peptide nucleic acid,PNA)钳制双荧光标记探针的实时定量PCR法检测93例胰腺癌组织及其癌旁组织中K-ras基因第12密码子的突变拷贝数,以突变百分率表示突变量.K-ras基因突变百分率=K-ras突变型拷贝数/(K-ras野生型拷贝数+K-ras突变型拷贝数)×100%.结果 胰腺癌及其癌旁组织的K-ras基因第12密码子突变率分别为83.9%和65.6%,相差显著(P＜0.05);它们的突变量分别为(13.385±1.745)%和(2.246±0.728)%,相差亦显著(P＜0.05).K-ras基因第12密码子突变量与临床病理参数无关.结论 胰腺癌及相应癌旁组织不仅存在K-ras基因突变率的差异,亦存在K-ras基因突变量的差异.     

顺序特异性引物法快速检测胰腺癌K-ras基因点突变

目的研究简捷、特异、敏感的检测胰腺癌K ras基因点突变的方法及其在胰腺疾病中定性诊断的价值.方法采用针对K ras基因点突变方式(CGT、GAT、GTT)设计的顺序特异性引物(SSP),先后对胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液进行多聚酶链反应(PCR),扩增产物借助常规电泳和染色检测有无K-ras基因突变及突变方式.结果胰腺癌石蜡包埋组织、冰冻新鲜组织、细针穿刺组织及胰液中K-ras基因点突变率分别为74.2%、95.1%、91.4%及94.1%,而所有被检测的慢性胰腺炎、胰岛素瘤、壶腹癌、胆管癌、十二指肠乳头癌及外伤胰腺的组织标本和胰液标本均无K ras基因突变发生.结论该检测法简便、快速、特异、敏感,具有临床实用性,可以作为鉴别胰腺肿块良恶性和诊断胰腺癌的一种方法.     

胰腺癌患者胰液中K-ras基因突变的检测及其意义

目的 通过对经逆行胰胆管造影（ＥＲＣＰ）所获胰液的Ｋ－ｒａｓ基因突变检测,以探索胰腺癌诊断的新方法。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）－限制性片段长度多态性的方法检测胰腺良、恶性疾病组织物、胰液上清和细胞的Ｋ－ｒａｓ突变。结果 胰腺癌和胰腺良性疾病标本分别有７１％（１５／２１）,而胰腺良性疾病无一例有Ｋ－ｒａｓ的突变。用胰液细胞有４％ＰＣＲ未能获得成功,胰腺癌胰液细胞Ｋ－ｒａｓ的突变率为６５％（１１     

肿瘤标志物、K-ras和p53突变对胰腺癌诊断的价值

目的评价血清肿瘤标志物CA19-9、CA242、CA50、癌胚抗原和粪便K-ras以及p53基因突变对胰腺癌诊断的价值。方法收集2002年2月至2004年3月在北京协和医院、中国医学科学院肿瘤医院和沈阳军区总医院确诊的新发胰腺癌患者136例,良性消化系统疾病患者240例,进行血清肿瘤标志物和粪便K-ras、p53基因突变的检测。根据结果绘制不同检测方法的受试者工作特征(ROC)曲线,计算ROC曲线下面积,并确定最佳阳性分界值。结果血清CA19-9和CA242的ROC曲线下面积分别为0·855±0·031(95%可信区间0·794~0·916)和0·859±0·031(95%可信区间0·799~0·920),最佳阳性分界值分别为68U/ml和25U/ml,其诊断胰腺癌的敏感性分别为84·4%(98/116)和88·4%(84/95),特异性分别为84·3%(145/172)和79·1%(144/182)。粪便K-ras和p53基因突变诊断胰腺癌的敏感性分别为77·8%和27·8%,特异性分别为82·2%和95·2%。将粪便K-ras和p53基因突变与血清CA19-9和CA242测定相结合计算胰腺癌诊断评分,绘制有序分类资料的ROC曲线,其曲线下面积为0·946±0·017(95%可信区间0·912~0·980),最佳阳性分界值为2分。结论血清CA19-9及CA242对胰腺癌诊断具有相似价值;联合粪便K-ras及p53突变的检测,通过胰腺癌可能性积分,可以显著提高胰腺癌的诊断效率。     

胰腺超声内镜细针穿刺活检物中K—ras基因定量检测对胰腺癌诊断价值的研究

目的比较不同胰腺超声内镜细针穿刺物中K—ras突变定量值,评价其对胰腺癌辅助诊断的价值。方法收集53例胰腺占位病变的超声内镜细针穿刺物,采用肽核酸（PNA）钳制实时定量PER的方法检测K—ras基因野生及突变拷贝数,根据临床综合诊断,与细胞学比较,评价其诊断价值。结果53例患者最后确诊为胰腺癌37例,非恶性胰腺占位16例,胰腺癌组K—ras基因的突变率为83．8％,非恶性胰腺占位组突变率为18．8％,两组之间比较差异有统计学意义（P〈0．05）。细胞学和K—ran定量检测诊断的灵敏度分别为59．5％和83．8％,将两者联合后诊断胰腺癌的灵敏度可提高至89．2％。结论胰腺组织超声内镜细针穿刺物中K—ras定量检查对胰腺癌有临床辅助诊断价值。     

胰液K-ras基因突变和血清CA19-9联合检测判断胰腺癌复发

目的研究胰液中K-ras12密码子点突变和血清CA19-9联合检测结果与胰腺癌病程的关系。方法测定32例临床及手术证实的胰腺癌患者血清CA19-9水平,同时采用内镜ERCP从胰管收集胰液标本,应用聚合酶链反应限制性片断长度多态性分析(PCR-RFLP)检测胰液K-ras基因12密码子点突变,分析K-ras12密码子点突变及血清CA19-9水平联合检测结果与胰腺癌临床特征和术后复发的关系。结果 (1)胰液中K-ras12密码子点突变率为56．3％,与肿瘤大小密切相关(P<0．05)。K-ras12密码子点突变阳性、阴性表达病例3年复发率分别为66．7％和33．3％。(2)高血清CA19-9水平且K-ras12密码子点突变阳性组3年复发率为69．2％,而低血清CA19-9水平且K-ras12密码子点突变阴性组3年复发率为20．0％,两组差异显著(P<0．05)。结论联合胰液中K-ras12密码子点突变和血清CA19-9检测可作为判断胰腺癌术后复发的有效指标,多因素分析对胰腺癌术后复发的判断更有价值。     

胰管刷检标本K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的价值

目的 探讨胰管刷检标本K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的价值。方法 应用突变富集聚合酶联反应（PCR）－单链构象多态性（SSCP）法，检测胰腺疾病胰管刷检标本K-ras基因第一外显子第12密码子点突变。结果 35例胰管刷检标本PCR扩增均获成功，成功率为100％。20例胰腺癌中14例K-ras突变（70％），7例慢性胰腺炎中1例K-ras突变（14％），两组间差异有显著性（P＜0．05）。胰腺囊腺瘤，十二指肠乳头癌均未见K-ras突变。胰管刷检标本K-ras突变与胰腺癌部位无关。胰管刷检K-ras突变检测诊断胰腺癌的敏感性，特异性和准确性分别为70％，90％和83％。结论 检测胰管刷检标本中K-ras基因突变有助于胰腺癌的诊断，具有良好的临床应用前景。     

外周血K-ras基因突变检测在胰腺癌诊断中的应用

目的 检测胰腺癌患者外周血K-rag基因第12、13密码子突变,探讨其对胰腺癌的诊断价值.方法 选取经病理证实的胰腺癌患者54例以及健康志愿者33例.抽取全部实验者外周血标本,抽提循环中的DNA,应用肽核酸钳制实时定量PCR法检测K-rag基因突变,并分析其与患者临床病理参数的相关性.结果 54名胰腺癌患者中,40例(74.1%)外周血标本可检测出K-ras基因第12或13密码子突变.33名健康志愿者外周血标本无一例检出K-ras基因突变.外周血中K-ras基因的突变与患者年龄、淋巴血管侵犯、肿瘤分化程度、肿瘤临床分期、CA19-9水平有关(P＜0.05),而与患者性别、肿瘤部位、肿瘤大小及病理类型无关.结论 肽核酸钳制实时定量PCR法检测外周血K-ras基因突变的敏感性高.外周血K-ras基因突变的检出提示肿瘤具有高侵袭性,可能预后不良.     

胰腺癌的基因不稳定性

目的 分析胰腺癌细胞和组织的基因不稳定性。方法 应用RAPD方法7种引物扩增4株胰腺癌细胞株BxPC-3、AsPC-1、SW1990和PaTu8988，3例手术切除胰腺癌及其癌旁组织，1例正常胰腺组织的DNA片段。结果 PaTu8988与SW1990扩增的DNA片段类型基本一致，但与BxPC-3、AsPC-1的类型不同；胰腺癌和癌旁组织扩增的DNA类型多数相同，少数存在差异，但与正常胰腺组织及胰腺癌细胞株不同。结论 胰腺癌组织中存在着基因不稳定性，这是造成肿瘤异质性的基础。