冻干血小板聚集和活化的实验研究

目的了解血小板在冻干前、后功能活性的变化。方法应用流式细胞仪检测冻干复水(再水化)血小板及未冷冻干燥血小板胞膜CD61、CD62p、PAC-1的分子表达,评价冻干复水后血小板活化状态;应用血小板聚集仪检测通过诱导剂瑞斯托霉素、二磷酸腺苷诱导的血小板最大聚集率,分析冻干血小板复水后血小板聚集率变化。结果血小板冻干保护剂渗透压值为(2 055.6±123.8)m OSmol/kg;冻干前及复水后血小板分布宽度(PDW)(%)分别为15.50±3.05、18.29±0.55,MPV(f L)分别为9.01±1.84、8.63±0.58;冻干血小板复水回收率(%)为81.57±12.57;冷冻前及复水后血小板最大聚集率(%)分别为34.30±33.14、22.10±23.25;冷冻前及冻干复水后血小板胞膜CD61分子表达(%)分别为43.17±13.55、48.64±13.24,CD62p分子表达(%)分别为17.34±6.47、9.79±4.48,PAC-1分子表达(%)分别为4.92±6.32、4.22±4.64。结论冷冻前及复水后血小板最大聚集率的变化甚微,冻干复水后血小板仍具仍具有一定的存活能力;冷冻前及冻干复水后血小板胞膜CD61、CD62p和PAC-1分子表达略有变化(P0.05)。     

冻干血小板功能的体外评价

目的评价冻干血小板的体外功能。方法将经过可逆性激活抑制、添加DMSO和海藻糖等低温保护剂、冷冻干燥后获得的血小板再水化,与新鲜血小板比较,应用流式仪检测分析其CD62p和PAC-1的表达,评价血小板活化状态和血小板反应能力;应用APACT检测诱导剂诱导的血小板最大聚集率并用SPAT评价血小板聚集和促凝血活性;应用扫描电镜和透射电镜技术研究血小板的形态和超微结构的变化。结果经过血小板激活抑制剂和冻干保护剂预处理的冻干血小板,再水化后对凝血酶的最大聚集率(79.0%)与对照组(86.2%)差异无统计学意义(P>0.05),对ADP和没食子酸诱导的聚集反应比对照分别降低49.34%和26.25%;经凝血酶激活后CD62p再表达率为50.88%略低于对照组70.32%(P<0.05),PAC-1再表达率为54.55%与对照组63.38%无明显差异;促凝血功能SPAT检测结果69.4 s与对照组70.6 s差异无统计学意义(P>0.05)。结论经过冷冻干燥保护剂和血小板激活抑制剂预处理后获得的冻干血小板,体外聚集活性和促凝血功能接近新鲜血小板。     

冷冻干燥保存血小板的实验研究

本研究探讨冷冻干燥保存血小板的方法,以获得可长期冻干保存的血小板制品,使之能在常温条件下保存、占用空间小、重量轻、便于长距离运输,能够满足突发事件和战伤救治的需要。在冷冻干燥保存过程中添加血小板可逆性激活抑制剂、DMSO和海藻糖等低温保护剂,进行预处理、冷冻、一级干燥、二级干燥,再水化,并同时测定血小板回收率,凝血酶聚集反应,促凝血功能,CD62p表达率和PAC-1表达率等。结果表明:血小板回收率为56.29%,其对凝血酶的聚集反应与对照组无明显差异,对ADP和丙基没食子酸诱导的聚集反应较对照组分别降低49.34%和26.25%,促凝血功能与对照组比较也无统计学差异;冻干血小板CD62p表达率为42.36%,PAC-1表达率为2.12%,凝血酶激活后CD62p再表达率为50.88%,PAC-1再表达率为54.55%。结论:添加血小板可逆性激活抑制剂,海藻糖和DMSO后的冻干血小板,其聚集活性和促凝血功能与新鲜血小板无明显差异,血小板可逆性激活抑制剂降低了冻干血小板的CD62p表达,增强了冻干血小板的生存能力,因而延长了其生存时间,因此可以该冻干方法为基础进一步提高冻干保存血小板的效率。     

冠心病患者血小板CD62p及GpⅡb/Ⅲa的变化

目的 观察冠心病患者血小板膜P选择素(CD62p)和GpⅡb/Ⅲa(PAC-1)的变化及其临床意义.方法 采用流式细胞术(FCM)三色荧光标记技术检测40例冠心病患者及30名正常人血小板膜CD62p和PAC-1的阳性百分率.结果 冠心病组血小板CD62p[(27.6±14.0)%]与PAC-1[(31.8±16.7)%]阳性百分率显著高于对照组[(3.1±1.5)%,(7.0±1.8)%,P均＜0.01].结论 CD62p和PAC-1是血小板活化的敏感和特异指标,全血流式细胞术测血小板功能可用于冠心病的监测和评价抗血小板药物的疗效,监测治疗干预的效果和预测并发症.     

预冻技术参数对血小板冻干保存的影响

本研究采用正交设计方案探讨冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间4个预冻条件参数对血小板冻干保存的影响。冻干血小板再水化后的数值恢复率、细胞形态和结构、血小板活化和聚集力等指标分别用血细胞计数计、扫描电子显微镜、3色流式细胞仪及对凝血酶的聚集反应进行检测并综合评价。结果显示:在不同的预冻条件组合方式下,冻干血小板的数值恢复率在(91.3%-53.5)%范围内;实验各组血小板冻干制品的冰晶大小和形状有所不同;冻干再水化血小板的活化标记物PAC-1和CD62p的表达和分布与新鲜血小板较为接近,其中PAC-1表达率均维持在较低水平(0.03%-0.22%),而各组样本CD62p的表达水平存在差异。实验中根据血小板数值恢复率得到预冻条件的最佳理论组合是A2B1C1D3,即将血小板悬液先以20℃/min的速率冻结至-40℃维持2小时,再以1.5℃/min对搁板升温至-30℃后维持0.5小时,最后进入冻干程序直至结束。结论:冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间对冻干血小板的数值恢复率均有作用,预冻条件参数的不同组合方式影响血小板冻干保存效果。     

不同来源复水液对冻干PRP活化和释放生长因子影响的比较

目的 比较不同复水液对冻干富血小板血浆(PRP)活化和释放生长因子含量的影响.方法 实验按复水液的不同,分为贫血小板血浆(PPP)(对照组)、生理盐水(实验组1)、超纯水(实验组2)和磷酸缓冲盐溶液(PBS缓冲液)(实验组3)4个组.用四种复水液对冻干PRP复水后,用ELISA法测定其CD63、P-选择素(P-Sele...     

冻干保存血小板可逆性抑制激活的实验研究

目的探索最优的血小板激活抑制剂组成方案,以建立一套完善的血小板冻干前处理程序。方法选择已基本确定有效作用浓度的6种血小板激活抑制剂如前列腺素E1、腺苷、左旋精氨酸、植酸钠、百维利肽和西洛他唑,结合血小板冷冻干燥保护剂的负载过程,以CD62p、PAC-1、MPV和P lt作为血小板活化指标,CD62p和PAC-1的再表达率作为血小板反应性指标,诱导剂诱导的血小板最大聚集率和SPAT作为血小板聚集和促凝血功能的指标;采用正交实验设计,分8个实验组,研究分析各因素在负载中对血小板状态和功能的影响,选择最优的负载液组成。结果A因素(负载环境)水平Ⅰ在抑制血小板MPV增大、D62p和PAC-1的表达以及再表达率保留、血小板最大聚集率和SPAT影响均优于水平Ⅱ(P均<0.05);B因素(PGE1)C因素(左旋精氨酸)F因素(植酸钠)G因素(百维利肽)的水平Ⅱ则均由于各自的水平Ⅰ。因此,在8个实验条件中,以第3实验组(A1B2C2D1E1F2G2)对血小板功能保护的最好。结论在血小板冻干前保护剂负载过程程序,在血浆负载环境中添加1μmol/L前列腺素E1,5 mmol/L左旋精氨酸,0.5 mmol/L植酸钠和0.5μmol/L百维利肽,可有效抑制血小板激活,使保存的血小板具有表达CD62p和PAC-1活性、聚集反应和促凝血活性。     

单采血小板不同保存条件膜糖蛋白的变化

目的探讨单采血小板经不同方法保存后膜糖蛋白(glycoproteins,GP)的变化.方法采用流式细胞术(flow cytometry,FCM)对17例机采血小板经2种方法保存后测定血小板膜GP CD41a、CD41b、CD42a、CD62p和纤维蛋白原受体(fibrinogen receptor,PAC-1).结果 22 °C保存后CD62p的表达率和平均荧光强度(mean fluorescence intension,MFI)均随时间的延长而逐渐增高,由采集时的10.96%±5.54%和31.98±16.33至保存后的第6天增高到91.31%±7.79%和79.80±19.68;与当日比较P<0.001.-80 ℃保存3个月后的CD62p的表达率除与22 ℃保存1 d 时相同外(P>0.05),均低于22 ℃保存2～6 d(P<0.001);PAC-1的表达率于保存后1 d 开始增高,到保存第3天又逐渐下降.CD41a无论是表达率还是MFI保存后均高于采集当天(P<0.001).CD41b和CD42a保存后变化范围不大.结论 (1) 血小板膜GP的表达率和MFI随保存时间的延长而增高,PAC-1保存到第3天后又逐渐下降,以CD62p、PAC-1及CD41a变化为大;(2) 血小板加保护剂于-80 ℃保存稳定性较好.     

小剂量阿司匹林对老年冠心病患者血小板活化功能的影响

目的探讨长期口服小剂量阿司匹林对老年冠心病患者血小板活化功能的影响。方法116例冠心病患者随机分为ASA50组、ASA100组及对照组,运用流式细胞仪(FCM),准确测定各组经体外二磷酸腺苷(ADP)及花生四烯酸(AA)共同活化的血小板膜表面糖蛋白(GPⅡb/Ⅲa、CD62P)的阳性表达率,观察并分析比较老年人血小板膜表面糖蛋白的阳性表达率的变化。结果(1)血小板膜表面糖蛋白GPⅡb/Ⅲa的阳性表达率在ASA50及ASA100组分别为(64.40±15.71)%,(57.22±15.82)%,两种剂量阿司匹林均较对照组(75.8±15.71)%明显降低(P<0.05)。CD62P(P-Selectin)的阳性表达率分别为(68.01±9.57)%,(60.44±9.30)%,阿司匹林组与对照组(78.59±6.38)%比较明显降低(P<0.05)。(2)ASA50组与ASA100组两组间比较,PAC-1的阳性表达率为(64.40±15.71)%与(57.22±15.82)%,两组间差异无统计学意义(P>0.05);CD62P的阳性表达率为(68.01±9.57)%与(60.44±9.30)%,两组间差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论小剂量阿司匹林可有效抑制血小板活化功能,每日服用50mg和100mg阿司匹林对血小板活化功能的抑制无显著差异,双相激活血小板可以客观反映体内阿司匹林对血小板活化功能的影响。     

血小板膜糖蛋白CD62P和CD63的检测方法及其在糖尿病患者中的表达

血小板a-颗粒膜蛋白(CD62P)和溶酶体膜蛋白(CD63)是血小板活化标志物,但血小板膜蛋白极不稳定,易活化,造成实验结果不可靠,为此应采用统-标准的检测方法.为探讨该目的并了解糖尿病患者血小板的活化情况,实验中采用全血单克隆抗体直接免疫荧光标记法和流式细胞术,对正常人及37例成人糖尿病患者进行了研究.正常人无固定组在标记后30,60,90和120分钟时,CD62P和CD63阳性率(%)分别为7.57±2.33,20.50±5.70,28.70±5.67,36.52±6.13及0.89±0.36,1.11±0.84,2.35±2.02,5.43±3.66,其相应点的平均荧光强度各自为1.57±0.13,1.88±0.08,2.00±0.09,2.38±0.22及3.91±0.11,4.07±0.16,4.38±0.14,4.44±0.19,二项均随检测时间推移逐渐升高,其中阳性率增高更加显著.而正常人多聚甲醛固定组CD62P和CD63在相同各时间点的阳性率和平均荧光强度基本相同,未出现明显变化.此外,37例成人糖尿病患者CD62P和CD63的阳性率分别为(14.11±6.68)%及(2.71±1.74)%,比相对正常对照组显著升高(P＜0.001,P＜0.05).由此可见,血小板CD62P和CD63非常敏感,在体外易受激活,采血后需立即标记,全部操作应在30分钟内完成,而多聚甲醛固定可抑制活化并稳定血小板标记复合物,使上机检测时间延长至2小时而对结果无影响.成人糖尿病患者心血管系统合并症可能与血小板活化有关.     

预冻技术参数对血小板冻干保存的影响

本研究采用正交设计方案探讨冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间4个预冻条件参数对血小板冻干保存的影响．冻干血小板再水化后的数值恢复率、细胞形态和结构、血小板活化和聚集力等指标分别用血细胞计数计、扫描电子显微镜、3色流式细胞仪及对凝血酶的聚集反应进行检测并综合评价．结果显示：在不同的预冻条件组合方式下，冻干血小板的数值恢复率在（91．3％-53．5）％范围内；实验各组血小板冻干制品的冰晶大小和形状有所不同；冻干再水化血小板的活化标记物PAC-1和CD62p的表达和分布与新鲜血小板较为接近，其中PAC-1表达率均维持在较低水平（0．03％-0．22％），而各组样本CD62p的表达水平存在差异．实验中根据血小板数值恢复率得到预冻条件的最佳理论组合是A2B1C1D3，即将血小板悬液先以20℃／min的速率冻结至-40℃维持2小时。再以1．5℃／min对搁板升温至-30℃后维持0．5小时，最后进入冻干程序直至结束。结论：冻结速率、退火速率、退火温度和退火持续时间对冻千血小板的数值恢复率均有作用，预冻条件参数的不同组合方式影响血小板冻干保存效果．     

丁胺卡那霉素对EDTA依赖性凝集血小板的解离及其机制

目的研究丁胺卡那霉素对EDTA抗凝剂依赖的聚集血小板的解离作用和机制,为血常规标本中血小板凝聚提供可靠的解决方法。方法在EDTA依赖的假性血小板减少症(PTCP)患者的EDTA-K2抗凝血样本中,于不同时间段加入不同浓度丁胺卡那霉素进行凝集血小板的解离试验,通过血小板计数和涂片观察解离效果;用流式细胞仪检测血小板膜表面CD41、CD61、CD62p、PAC-1和IgG的表达百分率。结果抽血后1h内加入丁胺卡那霉素对血小板凝集的解离作用明显,血小板计数可恢复到即时检测的水平,血小板CD62p、PAC-1和IgG的表达量被显著抑制,而CD41和CD61未受明显影响。结论PTCP患者血常规样品抽血后1h内加入丁胺卡那霉素能有效解离凝集的血小板,作用机制可能与抑制患者血小板膜表面CD62p、PAC-1和IgG的表达有关;此法有助于解决EDTA所致的血小板计数的假性减少。     

二甲亚砜对血小板冻存中功能保护作用的实验研究

本研究探讨二甲亚砜（DMSO）对血小板冻干保存中激活的抑制作用。以CD62p和PAC-1表达作为血小板的激活标志，CD62p和PAC-1再表达和血小板最大聚集率作为评价血小板功能的指标。对血小板经离心、洗涤及海藻糖负载等顸处理过程中加与不加DMSO的实验组，分别进行血小板膜表面糖蛋白CD62p和PAC-1表达及再表达的流式细胞术（FCMs）分析，血小板最大聚集率和血小板平均体积（MPV）的测定，研究DMSO对血小板激活抑制作用的可逆性。结果显示，血小板经预处理后，不含DMSO组的CD62p和PAC-1表达率显著增高，分别达30．37％和15．01％；含DMSO的组，CD62p表达率为10．72％，PAC．1几乎不表达（0．11％），显著低于不含DMSO组（P〈0．01）。DMSO稀释后，血小板CD62p再表达为54．39％，显著低于对照组（71．69％）和高于不含DMSO组（35．98％）（P均〈0．01）；PAC-1再表达率为49．28％，与对照组（54．48％）无显著差异，显著高于不含DMSO组（P〈0．叭）。在含DMSO组，血小板用原血浆稀释后，血小板聚集功能恢复，对restocetin，thrombin和propylgallate诱导的血小板聚集率分别为92．76％，91．24％和89．66％，与对照组和无DMSO组比无显著性差异，对ADP诱导的聚集率有34．33％，显著高于无DMSO组（P〈0．01），但仍显著低于对照组（P〈0．01）。结论：DMSO对体外处理所致的血小板膜表面CD62p和PAC-1表达具有抑制作用，且该抑制作用是可逆的，DMSO稀释后血小板仍具有CD62p和PAC．1表达能力和聚集反应功能，提示DMSO具有抑制激活损伤和低温保护的双重功能，这一生物学特性使DMSO在血小板的冻干保存中发挥重要作用。     

白膜法汇集浓缩血小板体外质量和功能特性研究

目的研究白膜法汇集浓缩血小板体外质量和功能特性,为国家制定统一的白膜法血小板质量标准提供依据。方法应用白膜法制备汇集浓缩血小板并检测分析各项质量指标,与机采血小板国家标准(GB18469-2001)比对。分别用血小板聚集仪和流式细胞仪测定白膜法汇集浓缩血小板、机采血小板对诱导剂ADP的最大聚集率与血小板膜表面糖蛋白分子CD62P和PAC-1的表达率。结果白膜法制备的汇集浓缩血小板质量指标分别为:容积为(270±14)m l,含量为(2.58±0.51)×1011,pH值为7.24±0.09,红细胞混入量为(6.61±0.16)×109,白细胞混入量为(0.011±0.008)×109。两组血小板对ADP的最大聚集率分别为(85.1±9.0)%和(87.9±11.1)%,P>0.05;两组血小板膜表面糖蛋白分子CD62P表达率分别为(12.3±1.7)%和(11.7±2.1)%,P>0.05;PAC-1表达率分别为(9.3±1.7)%和(8.9±1.4)%,P>0.05。结论白膜法汇集浓缩血小板体外质量指标均达到机采血小板国家标准,血小板功能活性保持良好。     

植酸钠和百维利肽体外抑制血小板活化的实验研究

目的探讨植酸钠和百维利肽在体外对血小板激活的抑制和功能保护的作用。方法测定血小板对诱导剂的聚集反应、血小板CD62p和PAC-1表达、凝血酶激活后血小板的CD62p和PAC-1再表达以及血小板聚集功能,研究在离心、洗涤和重悬等体外处理过程中,不同浓度的植酸钠和百维利肽对血小板的激活损伤、血小板功能保存和血小板促凝血活性的影响。结果经体外处理后的血小板CD62p和PAC-1表达显著增加;1mmol/L植酸钠可抑制PAC-1表达,但对血小板CD62p和PAC-1再表达无明显抑制作用,血小板对诱聚剂仍有聚集反应性;百维利肽浓度为1μmol/L时,对CD62p和PAC-1表达有较强的抑制作用,CD62p和PAC-1表达率仅为0.78%和0.24%,抑制血小板CD62p和PAC-1再表达,保留血小板除凝血酶之外诱导的聚集反应;植酸钠浓度≤2mmol/L可显著延长血小板发生聚集的时间,≥3mmol/L时,血小板不聚集;百维利肽浓度≤3μmol/L时,血小板聚集时间无明显延长。结论1mmol/L的植酸钠可抑制血小板GPⅡb/Ⅲa构象的改变,并保留血小板的部分凝集和再表达功能;1μmol/L的百维利肽可作用于凝血酶的激活途径,抑制血小板激活,且能部分保留血小板的再表达和聚集功能,适当减少其作用浓度会对血小板有更好的功能保护效果。     

改良血小板添加液低温液态保存血小板的形态及功能研究

本研究探讨使用改良的血小板添加液替代70％自体血浆在低温（10℃）液态条件下对血小板的保存效果。采集6名供者单采血小板,每一名供者单采血小板平均分为3组,A组（常规保存组）加入100％血浆、22℃保存：B组（添加液10℃保存组）加入70％PAS—ⅢM／30％血浆、10℃保存;C组（冰冻保存组）加入100％血浆和海藻糖、-85℃保存;另设D组（血浆4℃保存组）加入100％血浆、4℃保存,作为扫描电子显微镜对照组。A、B组在第1、5、7、9天取样,C组在20天后复苏取样,分别检测CD62p、HSR、PAgT、LDH的变化。血浆常温组、添加液低温组于保存后第3、9天取样扫描电镜观察,血浆低温组于保存后第3天取样观察．冰冻组在20天后复苏取样观察,同时使用新鲜血小板作为对照。结果表明,保存期内随保存时间延长,A组和B组CD62p表达增加,HSR和最大聚集率降低;A组的LDH释放、CD62p表达、HSR、血小板最大聚集率与B组比较有显著统计学差异（P〈0．05）。C组LDH释放明显较其他两组增多,但CD62p表达较少（P〈0．05）。A、B组血小板形态保持较好,C组血小板形态保持差。结论：改良的PAS—ⅢM保存液能够替代血浆用于血小板的保存,在低温条件下能够很好地保护血小板的功能,保存效果优于血浆常温保存。     

左旋精氨酸和西洛他唑对血小板体外激活的抑制作用

本实验旨在研究左旋精氨酸(L-arginine)和西洛他唑(cilostazol)在体外对血小板激活的抑制和功能保护作用,为可逆性血小板抑制剂在血小板保存中的应用提供依据。采用对血小板CD62p和PAC-1表达及凝血酶激活后再表达率的流式细胞分析(FCMs)、血小板聚集试验以及血小板凝血活性检测等手段,观察血小板激活、血小板功能状态。结果表明,体外处理后血小板CD62p和PAC-1表达率显著增加,西洛他唑和左旋精氨酸对这一过程CD62p和PAC-1表达有较强抑制作用,且随浓度增加而递增。西洛他唑可抑制凝血酶激活后CD62p和PAC-1的表达,左旋经氨酸仅抑制凝血酶激活后的PAC-1表达。左旋精氨酸和西洛他唑对3种诱导剂诱导的血小板聚集呈现不同程度的抑制作用,抑制作用随浓度递增。左旋精氨酸≥15mmol/L时,血小板聚集时间延长甚至不凝集。西洛他唑在浓度1-4mmol/L范围均延长血小板聚集时间。结论:5mmol/L和10mmol/L的左旋精氨酸均可抑制血小板体外处理过程的激活,且血小板的聚集和再表达功能不受影响,5mmol/L作用更佳。1mmol/L浓度西洛他唑抑制血小板体外激活,可保留血小板部分聚集活性和再表达能力。     

冻干再水化血小板结构与功能研究

目的探索血小板冻干保存及再水化后结构与功能的改变。方法选择过期的冻干再水化血小板为实验对象,以新鲜血小板作为对照,分别用血小板计数仪、扫描电镜、透射电镜、血小板聚集仪和三色流式细胞仪检测血小板的回收率、稳定性、形态、超微结构、聚集反应和膜表面糖蛋白的表达。结果实验组血小板计数明显下降,血小板回收率为49.36%,且随着血小板放置时间的延长,血小板回收率逐渐下降,血小板透光性较差,分泌颗粒数目较少。实验组凝血酶、ADP、胶原及瑞斯托霉素的最大聚集率均与对照组有明显统计学差异（P〈0.05）。凝血酶作用后CD62p再表达率为44.02%,显著低于对照组70.31%（P〈0.05）,PAC-1再表达率为38.90%,显著低于对照组65.28%（P〈0.05）。结论过期血小板冻干再水化后的恢复率较低,稳定性较差,结构和功能均低于新鲜血小板,但冻干再水化血小板仍具有一定的活性,为新鲜血小板的冻干保存提供了基础。