Caspase-3抑制剂抑制长春碱诱导的人乳腺癌细胞凋亡及IκΒ-α降解

目的： 本实验通过阻断caspase-3途径,观察长春碱诱导的肿瘤细胞凋亡及胞浆内IκΒ-α蛋白降解的影响,以探索长春碱诱导肿瘤细胞凋亡的信号转导途径。方法: 用二甲基亚砜对照、100 μmol/L caspase-3抑制剂(DEVD-CHO)预处理乳腺癌Bcap37细胞3 h后,加入不同浓度的长春碱,以MTT法检测肿瘤细胞增殖能力,以细胞DNA片段分析及PI染色法检测肿瘤细胞凋亡,以蛋白免疫印迹法检测pro-caspase-3和IκΒ-α蛋白的变化。结果: 蛋白免疫印迹法证实长春碱可诱导pro-caspase-3蛋白的降解。经MTT法、DNA凋亡梯状条带法及流式细胞仪PI染色法证实,DEVD-CHO能减弱由长春碱所诱导的肿瘤细胞凋亡。两组的IC50分别为56.8 μmol/L和87.4 μmol/L。蛋白免疫印迹实验表明,DEVD-CHO能抑制由长春碱所诱导的IκΒ-α蛋白磷酸化降解。结论: 在长春碱诱导肿瘤细胞凋亡过程中,NF-κΒ/IκΒ信号转导途径起着重要作用,caspase-3途径参与调节。阻断该途径将减弱长春碱所诱导的肿瘤细胞凋亡和IκΒ-α磷酸化降解。     

Caspase 3抑制剂抑制羟基喜树碱对人乳腺癌Bcap37细胞NF-κB的激活

目的： 探讨caspase 3抑制剂Ac-DEVD-CHO对caspase 3和NF-κB信号转导途径的影响。方法:采用MTT法测定细胞的增殖活力，琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡，流式细胞仪进行细胞周期分析，Western blotting和DIG-EMSA研究细胞凋亡途径。结果:Caspase 3抑制剂Ac-DEVD-CHO可抑制羟基喜树碱(HCPT)对Bcap-37诱导的凋亡，抑制Pro-caspase 3的裂解，并能抑制IκBα 蛋白降解，阻止NF-κB活化。结论:Caspase 3抑制剂Ac-DEVD-CHO除特异性抑制Pro-caspase 3的裂解外，还可以抑制HCPT对Bcap37细胞NF-κB的活化。     

依托度酸诱导SMMC7721细胞凋亡的分子机理研究

目的：探讨选择性环氧合酶抑制剂依托度酸（etodolac）诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡的分子机理。 方法： 采用流式细胞术、DNA琼脂糖凝胶电泳法测定细胞凋亡情况；Western blotting法检测不同浓度etodolac处理后凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达的变化；流式细胞术检测半胱氨酸酶-3 (caspase-3)活性的变化；TransAMTM NF-κB p65/p50核转录因子活性检测试剂盒检测核因子-κB (NF-κB)活性变化。 结果： 流式细胞术显示etodolac（0.25、0.50、1.0、2.0 mmol/L）作用SMMC7721细胞48 h后，与对照组（0 mmol/L）相比，出现明显凋亡峰（P<0.01 vs control）；高浓度etodolac处理后DNA琼脂糖凝胶电泳出现明显的DNA Ladder, 凋亡相关蛋白Bcl-2表达下降，Bax表达增加；与对照组相比，低浓度组（0.25 mmol/L）caspase-3活性未明显活化（P>0.05），NF-κB活性也未受明显抑制（P>0.05），随着etodolac浓度的增大（0.50、1.0、2.0 mmol/L），caspase-3活性明显活化（P<0.05 vs control）； NF-κB活性明显受到抑制（P<0.05 vs control）。经Pearson 相关分析，caspase-3活性和NF-κB活性呈显著负相关（r=0.919, P<0.01）。 结论： 选择性COX-2抑制剂etodolac可能通过抑制NF-κB结合活性，调节Bcl-2、Bax蛋白表达，活化caspase-3，从而诱导肝癌SMMC7721细胞凋亡。     

NF-κB在人巨细胞病毒感染诱导宿主细胞增殖、凋亡中的作用

目的：探讨人巨细胞病毒(HCMV)是否通过激活核转录因子(NF—κB)调控宿主细胞增殖与凋亡。方法：用HCMV AD169株感染人胚肺成纤维细胞(HEL),采用免疫组化和Westem blot方法检测宿主细胞NF—κB和Bel-2蛋白的表达与I-κBα的变化,应用MTT方法观察细胞的增殖活性,同时用流式细胞术检测细胞凋亡指数。结果：HCMV感染后48h细胞核表达NF—κB蛋白最多,24hI-κBα降到最低,120hNF—κB失活,bcl-2的表达与NF—κB的活性改变一致。HCMV感染在72h前抑制宿主细胞凋亡,促进细胞增殖,在120h可诱导宿主细胞凋亡。结论：NF—κB在HCMV感染诱导宿主细胞增殖与凋亡中起作用,与HCMV疾病的发生发展有关。     

Caspase-9抑制剂对RCS大鼠感光细胞凋亡抑制作用的研究

目的：采用Z-LEHD-FMK进行体内实验，观察caspase-9抑制剂对RCS大鼠感光细胞凋亡的抑制作用。方法：32只 18 d RCS大鼠随机分4组，检查ERG后随机选择一眼为实验眼给予玻璃体内注射Z-LEHD-FMK 4 μg，对侧眼给予4 μg 2%DMSO作对照。各组分别在术后2 d、7 d、12 d、17 d行ERG检查，然后摘取双眼球，石蜡切片行HE染色及感光细胞凋亡的TUNEL检测，透射电镜观察视网膜超微结构。结果：实验眼注药后 7 d ERG b波振幅达到最大(137.35±7.41)mV，17 d时b波振幅为(57.91±9.27)mV，对照眼7 d及以后各组ERG接近熄灭型；实验眼注药后12 d视网膜外颗粒层才开始出现凋亡阳性细胞，17 d更明显，对照眼强荧光的凋亡阳性细胞在术后7 d已经很明显；光镜下注药后17 d实验眼感光细胞外颗粒层细胞数尚保持有7-8层，对照眼仅余下2-4层细胞，视网膜厚度变薄；透射电镜下实验眼注药后17 d可见部分感光细胞胞核、核仁固缩，对照眼从术后 7 d 开始见感光细胞呈现凋亡改变。结论：Z-LEHD-FMK能够延缓RCS大鼠感光细胞凋亡，合适的caspases抑制剂在适宜的时机应用对视网膜感光细胞凋亡具有一定的抑制作用。     

半胱天冬酶天然抑制剂与细胞凋亡

在生物体内,细胞增殖与细胞凋亡总是处于动态平衡状态,从而保证了多细胞生物维系其结构稳定和内环境功能平衡及正常生长发育。正常的细胞凋亡可清除体内衰老的、磨损的或已完成功能的细胞,如胚胎细胞、胸腺细胞等;并能清除具有潜在危险的畸变细胞,如自身反应性淋巴细胞、突变细     

同型半胱氨酸诱导人脐静脉内皮细胞凋亡caspase 3的活化

目的：本研究拟探讨Hcy致内皮细胞凋亡的信号途径。 方法： 以Hcy诱导培养人脐静脉内皮细胞24 h后，通过检测细胞膜磷脂双分子层的改变，DNA ladder的形成确证细胞凋亡，并检测caspase3 及其抑制蛋白c-IAP1/2 mRNA 及蛋白质水平，以及caspase3的活化情况。 结果： Hcy(0.3 mmol/L)即可引起内皮细胞凋亡, 随Hcy浓度升高caspase3酶原含量增加，活化增强；c-IAP2 mRNA 及蛋白质表达降低。 结论： Hcy(0.3-3 mmol/L)可增加细胞内caspase3酶原表达，通过活化caspase3信号途径诱导HUVEC凋亡。在细胞凋亡过程中，凋亡抑制蛋白c-IAP-2表达水平下降。     

SC58125 通过抑制IκBα的降解调节TNF-α 诱导的人结肠癌HT29细胞的凋亡

目的： 了解SC58125与TNF-α是否具有协同诱导HT29细胞凋亡的作用，同时探讨其可能的分子机制。方法： 用MTT、Hoechst 33342染色及琼脂糖凝胶电泳，观察SC58125/TNF-α对HT29结肠癌细胞增殖与凋亡的作用；用EMSA及Western blotting检测转录因子NF-κB的结合活性、IκBα以及磷酸化IκBα的表达。结果： SC58125与TNF-α在抑制HT29细胞增殖及诱导其凋亡方面具有明显的协同作用；表现为细胞核浓缩、核碎裂及“DNA梯带”形成；凋亡过程中伴随caspase活性的激活。经TNF-α刺激后的HT29细胞，IκBα，磷酸化IκBα迅速降解，NF-κB的结合活性大大提高，而加入SC58125后，IκBα降解及NF-κB的结合活性明显受抑制。结论： SC58125与TNF-α在诱导HT29细胞凋亡方面具有明显的协同作用，这可能与激活caspase-3 及抑制IκBα降解有关。     

Akt抑制剂perifosine抑制胃癌细胞增殖并诱导凋亡的实验研究

目的: 探讨新的Akt抑制剂perifosine对胃癌细胞增殖与凋亡的影响。方法: 采用MTT法检测perifosine对胃癌细胞SGC-7901细胞增殖的影响;流式细胞术分析细胞周期变化;AnnexinⅤ-FITC试剂盒检测细胞凋亡;免疫印迹法检测蛋白表达水平。结果: Perifosine能够抑制SGC-7901细胞的增殖,且抑制作用呈时间和剂量依赖性。胃癌细胞经perifosine处理后,细胞阻滞于G₂期,p21表达水平增加,而cyclin B1的表达受到抑制;凋亡诱导现象随着perifosine剂量的增加而增强。免疫印迹结果显示perifosine活化SGC-7901细胞内caspase-3﹑caspase-9及其底物多聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP),促进凋亡诱导蛋白Bax的表达,并抑制Bcl-2的表达。结论: Perifosine对人胃癌细胞SGC-7901的生长具有显著的抑制作用,其凋亡诱导活性与调节caspase家族和Bcl-2家族蛋白的表达密切相关。     

PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502诱导人胃癌SGC-7901细胞凋亡

 目的：检测PI3K/mTOR双重抑制剂PF-04691502对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响及可能的分子机制。方法：MTT法检测细胞活力;流式细胞术分析细胞周期变化;Annexin V-FITC/PI双标法测定细胞凋亡;免疫印迹分析细胞内蛋白表达的变化。结果：PF-04691502处理SGC-7901细胞后,降低细胞的活力并促进细胞阻滞于G1期,同时抑制cyclin D1的表达并上调p21的蛋白水平。PF-04691502可明显诱导SGC-7901细胞凋亡,其机制与其促进caspase家族成员的活化并切割聚（腺苷二磷酸核糖）聚合酶［poly(ADP-ribose)polymerase, PARP］ 底物密切相关。结论：PI3K/mTOR 双重抑制剂PF-04691502能够通过阻滞细胞周期来抑制SGC-7901细胞的增殖,同时能够激活细胞内caspase,使PARP发生剪切而诱导细胞凋亡。     

齐墩果酸诱导人白血病HL-60细胞凋亡及细胞周期阻滞

目的：探讨齐墩果酸诱导HL-60细胞凋亡作用及其对细胞周期的影响。方法：以HL-60细胞为研究对象，以不同剂量的齐墩果酸处理HL-60细胞12 h、24 h、48 h、72 h后，用MTT法观察HL-60细胞的生长抑制率；琼脂糖凝胶电泳测定DNA梯形条带；流式细胞仪分析HL-60细胞细胞周期的变化；同时用Western blotting 检测凋亡途径最终执行者caspase-3的表达。结果：齐墩果酸对HL-60细胞生长具有明显的抑制作用，其中80 μmol/L齐墩果酸作用48 h对HL-60细胞的抑制率达到50%以上，齐墩果酸诱导细胞凋亡呈明显的时间和剂量依赖性； HL-60经齐墩果酸处理48 h出现典型的DNA梯形条带；以80 μmol/L的齐墩果酸处理HL-60细胞12 h即可以使caspase-3的前体procaspase-3断裂为有活性的caspase-3；流式细胞技术检测结果表明HL-60细胞经齐墩果酸处理后细胞周期阻滞于G₁期，其中48 h和72 h分别达到63.24%和67.90%。结论：齐墩果酸可以诱导HL-60细胞凋亡，并使细胞阻滞于G₁期。     

脂多糖诱导大鼠心肌细胞NF-κB、IκB-α的表达及意义

目的研究脂多糖(LPS)诱导大鼠心肌细胞NF-κB,IκB-α的表达及意义。方法100ng/mlLPS刺激心肌细胞0、0.5、1、2、4、6、8h和0、10、50、100ng/mlLPS刺激1h,免疫细胞化学检测NF-κBp65的表达,Westernblot检测IκB-α表达。结果LPS的刺激迅速激活心肌细胞NF-κBp65的表达,于1h时达高峰;IκB-α的表达先降低,后升高。结论LPS可诱导大鼠心肌细胞NF-κB的激活,并通过激活心肌细胞核因子-κB途径从而促进细胞损伤。     

臭灵丹中黄酮类化合物对人喉癌细胞Hep-2凋亡的影响及机制

目的:探讨中药臭灵丹中黄酮类化合物诱导人喉癌细胞Hep-2凋亡的机制。方法:MTT法检测分离自臭灵丹的黄酮类化合物3,5-二羟基-6,7,3',4'-四甲氧基黄酮(HTMF)对2种正常细胞的毒性和对3种肿瘤细胞株的增殖抑制作用;采用流式细胞仪检测化合物对Hep-2细胞凋亡率的影响;Western blotting法检测凋亡蛋白caspase-3和caspase-9的变化。结果:HTMF显著抑制Hep-2细胞的增殖并呈浓度、时间双重依赖性关系,但对正常细胞Vero和EVC304的毒性较小,对A549和HepG2细胞抑制作用小。流式细胞仪检测结果显示HTMF对Hep-2细胞有促凋亡作用并呈明显的量效、时效关系。Western blotting结果显示HTMF可诱导Hep-2细胞中caspase-3和caspase-9蛋白的活化,并呈时间依赖性关系。结论:HTMF对人喉癌细胞Hep-2的生长有显著的抑制作用,其机制可能通过激活caspase-9进而活化caspase-3诱导Hep-2细胞凋亡。     

c-Jun氨基末端激酶与caspase在细胞凋亡中的作用及相互关系

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是信号从细胞表面转导到细胞核内部的重要传递者.在真核细胞中,已确定出4条MAPK信号转导通路[1],即细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK) 通路、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路、P38通路及ERK5通路.JNK也称为应激蛋白激酶,参与应激反应和细胞死亡[2].     

NF-κB与TNF诱导的细胞凋亡

不同类型的细胞对于TNF-α诱导的细胞凋亡的敏感性可以有很大差别,但是多数的细胞在同时给予蛋白质合成抑制剂处理时会对TNF-α变得非常敏感。有学者认为有一个基因或一组基因在TNF受体活化后被诱导而传导细胞凋亡信号。近期的研究表明,一种被TNF激活的NF-κB转录因子在这一过程中起部分的作用。该发现把NF-κB原先只作为免疫和炎症反应调控因子的功能拓宽到了也可参与细胞凋亡的调控。     

细菌氧化还原蛋白azurin诱导U2OS细胞凋亡过程中caspase-3的活化

目的:探讨细菌氧化还原蛋白azurin 诱导人骨肉瘤细胞U2OS凋亡过程中是否有caspase-3 的活化。方法:Annexin-V/PI FCM 检测细胞凋亡情况,用Western blot 分析caspase-3 酶原的变化,半定量RT-PCR 检测caspase-3 mRNA 水平的改变,比色法测定caspase-3 的相对活性。结果:用0、25、50、100、200 mg/L azurin处理U2OS细胞24 h,随药物浓度的增加,caspase-3 酶原的蛋白水平减少,caspase-3 的mRNA 水平增加(P<0.01) 。用100 mg/L azurin分别处理细胞3、6、12、24、48 h,caspase-3活性于6 h开始升高,24 h 达高峰(为对照组的7.2倍,P<0.01),48 h 仍高于对照组(P<0.01);用不同浓度的azurin 处理细胞,caspase-3 活性呈浓度依赖性升高。结论:Azurin诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡过程中有caspase-3 的活化,caspase-3在azurin诱导的骨肉瘤细胞凋亡机制中发挥了重要的作用。     

羟基喜树碱通过激活NF-κB诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡

 目的: 探讨NF-κB信号转导途径在羟基喜树碱诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡中所起的作用。方法: 突变IκB-α-pcDNA3.1(-)质粒转染Bcap-37细胞，并用G418进行阳性克隆选择；采用MTT法测定细胞的增殖活力，琼脂糖凝胶电泳观察细胞凋亡，流式细胞仪进行细胞周期分析，Western blotting法和DIG-EMSA研究细胞凋亡途径。结果: 羟基喜树碱对Bcap-37有明显的生长抑制作用，琼脂糖凝胶电泳检测到典型的DNA梯状条带；羟基喜树碱可通过降解IκBα 蛋白进而激活NF-κB，并使NF-κB发生核移位；羟基喜树碱没有激活突变IκB-α-pcDNA3.1(-)质粒转染细胞的NF-κB，并且转染细胞凋亡受到抑制。结论: 羟基喜树碱对Bcap-37有明显的生长抑制和诱导凋亡作用；NF-κB 信号转导途径在羟基喜树碱诱导人乳腺癌Bcap-37细胞凋亡中起着促进凋亡的作用。     

人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备

目的利用基因重组技术构建人IκBα基因原核表达质粒,制备TrxA/IκBα融合蛋白,以便进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体. 方法以重组质粒pGEM-T-IκBα为模板,利用PCR方法扩增出带有BamHⅠ和HindⅢ酶切位点的人IκBα基因cDNA,经相应酶切后插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达TrxA/IκBα融合蛋白.Western blot试验鉴定表达蛋白.超声波破菌后采用Ni-NTA树脂对TrxA/IκBα融合蛋白进行纯化. 结果酶切鉴定证实人IκBα基因cDNA已插入原核表达载体pET-32a(+).重组表达质粒pET32a(+)-IκBα在大肠杆菌BL21(DE3)中成功地表达了TrxA/IκBα融合蛋白,其相对分子质量(Mr)约为56×103,表达量约占细菌总蛋白的25%.Western blot试验显示TrxA/IκBα融合蛋白与兔抗IκBα多克隆抗体呈特异性免疫反应.经Ni-NTA树脂纯化后,TrxA/IκBα融合蛋白的纯度可高达95%以上. 结论人IκBα基因原核表达质粒的构建及TrxA/IκBα融合蛋白的制备为进一步研究IκBα的生物学功能和制备相应抗体奠定了物质基础.     

小鼠囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达与维甲酸的诱导作用

背景：细胞凋亡是维甲酸导致早期胚胎异常发育的原因之一,而半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3介导的细胞凋亡是细胞凋亡的主要途径。 目的：观察维甲酸对体外培养小鼠囊胚细胞凋亡的影响,以及对囊胚细胞中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的改变。 方法：获取妊娠3.5 d小鼠囊胚,分别在含0,1和10 μmol/L维甲酸的M199培养基中培养24 h,用带有荧光标记的原位末端标记法观察维甲酸对小鼠囊胚细胞凋亡的效应;并用免疫组织化学S-P法检测维甲酸对小鼠囊胚半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3的表达。 结果与结论：所有组均观察到囊胚细胞凋亡和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,高剂量维甲酸组中囊胚细胞凋亡荧光值,半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达的平均吸光度值和阳性面积率均显著升高(P < 0.01)。结果提示维甲酸可促进体外培养小鼠囊胚细胞凋亡和及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达,证实了维甲酸对小鼠胚胎的发育的细胞毒性作用。     

FAK反义寡核苷酸促进人肺动脉平滑肌细胞凋亡

目的： 了解黏着斑激酶(focal adhesion kinase FAK)是否参与人肺动脉平滑肌细胞(HPASMCs)凋亡。 方法： 纤黏连蛋白(FN 40 mg/L)刺激下培养的HPASMCs被用来进行反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides， ASODNs）转染以做进一步实验。采用免疫印迹方法测定FAK蛋白质及凋亡蛋白半光氨酸蛋白酶－3（caspase-3）的表达, TUNEL法检测细胞凋亡。 结果： 免疫印迹方法测定结果表明,应用FAKASODNs转染后HPASMCs中FAK的表达明显低于转染前(P<0.01); caspase-3在应用FAKASODNs转染后高于转染前(P<0.05), TUNEL法检测结果表明FAKASODNs转染后细胞凋亡增加。 结论： 本实验结果表明FAKASODNs抑制细胞增生,促进细胞凋亡。其机制很可能是经caspase-3信号通路促进细胞凋亡。