巨细胞病毒即刻早期及晚期基因片段的检测

自巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＡＤ１６９株感染细胞中提取的ＤＮＡ，应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术，在自行设计及合成的两对特异性引物引导下，成功地扩增出口ＣＭＶ即刻早期（ＩＥ）及晚期（Ｌ）基因片段，摸索了最佳Ｔａｑ酶、Ｍｇ￣（２＋）浓度及退火温度的反应条件，并建立了同一体系中同时检测ＨＣＭＶＩＥ及Ｌ基因片段的方法。初步应用该方法检测了１２例肾移植患者尿标本及１０例动脉粥样硬化标本中ＨＣＭＶＩＥ及Ｌ基因，结果ＩＥ阳性率分别为８％及２０％，Ｌ基因阳性率为３３％及５０％，未见有假阳性及假阴性结果的出现，表明该方法具有较好的特异性及灵敏度，可广泛地应用于临床ＨＣＭＶ的诊断。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中克隆了ＨＣＶ包膜蛋白基因片段（Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１），经与已知基因型的ＨＣＶ－１，ＨＣＶ－Ｊ，ＨＣＶ－Ｊ６和ＨＣＶ－Ｊ８进行核苷酸序列的比较分析，这些基因片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。将克隆基因重组于表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中，在大肠杆菌内进行高效表达，获得了融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，经ＷｅｓｔｅｒｎＢｌｏｔ分析证实这些融合蛋白具有ＨＣＶ的特异抗原活性，提示这些融合蛋白可用于ＨＣＶ感染的临床诊断和发病机理的研究。     

套式PCR快速诊断新生儿巨细胞病毒感染

套式ＰＣＲ用于检测新生儿及随访ＣＩＤ患儿白细胞及尿中ＨＣＭＶＤＮＡ。两对引物序列取自ＨＣＭＶＩＥＡ基因区，第一对引物扩增７２１ｂｐ片段，第二对引物扩增１６７ｂｐ片段，后者穴居于前者之中，结果３３例可疑新生患儿检出ＣＭＶ感染２１例，７例随访患儿中４例尿或血中仍有ＣＭＶＤＮＡ存在。ＰＣＲ与病毒分离相比，既快速又敏感，尿标本用于ＰＣＲ检测ＣＭＶＤＮＡ较之血本具有检出率高，标本采取及处理均简便的优点。     

间接EIA检测抗丙型肝炎病毒核心抗原IgM抗体

以基因重组的ＨＣＶ核心抗原包固相载体,建立了ＥＩＡ检测抗ＨＣＶｃＩｇＭ抗体的方法。为去除特异性抗ＨＣＶ ＩｇＧ及类风湿因子的干扰,用关抗人ＩｇＧ作血清标本稀释液,用抗入ＩｇＭ μ Ｆ（ａｂ‘）２片段制备酶结合物。该ＥＩＡ法对部分ＨＣＶ感染者的检测结果显示,在急性丙型肝炎中抗ＨＣＶｃ ＩｇＭ有较高的检出率,并与ＨＣＶ ＲＮＡ的检出率密切相关,揭示此 ＨＣＶ早期感染的血清学标志,与ＨＣＶ的复制有关。     

HSV-tk/GCV自杀基因疗法及其影响树突状细胞功能的实验研究

目的 研究单纯疱疹病毒－胸苷激酶／更昔洛韦（ＨＳＶ－ｔｋ／ＧＣＶ）自杀基因系统的特性,探讨转ＨＳＶ－ｔｋ基因后,肿瘤细胞被更昔洛韦（Ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ,ＧＣＶ）杀伤时的凋亡现象及对树突状细胞功能的影响。方法 以逆转录病毒法将ＨＳＶ－ｔｋ基因转人乳腺癌细胞株ＭＣＦ－７中,以Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ法对肿瘤细胞基因组ＤＮＡ中ｔｋ基因的整合进行鉴定,以流式细胞仪及电镜观察ＧＣＶ杀伤ＭＣＦ－７／ｔｋ细胞时的凋亡现象,由脐血ＣＤ３４＾＋细胞诱生树突状细胞,以＾３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测树突状细胞刺激同种异体Ｔ淋巴细胞增殖的能力。结果 以逆转录病毒法成功地将ＨＳＶ－ｔｋ基因转入ＭＣＦ－７细胞中,转染ｔｋ基因的ＭＣＦ－７细胞能被ＧＣＶ有效杀伤并存在凋亡现象,凋亡率可达３１．３％;由脐血ＣＤ３４＾＋细胞在ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ     

应用增强化学发光法检测人巨细胞病毒DNA

用增强化学发光法（ＥＣＬ）检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ。该检测系统用戊二醛将辣根过氧化酶与ＨＣＭＶ特异片段结合制备酸标基因探针。探针与靶ＤＮＡ杂交后，酶催化检测系统中发光底物，再经增强剂作用将光信号放大，杂交信号通过Ｘ光自显影。经狭缝杂交证明ＥＣＬ的敏感性达到０．２ｐｇ同源ＤＮＡ，且仅与ＨＣＭＶ ＤＮＡ杂交。用ＥＣＬ检测４２例巨细胞包涵体病（ＣＩＤ）患儿和２０例正常同龄儿童尿中ＨＣＭＶ ＤＮ     

应用地高辛标记核酸探针检测巨细胞病毒

应用地高辛标记核酸探针检测巨细胞病毒史金阳，刘兰青，吕绳敏，吉耀华，刘庆聚合酶链反应（ＰＣＲ）技术的应用大大简化了目的基因片段制备程序。我们用ＰＣＲ技术制备地高辛标记巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ探针，并用此探针检测肝炎综合征患儿尿中ＨＣＭＶＤＮＡ，现...     

水蛭素变异物1活性多肽基因的化学合成及克隆

为了解决天然水蛭素来源匮乏问题，我们采用基因工程技术进行重组水蛭素的研究。根据水蛭素变异物１（ＨＶ１）的氨基酸序列，选择在原核细胞中高表达的密码子，设计了２２１个碱基对长度的ＨＶＩＤＮＡ片段。分１４个寡核苷酸片段进行化学合成，各片段连接成ＨＶ１全基因后，经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ切点克隆入ｐＵＣ１８／１９质粒，转化大肠杆菌ＪＭ１０５，蓝白菌落法筛选阳性克隆。限制性内切酶实验及ＤＮＡ序列分析证实了ＨＶ１全基因的正确性，克隆成功。并且获得活性表达。     

应用增强化学发光法检测人巨细胞病毒DNA

用增强化学发光法（ＥＣＬ）检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ＤＮＡ。该检测系统用戊二醛将辣根过氧化酶与ＨＣＭＶ特异片段结合制备酶标基因探针。探针与靶ＤＮＡ杂交后，酶催化检测系统中发光底物，再经增强剂作用将光信号放大，杂交信号通过Ｘ光自显影。经狭缝杂交证明ＥＣＬ的敏感性达到０．２ｐｇ同源ＤＮＡ，且仅与ＨＣＭＶＤＮＡ杂交。用ＥＣＬ检测４２例巨细胞包涵体病（ＣＩＤ）患儿和２０例正常同龄儿童尿中ＨＣＭＶＤＮＡ，结果阳性率分别为５４．８％和３５．０％。与病毒分离相比较，ＥＣＬ的敏感性为９２．３％，符合率为８７．１％，表明用ＥＣＬ检测ＨＣＭＶ是安全、快速、敏感和特异的方法，适用于临床诊断和研究。     

急性出血性脑血管病并发多脏器功能失常综合征患者血浆内皮素-1及降钙素基因相关肽水平的观察

目的：探讨血浆内皮素１（ＥＴ１）和降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ）在急性出血性脑血管病（ＡＨＣＶＤ）并发多脏器功能失常综合征（ＭＯＤＳ）发病中的作用。方法：采用放射免疫法分别测定２１例ＡＨＣＶＤ合并ＭＯＤＳ患者（ＭＯＤＳ组）、２０例ＡＨＣＶＤ患者（ＡＨＣＶＤ组）及３０例正常人（正常对照组）血浆中ＥＴ１和ＣＧＲＰ水平。结果：ＭＯＤＳ组及ＡＨＣＶＤ组血浆ＥＴ１水平明显高于正常对照组（Ｐ均＜０．０１），ＭＯＤＳ组ＥＴ１水平又明显高于ＡＨＣＶＤ组（Ｐ＜０．０１）。ＡＨＣＶＤ组血浆ＣＧＲＰ水平高于正常对照组，但无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。而ＭＯＤＳ组血浆ＣＧＲＰ水平明显低于正常对照组，ＥＴ１／ＣＧＲＰ（Ｅ／Ｃ）比值明显高于ＡＨＣＶＤ组及正常对照组（Ｐ均＜０．０１）。结论：血浆ＥＴ１水平升高、ＣＧＲＰ水平降低、Ｅ／Ｃ比值严重失衡与ＭＯＤＳ的发生相关；检测血浆ＥＴ１和ＣＧＲＰ水平对评估ＡＨＣＶＤ患者预后有一定意义     

逆转录套式ＰＣＲ检测丙型肝炎病毒感染者ＨＣＶ ＲＮＡ

目的　探讨人血清和外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）中丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ与血清ＩｇＧ和ＩｇＭ抗体联合检测对丙型肝炎的诊断价值。方法对以ＥＬＩＳＡ方法检测所得的４６例ＨＣＶ—ＩｇＧ阳性的标本用逆转录套式聚合酶锭反应（ＲＴ—ＮｅｓｔｅｄＰＣＲ）检测血清和ＰＢＭＣ中ＨＣＶＲＮＡ，同时用ＥＬＩＳＡ方法检测血清中ＨＣＶ—ＩｇＭ。结果血清中有１７例ＨＣＶ　ＲＮＡ阳性和６例ＨＣＶ—ＩｇＭ阳性，而ＰＢＭＣ中有１９例ＨＣＶＲＮＡ阳性。结论血清中ＨＣＶ—ＩｇＭ可作为丙型肝炎的初筛诊断，ＨＣＶ—ＩｇＭ可作为ＨＣＶ近期感染的指标，但二者均不能准确反映病毒在体内的存在情况，而套式ＰＣＲ方法检测ＨＣＶＲＮＡ可直接反映ＨＣＶ在体内的活动情况，其中ＰＢＭＣ中检测ＨＣＶＲＮＡ的阳性率高于血清，提示ＨＣＶ可能在ＰＢＭＣ中潜伏乃至复制。     

巨细胞病毒即刻早期基因mRNA检测方法的建立

目的建立快速简便的逆转录聚合酶链反应（ＲＴＰＣＲ）方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）即刻早期（ＩＥ）基因ｍＲＮＡ。方法设计合成跨越ＨＣＭＶＩＥ基因内含子区的一对引物，分别用ＲＴＰＣＲ和ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｍＲＮＡ和ＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定阳性产物。结果ＨＣＭＶＩＥ基因ｍＲＮＡ表达在感染后６小时即可出现，并持续到感染后至少９６小时，ＲＴＰＣＲ检测的最低敏感性为１００ｆｇ总ＲＮＡ，其他病毒和细胞ＲＮＡ不能被扩增。结论ＲＴＰＣＲ技术检测ＨＣＭＶｍＲＮＡ敏感、特异，有望应用于临床作为ＨＣＭＶ活动性感染的早期诊断方法     

荧光定量PCR诊断HCMV病毒感染的阈值建立

人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）在我国１０岁以下儿童的感染率（抗ＨＣＭＶ－－ＩｇＧ阳性率）超过９５％。当机体抵抗力低下时，ＨＣＭＶ可引起多种组织的感染甚至危及生命。多聚酶链反应可作为ＨＣＭＶ感染早期快速的检测手段，但由于该病毒潜伏感染的特点（多为肾脏），正常健康人的尿液内亦有少量的ＨＣＭＶ，一般定性ＰＣＲ可能存在一定的假阳性。因此我们采用荧光标记探针，以Ｔａｐｍａｎ技术对尿液中ＨＣＭＶ基因进行定量检测，观     

转染TK基因的人外周血单个核细胞对丙氧鸟苷敏感性的研究

异基因造血干细胞移植供者Ｔ淋巴细胞与移植物抗宿主病（ＧＶＨＤ）的产生关系密切。以往唯一有效的方法是体外去除Ｔ淋巴细胞及应用免疫抑制剂。为了最大限度提高移植物抗白血病（ＧＶＬ）效应,防止肿瘤复发,同时减少ＧＶＨＤ发生,对Ｔ细胞进行基因改造是基因治疗肿瘤的方法之一。由于单纯疱疹病毒胸苷激酶（ＨＳＶＴＫ）基因能催化丙氧鸟苷（ＧＣＶ）磷酸化后产生毒性物质,导致转基因细胞死亡。故我们应用逆转录病毒载体介导,将ＨＳＶＴＫ基因导入人外周血单个核细胞（ＰＢＭＮＣ）,观察不同细胞系基因转染效率,并测定ＧＣＶ对…     

丙型肝炎病毒不同基因区的聚合酶链反应扩增

探讨提高聚合酶链反应对丙型肝炎病毒病毒血症的检出率和对变异较大区域的扩增效率的方法。方法 分别以ＨＣＶ基因组５‘端非编码区，非结构基因４区及ＮＳ５ｂ区的引物检测ＨＣＶ，并比较双退火温度与单一退火温度对ＨＣＶ基因扩增效率的影响。     

丙型肝炎病毒NS5A区插入序列因子的初步研究

研究丙型肝炎病毒ＮＳ５Ａ区插入序列（ＩＳ） 因子及其来源。以ＲＴ－ＰＣＲ法扩增ＨＣＶ ＮＳ５Ａ区第６８７１至７１２１ 区段， 对扩增产物进行核苷酸测序并与ＨＣＶ－Ｊ株相应区段序列相比较。结果发现ＨＣＶ ＮＳ５Ａ 区插入一个４８ ｂｐ 的ＩＳ因子， 将ＩＳ因子与ＨＣＶ－Ｊ株全核苷酸序列进行同源性对照， 发现该片段来源于ＨＣＶ Ｅ１区。该研究首次报告了ＨＣＶ ＮＳ５Ａ区有来自Ｅ１区的漂移基因片段， 并对其临床和生物学意义进行了初步讨论。     

套式聚合酶链反应检测巨细胞病毒的初步研究

目的建立套式聚合酶链反应（ＰＣＲ）加限制性酶切分析方法检测人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）。方法在ＨＣＭＶ直接早期蛋白ＥｃｏＲＩＪＤＮＡ片段内，自行设计两对引物，建立套式ＰＣＲ检测ＨＣＭＶＤＮＡ，同时结合病毒分离检测临床标本。结果２３例新生儿肝炎综合征患儿中，１０例病毒分离及套式ＰＣＲ均阳性；１例病毒分离阴性，但套式ＰＣＲ阳性。对５８例妊娠早期孕妇血标本进行检测，套式ＰＣＲ阳性率为９％，病毒分离阳性率则为７％。结论套式ＰＣＲ加限制性酶切分析是一种临床检测ＨＣＭＶ的快速有效手段，值得临床推广。     

江苏徐州地区丙型肝炎病毒基因型研究

为了解本地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因型分布情况，用限制性片段长度多态性分析法（ＲＦＬＰ），对１０７便丙型肝炎患者中血清ＨＣＶ－ＲＮＡ阳性的９０例进行基因型分析。分型结果表明，ＨＣＶ－Ⅱ（１ｂ）占７８．９％，ＨＣＶ－Ⅲ（２ａ）型占１８．９％，ＨＣＶ－Ⅱ／Ⅲ混合型占２．２％，提示：（１）本地区ＨＣＶ流行株基因主要为Ⅱ型，同时存在Ⅲ型与Ⅱ／Ⅲ混合型。徐州地区ＨＣＶ基因型分布符合我国ＨＣＶ基因型分布的特     

人巨细胞病毒激活感染诊断的进展

人巨细胞病毒 (ＨＣＭＶ)对人体的感染过程 ,分为初次感染 (原发性感染 )、激活性感染 (复发性感染 )和位于两者之间的潜伏感染。ＨＣＭＶ一旦感染 ,即终生相伴。潜伏的病毒则以基因或基因产物的形式存在于细胞中 ,多种诱因均可使潜伏的病毒被激活 ,引发明显的临床症状 ,其后果非常严重。目前临床检验面临最大的困惑是如何确诊宿主是否处于ＨＣＭＶ激活感染状态 ?近年来随着国内外免疫分子生物学技术的发展 ,人类对ＨＣＭＶ的感染诊断研究取得了新进展。一、病毒分离与鉴定迄今为止 ,从待检样本中分离到一定量的ＨＣＭＶ已成为该病诊断的金…     

急性出血性脑血管病并发多脏器功能失常综合征患者血浆？…

目的 探讨血浆内皮素－１（ＥＴ－１）和降钙素基因相关肽（ＣＧＲＰ）在急性出血性脑血管病（ＡＨＣＶＤ）并发多脏器功能失常综合征（ＭＯＤＳ）发病中的作用。方法 采用放射免疫法分别测定２１例ＡＨＣＶＤ合并ＭＯＤＳ患者（ＭＯＤＳ组）、２０例ＡＨＣＶＤ患者（ＡＨＣＶＤ组）及３０例正常人（正常对照组）血浆中ＥＴ－１和ＣＧＲＰ水平。结果：ＭＯＤＳ组及ＡＨＣＶＤ组血浆ＥＴ－１水平明显高于正常对照组（Ｐ均〈０．０１