高迁移率族蛋白1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进骨髓干细胞的趋化及成骨分化

目的 探讨高迁移率族蛋白1（HMGB1）通过PTEN诱导假定激酶1（PINK1）/帕金蛋白(Parkin)介导的线粒体自噬对骨髓干细胞的趋化及成骨分化的影响。方法 将人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）分为7组：control组、siRNA-NC组、siRNA-HMGB1组、pcDNA-NC组、pcDNA-HMGB1组、pcDNA-HMGB1+siRNA-NC组、pcDNA-HMGB1+siRNA-PINK1组。采用Transwell检测细胞迁移能力;茜素红染色检测各组细胞中钙结节数目;ELISA检测骨桥蛋白（OPN）、碱性磷酸酶（ALP）的含量;RT-qPCR检测各组细胞中成骨细胞特异性转录因子（Osterix）、HMGB1及Runt相关转录因子2（RUNX2）、转录因子CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）水平;透射电镜检测线粒体自噬小体数目;Western Blot检测hBMSCs中Parkin及微管相关蛋白1A/1B-轻链3（LC3Ⅱ/Ⅰ）、选择性自噬接头蛋白62（P62）和自噬关键分子酵母Atg6同系物（Beclin1）等线粒体自噬相关蛋白的表达。结果 HMGB1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对hBMSCs的趋化作用研究表明：与pcDNA-NC组相比,pcDNA-HMGB1组HMGB1表达、细胞迁移率、线粒体自噬数目及自噬相关蛋白Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达增加,Parkin、P62等蛋白的表达降低（P＜0.05）;与siRNA-NC组相比,siRNA-HMGB1组HMGB1表达、细胞迁移率、线粒体自噬数目及Beclin-1、LC3B-Ⅱ/Ⅰ等表达降低,Parkin、P62表达增高（P＜0.01）。HMGB1通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬对hBMSCs的成骨分化作用研究结果显示：与pcDNA-NC组相比,pcDNA-HMGB1组钙结节数量、Osterix及RUNX2含量、ALP及OPN的表达升高（P＜0.01）,PPARγ、C/EBPα的表达降低（P＜0.05）;与pcDNA-HMGB1+siRNA-NC组相比,pcDNA HMGB1+siRNA-PINK1组钙结节数量、Osterix及RUNX2含量、ALP及OPN的表达降低（P＜0.05）,PPARγ、C/EBPα的表达升高（P＜0.05）。结论 HMGB1高表达能通过PINK1/Parkin介导的线粒体自噬促进hBMSCs的趋化、成骨细胞分化及抑制成脂细胞分化,可能是骨质疏松症的潜在治疗靶点。     

活血消异方改善子宫内膜异位症大鼠卵泡发育的机制探讨

目的 从卵巢颗粒细胞凋亡与自噬相互作用的角度，探讨活血消异方对子宫内膜异位症大鼠卵泡发育的影响及作用机制。方法 将动情周期正常的48只SD大鼠分为空白组、假手术组各10只，剩余的分为供体组(n=5)和受体组(n=23)用于造模，造模成功后的20只大鼠又分为模型组、活血消异方组各10只。活血消异方组予活血消异方汤剂2 ml灌胃，空白组、假手术组、模型组均予蒸馏水2 ml灌胃，各组连续灌胃15 d后，检测大鼠血清活性氧(ROS)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)水平。取各组大鼠的卵巢组织行HE染色，光镜下观察各级卵泡形态并计数；免疫组化染色定位颗粒细胞，并比较凋亡相关因子Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达；TUNEL染色观察颗粒细胞凋亡情况并计算凋亡率；蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢组织中凋亡及自噬相关蛋白p-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3、Beclin-1、LC3Ⅱ的表达；电镜观察各组大鼠卵巢颗粒细胞自噬体形态，并计算自噬体胞质面积比。结果 (1)与空白组、假手术组比较，模型组血清ROS含量显著升高，T-SOD、CAT水平...     

SOX2基因对骨关节炎软骨细胞凋亡的影响研究

目的 探讨SOX2基因对人骨关节炎（OA）软骨细胞凋亡的影响及机制。方法 以正常软骨组织作为对照,通过Western blotting检测OA软骨组织SOX2蛋白表达。从人OA中分离软骨细胞,参照Lipofectamine TM2000说明将重组体pcDNA3.1-SOX2及空载体pcDNA3.1转染软骨细胞,并设置空白对照组。AG490作为JAK2/STAT3信号通路抑制剂,各组细胞处理48 h,通过流式细胞术、ROS试剂盒分别检测各组细胞凋亡率及ROS水平。Western blotting检测JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的蛋白相对表达量。结果 人OA软骨组织SOX2表达明显低于在正常软骨组织表达（0.065±0.009 vs 0.313±0.028, P<0.05）。转染pcDNA3.1-SOX2的OA软骨细胞SOX2表达明显高于空白组（0.556±0.048 vs 0.122±0.013, P<0.05）。pcDNA3.1-SOX2可明显降低OA软骨细胞凋亡率(3.11±0.42 vs 8.54±0.68)及ROS水平(23.46±2.15 vs 52.67±4.41),上调p-JAK2（0.142±0.013 vs 0.065±0.009）和p-STAT3表达（0.218±0.020 vs 0.126±0.015）（P<0.05）,AG490（15.23±1.13 vs 8.15±0.62）可诱导OA软骨细胞凋亡,而pcDNA3.1-SOX2可减弱AG490对OA软骨细胞凋亡促进作用（P<0.05）。结论 SOX2可抑制OA软骨细胞凋亡,其机制可能与激活JAK2/STAT3信号通路有关。     

阿利吉仑对大鼠膝骨关节炎血清及软骨炎性因子的影响

[目的]探讨阿利吉仑干预对膝骨关节炎大鼠软骨组织的保护作用和血清中炎性因子的影响。[方法] 30只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组,每组10只。假手术组仅切开关节囊,而模型组和治疗组按改良后Hulth法建立骨性关节炎模型,前两组灌胃给予生理盐水,而治疗组给予阿利吉仑。建模成功后,取大鼠血样测量IL-1、IL-6的含量;取膝关节行Masson染色、番红花染色;采用RT-qPCR检测各组软骨组织中Runx2、TNF-αmRNA,采用Western blot检测软骨IL-1、IL-6、Runx2、TNF-α蛋白表达水平。[结果]与假手术组相比,模型组大鼠血清中IL-1和IL-6浓度明显增加(P0.05),而治疗组较模型组明显下降(P0.05)。Masson染色结果发现,模型组大鼠软骨细胞较假手术组明显肥大,而治疗组情况明显改善;番红花染色显示,与假手术组相比,模型组大鼠组织切片中软骨细胞面积明显减少,而治疗组的染色面积明显减少。模型组大鼠软骨组织中Runx2和TNF-αmRNA表达水平明显上升(P0.05),而治疗组较模型组明显下降(P0.05)。与假手术组相比,模型组大鼠软骨组织中IL-1、IL-6、Runx2和TNF-α蛋白表达水平明显上升(P0.05),而治疗组较模型组明显下降(P0.05)。[结论]阿利吉仑能够有效抑制膝骨关节炎大鼠软骨组织的破坏,显著降低膝骨关节炎大鼠血清和软骨中的炎性因子水平。     

B淋巴细胞瘤-2蛋白多位点磷酸化在大鼠脊髓损伤后细胞自噬中的表达研究

目的探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后细胞自噬的变化及其与B淋巴细胞瘤-2(Bcell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白多位点磷酸化的关系。方法取40只8周龄雄性SD大鼠,采用改良Allen法制备SCI模型;将造模成功的36只大鼠随机分为SCI组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组,每组12只。另取12只大鼠仅切除椎板、不损伤脊髓,作为假手术组。造模结束后,自噬抑制剂组及自噬促进剂组分别于脊髓鞘内注射20μL600 nmol/L 3-甲基腺嘌呤、25 nmol/L雷帕霉素,假手术组及SCI组仅注射20μL生理盐水;每天1次,连续4周。造模后1 d及1、2、4周,采用BBB评分法评价各组大鼠后肢运动功能。末次注射后24 h处死各组大鼠并取脊髓组织,ELISA法检测脊髓组织中过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及TNF-α、IL-1β水平;HE染色观察脊髓组织形态学变化;透射电镜观察脊髓组织中线粒体超微结构变化;免疫荧光染色检测自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)蛋白表达;TUNEL染色观察脊髓组织神经细胞凋亡;免疫荧光双染检测LC3/TUNEL阳性细胞表达;Western blot检测细胞Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、Bcl-2及p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达。结果与假手术组相比,SCI组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;神经细胞周围间隙增大,细胞肿胀、出现空泡,线粒体中出现自噬小体;Beclin1及LC3蛋白阳性率、神经细胞凋亡率显著升高;LC3、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低;以上指标比较差异均有统计学意义(P0.05)。与SCI组相比,自噬抑制剂组各时间点BBB评分降低,MPO活性、TNF-α、IL-1β水平升高;线粒体中出现少量自噬囊泡;Beclin1及LC3蛋白阳性率降低,神经细胞凋亡率显著升高;LC3阳性细胞减少、TUNEL阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2蛋白表达降低。而自噬促进剂组结果与自噬抑制剂组相反;以上指标组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。结论大鼠SCI后通过诱导细胞自噬可降低神经细胞凋亡,保护脊髓功能,其机制可能与抑制Bcl-2蛋白多位点磷酸化有关。     

百草枯中毒对大鼠肺线粒体自噬的影响

目的:建立百草枯(paraquat,PQ)中毒大鼠模型,观察不同阶段肺线粒体膜电位(JC-1)、调控线粒体自噬关键性蛋白PINK1、Parkin,肺线粒体自噬透射电镜病理等改变,探讨百草枯中毒对大鼠肺线粒体自噬的影响。方法:成年雄性SD大鼠42只,随机分为正常对照组(n=6)、模型组(n=36),模型组下设2 h、12 h、1 d、3 d、7 d和14 d共6个时间点,每个时间点各6只大鼠。使用20%PQ溶液50 mg/kg一次性灌胃大鼠建立PQ中毒模型。HE染色和Masson染色观察PQ中毒后肺组织纤维化病变;JC-1染色检测肺组织线粒体膜电位变化;Western blot检测PINK1、Parkin蛋白变化、透射电镜观察肺线粒体自噬病理改变。结果:与对照组相比,随着PQ中毒时间的延长,肺纤维化病理评分较对照组升高,差异有统计学意义(P0.05);PQ中毒大鼠肺组织JC-1红绿荧光比均较对照组降低,Western blot提示随中毒时间延长,PINK1及Parkin蛋白表达均升高,差异有统计学意义(P0.05)。透射电镜进一步证实PQ中毒大鼠肺线粒体出现明显自噬改变。结论:本研究通过检测肺线粒体JC-1、调控线粒体自噬关键性蛋白PINK1、Parkin及肺线粒体电镜病理等证实了PQ中毒诱发了大鼠肺线粒体自噬,线粒体自噬可能参与了PQ大鼠肺纤维化的发生发展。     

p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂对大鼠骨性关节炎的影响

目的观察p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂SB203580对大鼠膝关节骨性关节炎关节软骨的影响。方法40只sD大鼠随机分为A、B、C、D4组。A、B、C组行单侧膝关节前交叉韧带切除术，A组于术后行关节腔内注射0．1mL浓度为100μm／L SB203580，B组注射等量生理盐水做为实验对照，C组不予任何处理为空白对照组，D组为正常对照组。术后8周处死动物。观察各组标本大体评分、Mankin评分、软骨细胞凋亡指数以及软骨Ⅱ型胶原免疫组化染色。结果40只大鼠均纳入结果分析。大体评分及Mankin评分显示A组软骨退变明显轻于B、C组（P〈0．05）；各组均发现有凋亡的软骨细胞，A组软骨细胞凋亡指数低于B、C组（P〈0．05），D组软骨细胞凋亡指数明显低于其他3组（P〈0．05）；A组关节软骨Ⅱ型胶原染色吸光度值大于B、C组（P〈0．05）。结论p38MAPK抑制剂对关节软骨有一定的保护作用，可以延缓OA进程，对OA有一定的治疗作用。     

骨性关节炎水通道蛋白1的表达与软骨细胞凋亡相关性研究

目的水通道蛋白1(aquaporins 1,AQP-1)表达变化可能与细胞凋亡相关。通过观察软骨组织中AQP-1和半胱天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的表达,探讨AQP-1表达与软骨细胞凋亡的相关性,为进一步研究骨性关节炎(os teoarthritis,OA)的发病机制提供实验依据。方法取8周龄清洁级雄性SD大鼠72只,体重286～320 g,平均300 g;随机分为手术组、假手术组和对照组,每组24只。手术组采用切断前交叉韧带及内侧副韧带、部分切除内侧半月板方法制备大鼠双膝OA模型;假手术组仅暴露关节腔;对照组不作处理。造模后观察大鼠一般情况,于1、2、4、8周处死大鼠取膝关节标本行大体、组织学观察;采用实时荧光定量PCR检测AQP-1和Caspase-3 mRNA的表达情况;使用酶标仪检测Caspase-3蛋白酶活性;并对AQP-1 mRNA表达与Caspase-3 mRNA的表达及蛋白酶活性的相关性进行分析。结果术后共6只大鼠死亡,均给予补充;其余大鼠均存活至实验完成。各时间点对照组及假手术组膝关节软骨外观及结构均正常;随时间延长手术组关节软骨表面粗糙且有裂隙,可见大量赘生物,软骨表层纤维化,细胞排列紊乱。参照Mankin评分标准,造模后1周各组组织学评分比较,差异均无统计学意义(P>0.05);2、4、8周时手术组与对照组、假手术组间比较,差异有统计学意义(P<0.05)。造模后1周,手术组AQP-1、Caspase-3 mRNA表达和Caspase-3蛋白酶活性与假手术组及对照组比较,差异均无统计学意义(P>0.05);而2、4、8周时手术组以上指标均明显高于对照组和假手术组(P<0.05),且随时间延长呈增高趋势。AQP-1 mRNA和Caspase-3 mRNA表达成正相关(r=0.817,P=0.000),回归方程为y=0.426 7x2+0.051 5x;AQP-1 mRNA表达和Caspase-3蛋白酶活性亦成正相关(r=0.945,P=0.000),回归方程为y=15.423 0x+4.392 8。结论 AQP-1的表达上调可能与软骨细胞凋亡相关,在OA发病过程中AQP-1表达的变化可能参与了OA的发生、发展。     

基质细胞衍生因子-1对小鼠关节软骨细胞自噬水平的影响

目的：通过研究基质细胞衍生因子-1（stromal derived factor?1, SDF?1）对小鼠关节软骨细胞自噬的影响,探讨SDF?1在骨性关节炎中的作用及机制。方法分离并体外培养小鼠关节软骨细胞,分别予以0、1、10、100、1000μg/L浓度的五组重组SDF?1蛋白干预24 h。运用RT?PCR检测各组细胞的微管相关蛋白1轻链3（microtubule associated protein 1 light chain 3, LC3）和UNC?51样激酶复合物1（uncoordinated?51 like kinase 1, ULK1）mRNA表达情况,运用Western Blot方法检测LC3?Ⅱ、LC3?Ⅰ、ULK1及泛素连接蛋白62（ubiquitin?binding protein p62, p62）蛋白表达水平,通过透射电镜观察自噬溶酶体。结果 RT?PCR结果显示10、100、1000μg/L浓度条件下LC3、ULK1的mRNA水平明显高于对照组,且差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western Blot结果显示1、10、100、1000μg/L的各组细胞的LC3?Ⅱ/LC3?Ⅰ比值、ULK?1表达水平较对照组升高,p62蛋白表达水平较对照组明显降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。透射电镜结果显示经SDF?1干预后,自噬溶酶体较对照组增多,差异具有统计学意义（P＜0.05）。结论 SDF?1可诱导小鼠关节软骨细胞自噬的发生,SDF?1可能通过调节软骨细胞自噬水平参与了骨性关节炎的进展。     

lncRNA HOXA11-AS抑制骨关节炎大鼠软骨细胞凋亡与基质降解的作用研究

目的研究长链非编码RNA(long-nocoding RNA,lncRNA)HOXA11-AS在骨关节炎(osteoarthritis,OA)的大鼠软骨细胞中的表达情况,及其对软骨细胞凋亡、基质降解以及核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)信号通路的影响。方法采用弗氏完全佐剂注射大鼠构建OA大鼠模型,造模后分离培养软骨细胞;小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术抑制软骨细胞中HOXA11-AS表达;细胞计数试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测转染siRNA不同时间后软骨细胞的活力;实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)检测软骨细胞中HOXA11-AS及基质金属蛋白酶13(matrix metallo protein-13,MMP-13)、血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type 5 motifs,ADAMTS-5)、Ⅱ型胶原(CollagenⅡ)、聚集蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表达情况;流式细胞术检测软骨细胞的凋亡情况;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)检测软骨细胞上清液中Bcl-2相关X蛋白(Bcl 2-associated X protein,Bax)、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达情况;蛋白质印迹法(western blot)检测MMP-13、ADAMTS-5、CollagenⅡ、aggrecan和抗核因子κB抑制蛋白(anti-nuclear factor kappa B inhibitory protein,IκBα)、抗磷酸化核因子κB抑制蛋白(anti-phosphorylated nuclear factor kappa B inhibitory protein,p-IκBα)、抗核因子κB 65(nuclear factor kappa B,NF-κB 65)的表达,免疫荧光染色检测NF-κB在软骨细胞细胞核中的表达情况。结果与正常组大鼠软骨细胞相比,HOXA11-AS在OA大鼠软骨细胞中高表达;与NC siRNA组比较,HOXA11-AS siRNA组细胞活力显著下降,细胞凋亡率及促凋亡因子Bax、Caspase-3的表达水平显著升高,而抑凋亡因子Bcl-2的表达水平显著下降;同时,与NC siRNA组比较,HOXA11-AS siRNA组细胞collagenⅡ和aggrecan的基因和蛋白表达水平明显降低,MMP-13和ADAMTS-5基因及蛋白表达水平明显升高,IκBα蛋白表达水平显著下降而p-IκBα和NF-κB p65的表达水平显著增高,此外,NF-κB在HOXA11-AS siRNA组细胞核中明显表达。结论 lncRNA HOXA11-AS可以抑制骨关节炎大鼠软骨细胞的凋亡以及基质降解,并阻止NF-κB信号通路的激活。     

兔骨关节炎中基质金属蛋白酶-1、3与白细胞介素-1β表达及关节软骨细胞凋亡的研究

目的 观察骨关节炎(OA)中基质金属蛋白酶(MMP)-1、3与白细胞介素-1β(IL-1β)的表达及关节软骨细胞凋亡,探讨其在OA发病机制中的作用.方法 将20只中国大白兔随机分成正常组(A组)、实验组(B组),每组10只,A组未造模,B组采用Hulth法制成OA模型,4周后取胫骨平台关节软骨进行组织病理学检查,采用免疫组织化学和原位末端标记细胞凋亡检测法分别检测关节软骨和滑膜中的MMP-1、3、IL-1β及软骨细胞凋亡指数(AI)的水平.结果 组织病理学检查可见,B组关节软骨退变程度明显重于A组,符合OA关节软骨退变特征;通过检测MMP-1、3,IL-1β和AI,A组的结果分别是21.005±9.406、18.697±8.225、0.100±0.040和14.900±3.400,B组的结果分别是56.147±22.340、46.182±20.561、0.180±0.060和25.400 ±5.200;B组MMP-1、3和AI的水平均明显高于A组(P＜0.01),B组IL-1β水平高于A组(P＜0.05).结论 MMP-1、MMP-3、IL-1β的表达及关节软骨细胞凋亡在OA发病机制中作用重要,其异常升高与OA关节软骨退变和炎症反应密切相关.     

消肿止痛合剂对大鼠膝骨性关节炎软骨中AMPK/mTOR信号通路影响的实验研究

目的观察消肿止痛合剂对大鼠膝骨性关节炎软骨中LC3、Beclin1、caspase-9、单磷酸腺苷活化蛋白激酶(p-AMPK)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)表达的影响,探讨消肿止痛合剂干预膝骨性关节炎(knee osteoarthritis,KOA)形成的作用机制。方法将80只Wistar大鼠随机分为4组:观察组(消肿止痛合剂组)、对照组(硫酸氨基葡萄糖片组)、模型组、假手术组,每组20只,除假手术外,其余3组通过改良Hulth法行膝骨关节炎造模。药物连续干预8周后,取各组大鼠膝关节软骨,采用ELISA方法检测血清中白细胞介素-6 (IL-6)、基质金属蛋白酶-3(MMP-3)、环氧化酶-2(COX-2)水平,实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组软骨中LC3、Beclin1、caspase-9 mRNA的表达情况,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组软骨细胞中pAMPK、mTOR蛋白的表达。结果与假手术组比较,模型组IL-6、MMP-3、COX-2水平明显升高,下调LC3、Beclin1、p-AMPK的表达量,上调caspase-9、mTOR的表达量,差异有统计学意义(P0. 05);与模型组比较,观察组、对照组降低IL-6、MMP-3、COX-2水平,显著上调LC3、Beclin1、p-AMPK的表达量,下调caspase-9、mTOR的表达量,差异有统计学意义(P0. 05);其中观察组优于对照组,差异有统计学意义(P0. 05)。结论消肿止痛合剂对KOA关节软骨损伤的保护可能与AMPK/mTOR信号通路相关。     

自噬在张力诱导终板软骨细胞退变过程中的变化

 目的 探讨自噬在张力诱导终板软骨细胞退变过程中的变化及作用。方法 取10只清洁级SD大鼠腰椎终板软骨进行细胞培养。对P1代终板软骨细胞分别加载间歇循环张力（10%伸长率,0.5 Hz）0 h、3 h、12 h、24 h、48 h。以倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,实时PCR与蛋白印迹法检测软骨标志基因Ⅱ型胶原、转录因子SOX-9及蛋白多糖转录因子、Beclin-1和LC3基因表达的变化,以单丹磺酰戊二胺染色观察自噬小体。MTT（3-2,5-二苯基四氮唑溴盐染色）法检测3-甲基腺嘌呤（自噬抑制剂）刺激前后的细胞存活率。结果 间歇循环张力诱导后0 h组与3 h组为正常终板软骨细胞形态,呈多角形;12 h组略呈不规则形;24 h组和48 h组呈梭形改变。实时PCR显示24 h组和48 h组中Ⅱ型胶原、转录因子SOX-9及蛋白多糖的表达量降低;自噬相关基因LC3和Beclin-1表达量呈时间依赖性增加。单丹磺酰戊二胺染色显示24 h组和48 h组自噬发生率呈时间依赖性增加。MTT结果显示细胞存活率呈降低趋势;添加3-甲基腺嘌呤刺激后细胞活性减弱、存活率降低。结论 间歇循环张力刺激下终板软骨细胞表型逐渐丧失;自噬相关基因LC3与Beclin-1表达明显上调,但细胞活性降低;抑制自噬水平可降低细胞存活率,提示自噬参与了间歇循环张力诱导的终板软骨细胞退变过程。     

JAK2/STAT3信号通路介导姜黄素在骨性关节炎软骨细胞代谢中的影响

目的 :探讨酪氨酸蛋白激酶2/信号转导和转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路对软骨细胞代谢的影响以及线粒体抗氧化应激能力的改变,及JAK2/STAT3信号通路在此过程中的作用以及姜黄素对其影响。方法:选取雄性SPF级C57BL/6小鼠15只,体重10.05~15.00 g,平均12.80 g,随机分为对照组、OA组(Glasson法建立OA模型)及姜黄素+OA组(在OA组处理的基础上,术后每日腹腔注射100 mg/kg姜黄素),每组各5只。4周后用脱颈法处死3组小鼠取材,观察各组大体标本形态学变化及采用免疫组织化学法观察标本改变;采用Western blot蛋白印迹法检测各组p-JAK2、p-STAT3和Bax蛋白的表达,同时检测各组线粒体氧化应激指标琥珀酸脱氢酶(SDH)及细胞色素C氧化酶(COX)改变。结果:4周后,在软骨组织标本形态学方面,对照组软骨组织呈半透明状,无肿胀、充血,软骨细胞数量多,胞核呈椭圆形,染色质分布均匀;姜黄素+OA组关节轻微肿胀,无充血,软骨细胞形态较规则,细胞数量略减少;OA组关节面粗糙,表面变薄、有轻度破损现象,细胞排列稍紊乱,视野下可见核消失,染色不均匀。与对照组相比,OA组和姜黄素+OA组软骨细胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表达降低(P0.05)、Bax蛋白表达升高(P0.05),SDH和COX蛋白水平表达均降低(P0.05);与OA组比较,姜黄素+OA组软骨细胞p-JAK2、p-STAT3蛋白表达升高,Bax蛋白表达降低,SDH和COX蛋白水平表达均升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:JAK2/STAT3信号通路与骨性关节炎软骨退变的病理过程密切相关,姜黄素可激活JAK2/STAT3信号通路,增加软骨细胞线粒体抗氧化应激能力,明显缓解关节软骨的退变,降低OA进展水平。     

治疗型关节炎护膝对实验性骨关节炎软骨细胞凋亡基因Bcl-2及p53的影响

目的：通过检测OA护膝对日本大耳白兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡基因Bcl-2、p53mRNA表达的影响,探讨OA护膝防治兔膝骨性关节炎软骨细胞凋亡的分子生物学机制。方法：健康6月龄日本大耳白兔54只,雌雄各半,空腹体重2～2．2kg,采用改良Huhh法复制膝骨性关节炎模型,随机分为6组,即正常组、模型组、对照组（微波组）、实验1组（电组）、实验2组（热组）、实验3组（护膝组）．正常组10只,常规饲养;模型组9只,造模后常规饲养;对照组9只,微波仪治疗30min,每日1次;实验1组9只,电（疏密波）治疗30min,每日1次;实验2组8只,热（热软膜）治疗30min,每日1次;实验3组9只,电热（OA护膝）治疗30min,每日1次,连续治疗16周时处死。采用荧光定量RT—PCR法检测各组膝关节软骨细胞Bcl-2、p53mRNA的表达水平。结果：16周时,各组所有抽提的兔关节软骨组织总RNA的OD260／OD280值均在1．80～2．00范围内,表明RNA纯度高：模型组、对照组、实验1组、实验2纽、实验3组关节软骨细胞p53的mRNA相对呈高表达,而关节软骨细胞Bcl-2的mRNA相对低表达,与正常组差异有统计学意义（P〈0．01）：关节软骨细胞Bcl-2、p53的mRNA相对表达水平,对照组、实验1组、实验2组、实验3组与模型组差异有统计学意义（P〈0．01）;对照组、实验1组、实验2组与实验3组差异有统计学意义（P〈0．01）。结论：OA护膝能提高关节软骨细胞Bcl-2 mRNA表达,减弱软骨细胞p53mRNA表达,从而抑制软骨细胞凋亡,延缓膝关节软骨的退变：     

精索静脉曲张大鼠睾丸自噬对生精细胞的影响

目的:研究精索静脉曲张(VC)大鼠模型中睾丸不同水平自噬对生精细胞凋亡的影响。方法:雄性SD大鼠54只随机分为6组:空白对照组、雷帕霉素对照组、氯喹对照组各6只,VC组、VC+雷帕霉素组、VC+氯喹组各12只。采用HE染色观察睾丸、附睾组织形态学变化,并对睾丸及附睾中精子形成情况进行评分,TUNEL染色检测生精细胞凋亡指数(AI),Western印迹检测LC3、p62、Bax、Bcl-2的表达。结果:空白对照组、雷帕霉素对照组、氯喹对照组大鼠睾丸及附睾组织均未发生明显形态学变化,精子形成情况评分及AI亦无显著差异(P>0.05);VC组大鼠睾丸及附睾组织发生明显病理损伤,精子形成情况评分显著降低(P<0.01),AI显著升高(P<0.01),但VC+雷帕霉素组较VC组明显改善,而VC+氯喹组较VC组轻度加重。此外,与空白对照组比较,VC组自噬相关蛋白LC3(包括LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值)和促凋亡蛋白Bax表达显著增加(P<0.01),抑凋亡蛋白Bcl-2表达则显著降低(P<0.01);且VC+雷帕霉素组LC3与Bcl-2表达显著高于VC组(P<0.01),p62和Bax表达则显著低于VC组(P<0.01);而VC+氯喹组LC3与Bcl-2表达显著低于VC组(P<0.01),p62和Bax的表达则显著高于VC组(P<0.01)。结论:VC可诱导大鼠睾丸自噬和生精细胞凋亡,上调自噬可抑制生精细胞凋亡,阻滞自噬则可促进生精细胞凋亡。     

硫酸镁启动自噬对兔软骨保护作用机制研究北大核心CSCD

目的探讨硫酸镁通过启动自噬保护兔软骨的作用机制。方法取24只成年雌性新西兰兔,采用前交叉韧带切断方法制备创伤性关节炎(post-traumatic osteoarthritis,PTOA)模型,随机分为PTOA组、蒸馏水组和硫酸镁组,每组8只。术后即刻开始,蒸馏水组及硫酸镁组分别于关节腔内注射0.5 mL蒸馏水及20 mmol/L硫酸镁溶液,每周3次,连续4周;PTOA组不作处理。术后观察动物一般情况;术后4周取材,ELISA检测关节腔积液TNF-α和Ⅱ型胶原及静脉血中Ⅱ型胶原表达量,Western blot检测股骨软骨组织中瞬时感受电位V5(transient receptor potential channel vanilloid 5,TRPV5)及微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein1 light chain 3,LC3)蛋白(LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)表达,实时荧光定量PCR检测滑膜组织中IL-1β、TNF-α、基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinases 3,MMP-3)及软骨组织中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖(Aggrecan,AGN)、SOX9 mRNA水平,软骨组织切片行HE、Masson、阿利新蓝染色并参照改良组织学骨关节炎(osteoarthritis,OA)评分标准评分。结果各组动物均存活至实验完成。与其他两组比较,硫酸镁组关节腔积液中TNF-α以及关节腔积液及静脉血中Ⅱ型胶原表达量均降低,TRPV5蛋白表达明显降低、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高,滑膜组织中IL-1β、TNF-α、MMP-3 mRNA表达降低,软骨组织中Ⅱ型胶原、AGN、SOX9 mRNA表达升高,OA评分亦显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。PTOA组及蒸馏水组以上指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论关节腔内注射硫酸镁可减轻兔关节内炎症,减少Ⅱ型胶原及AGN丢失,有利于软骨再生,其作用机制可能是通过抑制钙离子通道TRPV5,进而启动软骨自噬。     

去势后阻断自噬对大鼠前列腺细胞凋亡的影响

目的：探讨去势后阻断自噬对大鼠前列腺细胞凋亡的影响。方法 SD雄性大鼠72只随机分为3组：即假切对照组、去势组、去势＋硫酸羟氯喹处理组。各组大鼠分别于术后第1、3、7、10、14、21d随机抽取4只,完整取出前列腺组织。 HE染色观察大鼠前列腺组织形态学变化,电镜下观察前列腺微观结构、自噬和凋亡的变化,免疫组化SP法检测自噬受体蛋白P62和凋亡促进蛋白 Caspase－3在前列腺组织中表达。结果光镜下去势后大鼠前列腺体积逐渐缩小,腺上皮细胞逐渐萎缩,核染色加深,腺泡萎缩甚至闭塞,间质增生,加用羟氯喹处理后这一变化更加明显。电镜下观察去势后自噬小体的数量明显增加。免疫组化检测去势后自噬活性蛋白P62表达减弱,用羟氯喹处理后表达增强;凋亡促进蛋白 Caspase－3表达增强,用羟氯喹处理后表达进一步增强。结论去势后大鼠前列腺细胞自噬增加,自噬抑制剂羟氯喹可通过阻断细胞自噬增加大鼠细胞凋亡,自噬可能具有抗凋亡作用。     

右归丸通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对膝骨关节炎模型鼠软骨组织保护作用的研究

目的研究右归丸对膝骨关节炎(knee osteoarthritis,KOA)模型大鼠磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路的影响。方法采用改良Hulth法制备大鼠KOA模型,模型制备成功6周后用右归丸进行干预,灌胃2个月后取材。HE法观察各组大鼠软骨组织病理形态改变并进行Mankin评分,实时荧光定量PCR法检测各组大鼠软骨组织白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,MMP-3)和基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)的表达变化,Western blot法检测各组大鼠软骨组织磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidyl inositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,pAkt)、磷酸化的哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,pmTOR)和Beclin1的蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠软骨组织Makin评分明显升高,软骨组织IL-1β、MMP-3和MMP-13的基因表达均明显升高,软骨组织PI3K、pAkt和pmTOR的蛋白表达均明显升高(P0. 01);而模型组大鼠软骨组织Beclin1的蛋白表达明显降低(P0. 01);模型组关节软骨边缘严重破坏,软骨细胞排列紊乱。与模型组相比,右归丸组大鼠软骨组织Makin评分明显降低,软骨组织IL-1β、MMP-3和MMP-13的基因表达均明显降低,软骨组织PI3K、pAkt和pmTOR的蛋白表达均明显降低,Beclin1的蛋白表达明显升高(P0. 05或P0. 01),其软骨结构趋于正常,软骨细胞分布偶见不均,关节软骨表面欠光滑。结论右归丸可能是通过抑制IL-1β、MMP-3、MMP-13、PI3K、p Akt、pmTOR的表达和增强Beclin1的表达来达到治疗KOA的目的。     

七氟醚激活海马线粒体自噬诱导老年小鼠认知功能损伤

目的探讨七氟醚对老年小鼠海马线粒体自噬和认知功能的影响。方法雄性C57BL/6J小鼠48只,18~20月龄,体重35~40 g。采用随机数字表法将小鼠为三组:对照组(C组)、吸入3%七氟醚组(S组)和吸入3%七氟醚+自噬抑制剂三甲基腺嘌呤组(3-MA组),每组16只。C组小鼠吸入空氧混合气体6 h。S组和3-MA组吸入3%七氟醚6 h。3-MA组吸入七氟醚前1 h腹腔注射三甲基腺嘌呤30 mg/kg。七氟醚吸毕24 h后采用Morris水迷宫实验观察小鼠行为学变化,第1~4天训练,第5天进行空间探索实验。行为学测试结束后立即处死小鼠。采用HE染色法观察海马组织病理学改变,免疫荧光法观察海马组织中自噬情况,Western blot法检测海马组织中PINK1、Parkin、LC3和Beclin1蛋白含量。结果与C组比较,S组、3-MA组水迷宫实验第2~4天逃避潜伏期明显延长(P<0.05),第5天目标象限停留时间明显缩短(P<0.05),穿越次数明显减少(P<0.05),海马组织出现病理形态学损伤,海马组织中LC3阳性细胞数明显增多(P<0.05),海马组织PINK1、Parkin、Beclin1蛋白含量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显升高(P<0.05)。与S组比较,3-MA组水迷宫实验第2~4天逃避潜伏期明显缩短(P<0.05),第5天目标象限停留的时间明显延长(P<0.05),穿越次数明显增多(P<0.05),海马组织病理形态学损伤程度减轻,海马组织中LC3阳性细胞数明显减少(P<0.05),海马组织PINK1、Parkin、Beclin1蛋白含量和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P<0.05)。结论吸入3%七氟醚6 h的老年小鼠,海马病理形态学发生改变,伴随学习和记忆能力下降,其机制可能与七氟醚激活线粒体自噬有关。