聚合酶链反应检测伤寒沙门菌

用ＰＣＲ技术通过两对引物扩增伤寒沙门菌鞭毛抗原基因ＶＩ区一段特异性ＤＮＡ片段，并用非伤寒沙门菌作对照，结果仅伤寒沙门菌为阳性。实验表明，经二次扩增，当反应体系中达１０１１／ｍｌ个伤寒沙门菌时，即可检出。检查伤寒患者血液标本７份，粪便标本６份，ＰＣＲ阳性分别为６份和５份，而血培养阳性仅为３份和４份，肥达反应均为阴性的发热患者血液标本１２份，健康成人粪便标本６０份，ＰＣＲ均为阴性。     

聚合酶链反应扩增伤寒患者粒细胞中伤寒沙门菌DNA

目的建立适用于临床应用的血中伤寒沙门菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）ＤＮＡ扩增的方法。方法分离患者粒细胞，采用裂解法制备模板ＤＮＡ，单管套式聚合酶链反应扩增Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。结果６例血培养阴性而临床拟诊伤寒及２３例由血培养确诊的伤寒患者粒细胞均获得了３４３ｂｐ的扩增产物，其他３４例发热待查患者粒细胞无扩增产物出现。连续１１０稀释Ｓ．ｔｙｐｈｉＤＮＡ，最低可检测到４０ｆｇＤＮＡ（约１０个菌）。扩增产物的ＤＮＡ序列测定结果也证实了３４３ｂｐ的扩增产物是Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。结论该方法是一项简便、省时、灵敏和特异的实验室诊断伤寒的新技术，尤其对培养阴性的伤寒患者可提供早期、快速的实验室诊断，套式扩增反应在同一反应管中完成，能有效避免标本间的污染。     

聚合酶链反应扩增伤寒患者粒细胞中伤寒沙门菌DNA

目的 建立适用于临床应用的血中伤寒沙门菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）ＤＮＡ扩增的方法。方法分离患者粒细胞，采用裂解法制备模板ＤＮＡ，单管套式聚合酶链反应扩增Ｓ．ｔｙｐｈｉ鞭毛基因。结果 ６例血培养阴性而临床拟诊伤寒及２３例由血培养确诊的伤寒患者粒细胞均获得了３４３ｂｐ的扩增产物，其他３４例发热待查患者粒细胞无扩增产物出现，连续１：１０稀释Ｓ．ｔｙｐｈｉＤＮＡ，最低可检测得到４０ｆｇＤＮＡ（约１０个菌）扩增产     

利用实时荧光定量-聚合酶链反应方法检测粪便标本中的伤寒沙门菌

目的 建立针对粪便标本中伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中伤寒沙门菌的检出率。 方法 根据伤寒沙门菌特异基因STY1633设计特异性引物,优化反应条件,建立实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qPCR)反应体系。利用92株常见的非伤寒病原菌及44株伤寒沙门菌的染色体DNA评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者粪便标本及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。 结果 利用本方法检测的伤寒沙门菌纯菌及伤寒患者标本均扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA检测中,qPCR法的最低检测限为500 fg/反应,相当于97个拷贝/反应。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前检测下限达104 cfu/g,增菌后可达50 cfu/g。 结论 基于STY1633基因的实时荧光定量PCR方法在检测粪便中的伤寒沙门菌中具有很好的特异性、灵敏度,为伤寒沙门菌的快速诊断及某些不明原因发热及腹泻症状的病原初步鉴定提供了新的简便型手段,对于伤寒的早期诊断及预防控制提供了技术支持。     

聚合酶链反应扩增STY3671基因鉴别伤寒与甲型副伤寒沙门菌

目的 评价伤寒沙门菌基因STY3671用于特异性检测该血清型沙门菌的可能性。 方法 根据伤寒沙门菌与甲型副伤寒沙门菌外膜蛋白质组比较得到的伤寒沙门菌特异性蛋白点编码基因STY3671的序列设计引物,提取伤寒沙门菌、甲型副伤寒沙门菌以及其他非伤寒沙门菌血清型菌株的基因组DNA进行PCR检测, 对引物特异性和灵敏性进行分析。 结果 检测的184株伤寒沙门菌均得到807 bp长度片段,部分菌株扩增产物测序结果与伤寒沙门菌标准株CT-18一致。146株甲型副伤寒沙门菌以及其余163株其他血清型沙门菌均未扩增出该片段。 结论 STY3671基因能够作为特异性检测伤寒沙门菌的靶标,能够区别于甲型副伤寒沙门菌及其他常见非伤寒沙门菌血清型,在发热患者的伤寒沙门菌感染诊断、尤其使用血液标本检测中具有良好的潜在价值。     

荧光探针杂交聚合酶链反应检测沙门菌

近来,国内外文献中报道了一种新的荧光标记探针杂交与聚合酶链反应(ＰＣＲ)扩增相结合的检测方法[14],该方法快速、敏感、特异,并能自动化操作,但由于试剂盒和配套自动荧光ＰＣＲ检测仪价格昂贵,使之不能被很好的应用。鉴此,我们在参考文献的基础上,改进方法,在国内现有仪器设备上,建立了荧光探针杂交ＰＣＲ同步检测方法,报告如下。一、材料和方法1菌种:13株致病性沙门菌及7株非沙门菌为临床分离株。2主要试剂和试验器材:ＴａｑＭａｎＳａｌｍｏｎｅｌｌａＰＣＲＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｏｎＫｉｔ(ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ…     

应用聚合酶链反应法检测食品中的沙门菌

目的建立食品中沙门菌聚合酶链反应（PCR）的快速检测方法。方法根据沙门菌invA基因序列设计引物;氯化镁孔雀绿选择性增菌0到8h后,煮沸法提取DNA,用PCR扩增电泳。结果PCR法能特异性检测出食品中的沙门菌,扩增片段为389bp,增菌前的检出限为10^2CFU／g,增菌后为2CFU／25g。结论应用PCR检测沙门菌具有快速、特异、灵敏和简便的特点。     

聚合酶链反应检测铜绿假单胞菌的研究现状

聚合酶链反应在病原微生物的检测中应用广泛。近年来已有文献报道其对铜绿假单胞菌的检测，本文就其检测铜绿假单胞菌的引物设计、检测步骤、评价与初步应用情况进行综述。     

利用双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应技术鉴别诊断粪便标本中的伤寒和甲型副伤寒沙门菌

目的建立针对粪便标本中伤寒沙门菌和甲型副伤寒沙门菌的检测方法,评价该方法的特异性、敏感性及检测下限,以提高感染人群粪便标本中两种病原的检出效率。方法分别根据伤寒沙门菌特异基因STY1633及甲型副伤寒沙门菌特异基因SPA4289设计特异性引物及探针,优化反应条件,建立双重TaqMan荧光定量聚合酶链反应(dual taqman fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)体系。利用44株伤寒沙门菌、30株甲型副伤寒沙门菌、88株其他血清型沙门菌染色体DNA及引起发热的其他病原菌,评价该方法的特异性和灵敏性,并对伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的粪便模拟标本进行检测下限评价,同时利用10份伤寒患者、20份甲型副伤寒患者及48份其他病原所致发热和/或伴腹泻的患者粪便标本进行特异性、敏感性验证。结果利用本方法检测的伤寒、副伤寒沙门菌纯菌及伤寒、甲型副伤寒患者标本扩增阳性,其余的非伤寒沙门菌、致腹泻的其他5种肠道致病菌及引起发热症状的8种常见非肠道病原菌纯菌及相应患者标本均扩增阴性。在对纯伤寒沙门菌DNA及甲型副伤寒沙门菌DNA检测中,双重TaqMan荧光定量PCR法的最低检测限分别为1 pg/反应(194拷贝/反应)及2.5 pg/反应(485拷贝/反应)。以粪便模拟样品提取DNA为模板的检测中,增菌前伤寒沙门菌检测下限达102cfu/g,增菌后可达1 cfu/g;增菌前甲型副伤寒沙门菌检测下限达104cfu/g,增菌后可达10 cfu/g。结论本研究建立了特异性好、灵敏度高的检测粪便中伤寒沙门菌及甲型副伤寒沙门菌的双重TaqMan荧光定量PCR方法,为伤寒及甲型副伤寒疾病的同时快速诊断及鉴别诊断、某些不明原因发热及腹泻症状的病原的初步鉴定提供了简易手段。     

热启动双重聚合酶链反应检测淋病奈瑟菌和沙眼衣原体

建立了蜡隔热启动双重聚合酶链反应同时检测临床泌尿生殖道样品的淋病奈瑟菌和沙眼衣原体的方法，对１７５例临床样品进行了检测，其中淋病奈瑟菌阳性２０例，占１１．４％，沙眼衣原体阳性为３９例，占２２．３％，淋病奈瑟菌和沙眼衣原体双重感染为１２例，占６．９％，做了单一ＰＣＲ与双重ＰＣＲ对照，结果完全相符，并对阳性ＰＣＲ产物进行了限制性酶切鉴定，本实验表明，双重ＰＣＲ对于临床检测淋病奈瑟菌和沙眼衣原体是一快捷     

聚合酶链反应检测霍乱弧菌

为快速，准确地检测霍乱弧菌，控制霍乱流行，研究建立了一种聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法，根据霍乱弧菌肠毒素ＣＴ基因序列，自行设计一对特异引物，扩增片断为２９６ｂｐ，同时采用一种高效率，快速，简便的方法提取并纯化ＤＮＡ，该法能成功地检测各种样品中的产ＣＴ肠毒素Ｏ１群霍乱弧菌，应用ＰＣＲ技术和常规分离培养方法对９０９份腹泻患者粪例标本和１８份环境水样标本进行平行检测。结果表明，两种方法的检测结果一致。     

聚合酶链反应检测霍乱弧菌

为快速、准确地检测霍乱弧菌，控制霍乱流行，研究建立了一种聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测方法。根据霍乱弧菌肠毒素ＣＴ基因序列，自行设计一对特异引物，扩增片断为２９６ｂｐ，同时采用一种高效率、快速、简便的方法提取并纯化ＤＮＡ，该法能成功地检测各种样品中的产ＣＴ肠毒素Ｏ１群霍乱弧菌。应用ＰＣＲ技术和常规分离培养方法对９０９份腹泻患者粪便标本和１８份环境水样标本进行平行检测。结果表明，两种方法的检测结果一致，粪便标本阳性率为４．２％（３８／９０９）；水样标本为２２．２％（４／１８），其中１份粪便标本和１份水样标本，是经过第２次增菌培养后，检出用性，而ＰＣＲ方法未见假阳性及假阴性结果。表明ＰＣＲ方法准确、快速、灵敏，并可在２、３小时内检测出含３个菌细胞的标本。因此，该方法可广泛应用于检测各种临床、环境标本中的产ＣＴ肠毒素Ｏ１群霍乱弧菌。     

聚合酶链反应检测出血性大肠埃希菌

为建立一种针对出血性大肠埃希菌的特异性聚合酶链反应（ＰＣＲ）诊断方法，根据Ｏ１５７：Ｈ７血清型大肠埃尔菌ｈｌｙＡＢ基因的ＤＮＡ序列，设计８个引物，使用３２株Ｏ１５７：Ｈ７血清型。结果表明，引物ＲＨ２８－ＲＨ３０和ＲＨ２６－ＲＨ３１敏感性和特异性好，达１００％。ＲＨ２６－ＲＨ３１产物的 分子量较大，为２ｋｂ。ＲＨ２８－ＲＨ３０的产物为３３８ｂｐ，比较适合检验使用。研究还发现，使用煮沸法制备ＰＣＲ模板     

荧光探针杂交-聚合酶链反应检测沙门菌的研究及应用

目的建立一种快速检测沙门菌的荧光探针杂交-聚合酶链反应(PCR)方法.方法利用Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性降解特异性杂交于模板上的荧光标记探针,导致荧光强度的改变,通过检测荧光强度分析PCR扩增产物.结果选用13株常见致病性沙门菌和7株非沙门菌进行特异性分析,所有沙门菌的荧光△RQ值介于3～8之间,而所有非沙门菌的荧光△RQ值均小于1;在敏感性分析中,采用菌落CFU计数法,最低限度可检测到每PCR扩增体系中含2.25 CFU的沙门菌;与传统细菌培养鉴定方法对照,对40份各种标本进行沙门菌的检测,结果该方法的特异性为100%,敏感性为93.1%,两种方法的符合率为95%.结论用荧光探针杂交-PCR检测沙门菌,是一种快速、敏感的方法.     

聚合酶链反应检测幽门螺杆菌

本文应用与幽门螺杆菌染色体ＤＮＡ高保守区序列互补的引物对，建立聚合链反应检测技术，对２８种非ＨＰ菌及１６株ＨＰ进行检测，特异性１００％，敏感性达到能检出１ｐｇ染色体ＤＮＡ（相当于１００个菌细胞）水平，对３６例接受胃镜检查病人的胃活检组织进行检测，ＨＰ阳性率４７．２％（１７／３６），而对照方法中细菌培养ＨＰ阳性率３３．３％（１２／３６），快速尿素酶试验ＨＰ阳性４１．６％（１５／３６）。结果提示ＰＣＲ     

逆转录聚合酶链反应检测风疹病毒

为了早期诊断风疹感染，应用逆转录。聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法对８０例临床怀疑风疹感染患者的咽拭物检测风疹病毒。ＰＣＲ阳性者４３例，占５３％；同时用酶联免疫吸附法对每份血清作了ＩｇＭ检测，阳性者１２例，占１５％。统计学处理（Ｐ＜０．０１），表明两种检测方法差异有显著性。扩增产物的特异性通过地高辛标记探针的点杂交分析得到证实。该ＲＴ－ＰＣＲ方法具有快速、早期、灵敏度高和特异性强的特点，有希望发展成为临床诊断胎儿风疹感染的一种重要手段，并为产前咨询提供可靠的依据。