生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性测定的研究

 目的 将生物检定技术应用于水蛭抗凝血活性的测定,探讨反映水蛭生物活性的质量控制方法。方法 采用肝素钠作为对照品,选择活化部分凝血酶时间值作为抗凝活性评价依据,对宽体金线蛭、日本医蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭的抗凝活性进行测定,测定结果分别用标准曲线法和生物检定统计法计算。结果 4种水蛭活性部分凝血酶时间法的量效关系曲线与肝素的量效关系曲线类似,突跃范围呈平行关系,上述特点符合生物检定的要求,以肝素钠作为标准品,采用生物检定技术活性部分凝血酶时间法测定水蛭等的抗凝活性是可行的。结论 活化部分凝血酶时间值可以全面反映水蛭的抗凝血作用,测定结果对临床使用更具指导意义。生物检定技术应用于中药质量评价,是对现有中药质量标准控制方法良好的补充。     

基于蛋白免疫印迹的水蛭抗凝活性成分研究

目的：建立Native-PAGE结合Western blot检测水蛭活性多肽与凝血酶相互作用产物的方法,探究水蛭有效抗凝成分。方法：本研究分别提取宽体金线蛭、日本医蛭两种水蛭虫体总蛋白及日本医蛭唾液蛋白,用凝血酶滴定法测定其抗凝血酶活性,Western blot检测凝血酶-活性多肽复合体。结果：研究发现两种水蛭Native-PAGE-WB均检测到凝血酶-活性多肽复合体,且SDS-PAGE-WB检测到复合体变性后产生凝血酶条带。结论：建立的Native-PAGE-WB法可有效检出水蛭活性多肽和凝血酶相互作用产物,且发现同水蛭素类似,宽体金线蛭活性抗凝多肽与凝血酶在体外也能形成稳定的蛋白复合体。     

水提取法和仿生提取法研究菲牛蛭不同炮制品的体外抗凝活性

目的:采取不同的提取方法研究菲牛蛭炮制前后抗凝活性变化。方法:分别采用水提取法及模拟胃肠道环境的仿生提取法提取菲牛蛭活体冻干品、清水吊干品、滑石粉烫制品、酒浸闷烘品中的活性成分,测定活化部分凝血酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、抗凝血酶活性4个凝血指标,并采用Lorry法测定其蛋白含量,综合评价2种提取方法下的菲牛蛭及其炮制品的抗凝活性。结果:无论是水提取法,还是仿生提取法,APTT、PT、TT均显示炮制后抗凝活性降低,抗凝活性顺序为活体冻干品>清水吊干品>酒浸闷烘品>滑石粉烫制品,此结果与抗凝血酶活性及蛋白含量顺序一致。结论:高温炮制方法会降低菲牛蛭的抗凝活性。     

利用丝素固定化凝血酶分离纯化菲牛蛭中的水蛭素

目的:利用制备的丝素固定化凝血酶分离纯化菲牛蛭中的水蛭素。方法:以抗凝血酶活力(ATU)回收率为指标进行牛蛭素的固定化凝血酶萃取,通过正交实验优化萃取及反萃取条件。最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)鉴定实验样品的纯度。结果:菲牛蛭素A萃取的最佳条件为:水蛭素初始浓度9 ATU/mL,温度30℃,pH4.30,时间45 min;反萃取温度30℃,pH 7.4,时间30 min,ATU回收率55.73%。菲牛蛭素B萃取的最佳条件为:水蛭素初始浓度9 ATU/mL,温度30℃,p H 5.2,时间45 min;反萃取温度30℃,pH 7.2,时间30 min,ATU回收率23.96%。菲牛蛭素A、B实验样品PAGE图均只有1条带。结论:该文利用制备的丝素固定化凝血酶可以有效的应用于菲牛蛭素的分离纯化。     

日本医蛭抗凝活性研究

目的:研究分析人工养殖条件下日本医蛭活体、干品的抗凝活性,为日本医蛭合理入药提供参考。方法:根据中国药典规定,采用凝血酶滴定法对不同处理的日本医蛭样品进行测试。结果:发现日本医蛭抗凝活性依次为超低温冻干品、鲜品、晒干品。结论:保证日本医蛭最佳抗凝活性的方法为超低温冻干。     

中药水蛭品种考证及资源可持续利用发展探讨

该文通过系统地本草文献梳理与研究指出,传统中医使用的水蛭是生于水中,个头较小且能吸食人及牛马血的水蛭.具有这些特性的水蛭的品种有日本医蛭Hirudo nipponia Whitman、丽医蛭H.pulchra Song、南京牛蛭Poecilobdella nanjingensis sp.Nov.、菲牛蛭P.manillensis (Lesson)以及湖北牛蛭P.hubeiensis Yang 5个品种,与2010年版《中国药典》水蛭项下所规定的动物品种来源不完全一致.建议《中国药典》修改并补充水蛭的品种来源,保留原有日本医蛭H.nipponica Whitman,增补菲牛蛭P.manillensis (Lesson),暂时保留宽体金线蛭Whitmania pigra Whitman、尖细金线蛭W.acranulata Whitman,并进一步加强丽医蛭H.pulchra Song、南京牛蛭P.nanjingensis sp.Nov.以及湖北牛蛭P.hubeiensis Yang的化学成分和药理作用以及资源分布的研究,以待作为药用品种补充.     

蛭血通肠溶胶囊活性测定

目的:研究测定蛭血通肠溶胶囊活性的方法。方法:采用凝血酶滴定法测定蛭血通肠溶胶囊中水蛭提取物的抗凝血活性。结果:水蛭提取物效价测定线性范围为40U/mL~120U/mL,蛭血通肠溶胶囊活性均值为382U/g;重复性试验RSD为0.85%(n=6);滴定精密度试验RSD值为0.69%(n=6);平均回收率为101.0%,RSD为1.63%(n=6);阴性样品无干扰。结论:该方法可用于蛭血通肠溶胶囊的含量测定,准确、可靠,可有效进行该制剂的质量控制。     

菲牛蛭的含量测定方法改进及检测中的注意事项

改进菲牛蛭的水蛭素含量测定方法及总结检测中的注意事项,提高方法的重复性及准确度,更有效地控制菲牛蛭的质量。     

菲牛蛭及其制品的抗血栓、溶血栓作用

已有较多的文献报道了水蛭的抗血栓、溶血栓药效学研究结果，而与菲牛蛭相关的抗血栓与溶血栓作用却未见较详细的研究报道。菲牛蛭是一种药典尚未收载的吸血水蛭物种，作者对其氨基酸组成成分、有害元素含量、农药残留量、体外生物活性、急性毒性试验及动物药效学试验进行了较深入的研究，本实验报道其在抗血栓、溶血栓方面的药效学试验结果。     

水蛭中水蛭素含量测定的改进

水蛭素活性测定方法目前主要有以chromonymTH为生色底物的比色法、光散射法和凝血酶滴定法。2005年版《中国药典》收载了用凝血酶滴定法测定水蛭药材中的水蛭素[1],其原理是水蛭素可与凝血酶以1∶1比例结合,而凝血酶已有标准的国际单位NIH,因此可以用抗凝血酶活力单位ATU来表示     

土鳖虫与日本医蛭提取物抗凝血酶活性的比较研究

目的研究土鳖虫提取物的抗凝血作用,并与日本医蛭抗凝活性做了比较,为土鳖虫的新药开发提供实验依据。方法采用凝血酶直接滴定法。结果鲜(干)土鳖虫提取物的抗凝血活性均很强,与日本医蛭相当。但土鳖虫和日本医蛭抗凝血酶活性成分对热稳定性有差异。结论土鳖虫中含有直接作用于凝血酶的成分,但不同于日本医蛭的抗凝血酶成分。     

水蛭抗凝抗血栓活性及其与品种、提取方法的关系

水蛭为环节动物门蛭纲动物,《中国药典》收载了水蛭科动物蚂蟥（宽体金线蛭,Whitmania pigra Whitman）、水蛭（日本医蛭,Hirudo nipponica Whitman）、柳叶蚂蟥（尖细金线蛭,Whitmania acranulata Whitman）三个品种。水蛭有破血、逐血、通经的功效,用于瘕瘕痞块,血瘀闭经,跌扑损伤。水蛭具有抗纤溶、抑制血小板活化、抗血栓、改善血液流变性、降晤和抗动脉粥样硬化等药理作用。本文着重综述水蛭的抗凝抗血栓活性,分析水蛭抗凝血活性与品种、提取方法的相关性。     

水蛭头、尾抗凝活性的比较及晾干后对活性的影响

水蛭头、尾抗凝活性的比较及晾干后对活性的影响汪文茉张秋海欧兴长(中国中医研究院基础理论研究所北京100700)为考察水蛭哪个部位作用最强及晾干后对活性的影响,我们测定了两种吸血水蛭(菲牛蛭和日本医蛭)的头部、尾部及其全体的比活性。并比较了干品全体和鲜活水蛭全体(折合成干重)的比活性。1材料与方法1.1材料1.1.1水蛭日本医蛭HirudenipponicaWhitman,安徽巢湖地区收集,菲牛蛭PoecilobdelamanillensisLesson,海南岛收集,....     

四种不同品种水蛭生物活性的研究与比较

目的:应用3种酶活性抑制方法测定四种不同品种水蛭的生物活性,为评价水蛭药材质量提供科学依据。方法:分别采用抗凝血酶、抗胰蛋白酶和抗糜蛋白酶3种检测方法,测定了宽体金线蛭、日本医蛭、欧洲医蛭、菲牛蛭样品的生物活性。结果:4种水蛭中,吸血水蛭具有更好的抗凝血酶活性;4种水蛭均具有较好的抗胰蛋白酶和抗糜蛋白酶生物活性。结论:3种酶活性抑制方法可作为水蛭类药材质量控制的依据。     

蚂蝗及其混淆品菲牛蛭的高效毛细管电泳法鉴别

目的 探求更为快捷、准确的水蛭药材的鉴定方法.方法 采用高效毛细管电泳法对蚂蝗和混淆品菲牛蛭进行蛋白多肽的分析.条件为石英毛细管 (75 μm×57 cm ),电解缓冲液为20 mmol/L,硼酸盐溶液(pH 8.5),电压为20KV,检测波长254 nm.结果 蚂蝗与菲牛蛭的高效毛细管电泳图谱之间有明显差异,重复性良好.结论 高效毛细管电泳可作为鉴定方法,用于快速准确地鉴别蚂蝗与菲牛蛭.     

菲牛蛭规范化养殖标准操作规程(SOP)

目的:制定菲牛蛭规范化养殖标准操作规程(S0P)。方法:分别对菲牛蛭的养殖基地环境、养殖技术、病害防治、留种、采收加工、产品质量标准及监测等项目进行研究。结果:平均亩产菲牛蛭活体420.88 kg,平均每1 kg菲牛蛭鲜品含天然水蛭素43万AT-U,产品各项卫生及质量指标均符合国家有关的规定。结论:此S0P适用于广西地区的菲牛蛭养殖。     

广东菲牛蛭生活水体的化学环境

蛭类俗称蚂蟥,是传统中药。《本草纲目》对水蛭的药理、疗效、使用方法作了较全面记载。现代药理实验表明水蛭注射液能使肿瘤细胞坏死、消失,对网状内皮细胞有增强作用。与非吸血蛭类比较,吸血的菲牛蛭唾液腺含有较丰富的抗血液凝固水蛭素,在医药学上有重要价值。有关吸血蛭类繁殖饲养研究,国内谭恩光(2002)曾报道广东菲牛蛭H irud inariam an illensis Lesson的生长和生殖,及吸血山蛭的生态分布、生长、摄食和生殖[1~3]。国外K eegan(1968)对东南亚的菲牛蛭生活习惯进行观察[4]。1992年Steiner从产自马尼拉的菲牛蛭中分离纯化新的水蛭素,…     

菲牛蛭成分与急性毒性试验研究

目的:分析菲牛蛭中的氨基酸成分、有害物质含量与急性毒性,为评价菲牛蛭药材质量提供科学依据。方法:应用日立835-50型氨基酸自动分析仪、原子吸收分光光度法、CGC-ECD和CGC-NPD气相色谱法测定了菲牛蛭中含有的氨基酸成分、有害物质含量,并进行了菲牛蛭的初步急性毒性试验研究。结果:比较分析了宽体金线蛭、日本医蛭、欧洲医蛭、菲牛蛭四种水蛭的氨基酸含量结果,其差别不显著;菲牛蛭中重金属含量和有机氯以及有机磷农药残留量符合国家有关要求;菲牛蛭急性毒性试验结果表明其LD50大于10 g/kg,未见明显毒副作用。结论:菲牛蛭含有较高的氨基酸含量,而重金属和有机氯、有机磷农药残留量则较低,急性毒性试验LD50>10 g/kg,可考虑作为一种新药用资源而加以研究     

基于分子模拟技术筛选宽体金线蛭抗凝活性肽

目的：采用分子模拟技术从宽体金线蛭来源多肽库中筛选抗凝活性多肽,结合分子对接初筛及分子动力学模拟复筛,最终通过抗凝实验验证得到宽体金线蛭抗凝活性多肽。方法：利用虚拟酶切技术对宽体金线蛭蛋白库进行酶切,得到宽体金线蛭多肽候选库;选择凝血酶为凝血活性靶点,采用HPEPDOCK及Discovery Studio CDOCKER两种方法进行分子对接,并利用分子动力学模拟技术对分子对接初筛结果中对接结合能高的复合物进行动力学模拟复筛,通过MM-PBSA模块分析计算凝血酶-多肽复合物结合自由能;最后采用固相合成法化学合成复筛中稳定结合的宽体金线蛭多肽并进行体外抗凝活性测定。结果：经过虚拟酶切共得到3317条无毒多肽,通过分子对接进行初筛,结合分子动力学模拟复筛,得到1条结合凝血酶效果最好的目标抗凝肽,该多肽序列为QNTVGLDDFFSSYER,结合自由能为–427.506 kJ·mol^–1。凝血酶Arg233残基是该凝血酶-多肽复合物中介导结合相互作用的关键氨基酸。该宽体金线蛭抗凝肽在体外活性测定中确能延长凝血酶时间。结论：利用分子模拟技术有效筛选出1条宽体金线蛭抗凝活性肽,...     

中药水蛭各部位提取物对高分子葡聚糖所致大鼠血瘀模型的影响

中国将水蛭作为破血逐瘀药而用于血瘀症的治疗。本实验观察水蛭各部位治疗血瘀症的疗效和初步的作用机理。1　实验部分1.1　药品与试剂　水蛭 (宽体金线蛭、菲牛蛭 ,产地 :广东 )各部分提取物配制成一定浓度 ,备用。A .宽体金线蛭水煎液 (1g生药·mL-1) :取宽体金线蛭粗粉10 0g ,浸泡 30min后 ,常法水煎 3次 ,每次 1h ,过滤浓缩成每1mL相当于生药 1g ,备用。B .菲牛蛭水煎液 (1g生药·mL-1) :取菲牛蛭粗粉 10 0 g ,同上法制备。C .宽体金线蛭醇提液 (1g生药·mL-1) :取宽体金线蛭粗粉10 0 g ,用 95 %乙醇回流提取 3次 ,每次 1h ,过滤浓缩…