乙型肝炎病毒拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系的建立

目的构建1.3拷贝乙型肝炎病毒(HBV)拉米夫定耐药株的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系。方法在野毒株1.3拷贝HBV载体的基础上采用定点突变的方法将rtL180M,rtM204V位点突变,构建拉米夫定耐药病毒株,并通过PCR、限制性内切酶酶切,分别以正向和反向将野毒株和耐药株分别连接于逆转录病毒载体pLNCX2的相应酶切位点,构建成重组逆转录病毒载体,经双酶切及PCR扩增鉴定。重组载体转染包装细胞,筛选培养细胞克隆并进行病毒滴定。结果通过双酶切、PCR扩增、测序鉴定证实成功构建了1.3拷贝HBV拉米夫定耐药株的逆转录病毒载体。成功建立包装细胞系并测得病毒滴度均为1×105cuf/ml。结论含正向及反向1.3拷贝HBV拉米夫定耐药的重组逆转录病毒载体及其包装细胞系构建成功,可以用于拉米夫定耐药细胞模型研究。     

HSV-TK逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度测定

目的 建立HSV-TK逆转录病毒包装细胞系并获得高产病毒的细胞株.方法 将TK基因与逆转录表达载体PLEGFP-N1连接后转染到包装细胞PA317中,经G418及荧光蛋白双重筛选得到高产病毒的细胞株.结果 经酶切鉴定成功构建PIEGFP-N1-TK重组载体,含HSV-TK基因重组逆转录病毒包装细胞PA317成功建立,经病毒滴度测定获得高产病毒的PA317/TK细胞株.结论 制备的重组病毒具有感染靶细胞的活性,为进一步应用HSV-TK基因进行肺癌的自杀基因治疗研究奠定基础.     

逆转录病毒载体介导双靶区乙型肝炎病毒反义RNA模型的构建

构建在真核细胞内转录表达乙型肝炎病毒(HBV)双靶区反义核酸重组载体用以抗HBV基因治疗的研究。方法为合成互补于HBV(ayw亚型)X区核苷酸X片段以及互补于HBV P区的P片段,利用基因重组技术将X、P片段分别正向、反向插入逆转录病毒载体pLXSN的相应酶切位点构建成单靶区重组载体质粒。在构建单靶区载体质粒的基础上,类似方法再构建双靶区重组载体质粒。经酶切电泳、PCR扩增和DNA测序鉴定成功构建了HBV双靶区反义核酸重组载体。为探索在真核细胞内转录表达HBV反义RNA的方法及研究多基因区抗病毒治疗和抗变异病毒打下基础。     

乙型肝炎病毒全基因重组腺病毒感染免疫研究

目的 用腺病毒载体将乙型肝炎病毒(HBV)基因组导入小鼠体内,研究HBV表达产物诱发的机体免疫反应.方法 用AdEasy系统构建含HBV基因组的重组腺病毒AdHBV-WT,感染HepG2细胞后,分别用ELISA和western blot检测细胞培养上清液和细胞裂解物中的HBsAg、HBeAg和HBcAg.AdHBV-WT经在293细胞中扩增、纯化和浓缩后,经滴鼻途径感染BALB/C小鼠,检测体液和细胞免疫反应.结果 重组腺病毒AdHBV-WT感染HepG2细胞后,有效地表达出HBV的各种抗原.重组腺病毒感染小鼠可诱导抗-HBc的产生.3H-TdR摄入实验表明,AdHBV-WT可诱发小鼠产生HBcAg特异性的T细胞应答.结论 HBV全基因重组腺病毒在体外可表达HBV的各种抗原,并可诱发小鼠产生HBcAg特异性的体液免疫和细胞免疫.     

包膜蛋白突变对乙型肝炎病毒包装的影响

目的　探讨包膜蛋白突变对HBV包装的影响。方法　构建包膜蛋白突变的全长HBV基因组表达载体:前S1突变HBV表达载体pHBV mS1、Sloop突变HBV表达载体pHBV mS和前S1、S共突变HBV表达载体pHBV mS1S。分别转染HepG2细胞,以野生型HBV质粒 (adwR9 )转染HepG2细胞为对照;pHBV mS1S和pcDNA3分别与adwR9共转染HepG2细胞。ELISA方法检测上清液中和胞内S抗原;荧光定量PCR检测胞内和上清液中病毒量。结果　突变体pHBV mS1、pHBV mS和pHBV mS1S与对照组adwR9中S蛋白表达量和分泌量无明显差别;单独转染的突变体胞内病毒量较adwR9高,尤其以pHBV mS1S明显,而突变体上清中病毒量较对照组adwR9低,尤其以pHBV mS1S明显;pHBV mS1S与adwR9共转染组上清液中病毒量较pcDNA3与adwR9共转染组低。结论包膜蛋白突变对S蛋白表达量和分泌量无影响,但影响病毒包装,使病毒分泌量下降。     

RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的体外影响

目的:通过一种能够在细胞内表达短发卡RNA的逆转录病毒载体来研究RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的影响.方法:首先针对HBV基因组Pol基因RT区寻找RNAi的靶位,并设计相对应的寡核苷酸链.然后再将一对碱基配对寡核苷酸链退火后连接入载体形成重组的质粒,并进行鉴定.在Huh-7细胞中,将通过鉴定的干扰质粒与HBV复制型质粒pHBV3.8共转染,分别应用ELISA方法来检测HBV相关的抗原,应用Northern印迹检测HBV RNA,以及应用实时荧光定量PCR和Southern印迹检测HBV核心颗粒DNA.结果:研究通过计算机方法协助寻找了3条RNAi靶位,并且构建了相应的基于逆转录病毒载体的RNA干扰质粒154i、312i和734i.结果发现312i对pHBV3.8表达有明显的抑制,HBsAg和HBeAg分别为阴性对照组的39%和41%,差异均有显著性(P=0.001,P=0.000).定量荧光PCR结果显示312i组核心颗粒DNA水平显著低于阴性对照组(21.3%±1.1%vs 100.0%±10.6%,P=0.0046).Southern blot和Northern blot结果均显示,312i组病毒复制及mRNA转录水平最低(10.5%,12.0%).结论:在HBV基因组RT区找到了一个可用于RNAi的靶位,并且构建了相对应的干扰质粒,此质粒可成功地抑制HBV复制型质粒在细胞中的复制和表达.     

X基因突变乙型肝炎病毒表达质粒的构建及细胞转染

对HBV X基因进行改造,通过插入合成DNA片段,造成X基因的缺陷,构建真核细胞表达质粒,研究X基因缺陷的HBV在肝癌细胞株的表达复制效果。 1.材料与方法:pBR322HBV_2质粒获赠于第二军医大学军队卫生教研室;Dmen、脂质体Lipfect 2000Mine及胎牛血清均为美国Gibco公司产品。乙型肝炎病毒(HBV)DNA定量检测仪器为德国Roche公司的Lightcycler荧光PCR检测仪。由上海Sangon公司合成55bp双链DNA片段(L55),两端有ApaL I限制性内切酶识别序列,中间含有Pst I内切酶识别序列,两条单链分别为:a.5′TGCAC TTTGC GAGCC CGTTACACGT GGCCT GG CGC CCGCC ATCTG CAGGCATGCG C3′,b.3′-GAAAC GCTCG GGCAA TGTGCACCGG ACCGC GCGCG GTAGA CGTCC GTACGCACGT 5′。对HBV adrⅠ型基因组酶切位点分析及获赠质     

核苷(酸)类似物抗乙型肝炎病毒应用进展及耐药新认识

核苷(酸)类似物是目前临床上治疗乙型肝炎的重要药物,但应用过程中可出现乙型肝炎病毒的变异,从而发生耐药。本文就核苷(酸)类似物在乙型肝炎治疗方面的进展以及病毒耐药的新认识作一综述。     

乙型肝炎病毒特异性核酶与丁型肝炎病毒重组体的体外转录及切割活性

研究乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）特异性核酶（简称ｒＲＺ）体外转录及切割ＨＢＶ的活性。方法将８３１ｂｐ的ＨＢＶＣ基因片段克隆于Ｔ载体Ｔ７启动子下游，３２Ｐ标记转录后作为靶ＲＮＡ（３２Ｐ－ｒＨＢＶ）。ｒＲＺ、ｒＨＤＶＲＺＡ插入有核酶结构的丁型肝炎病毒基因组重组体）和ｒＨＤＶＲＺＰ（部分ＨＤＶ基因组重组体）进行非标记的大量转录，转录产物经凝胶纯化后，与３２Ｐ－ｒＨＢＶ按一定比例和条件保温切割，电泳后放射自显影。结果ｒＲＺ，ｒＨＤＶＲＺＰ，ｒＨＤＶＲＺＡ在３７Ｃ有活性，并随温度升高而提高，体外观察到重组体的切割活性，证明所设计的核酶结构是正确的。结论将核酶基因插人到ＨＤＶ基因组中，使其具有特异性切割ＨＢＶ的活性，可实现核酶的保护性和靶向性运载，为下一步重组体的体内应用研究奠定了基础。     

乙型肝炎病毒最新研究进展

近年来,国外在乙型肝炎病毒（HBV）研究方面取得了令人瞩目的进展,主要是：①对HBV颗粒结构有了进一步认识,从而对HBV的生活周期有了更多了解;②发现了一种HBV侵入肝细胞的抑制剂,为抗病毒药物的研究提供了新思路。本文就上述两方面的研究进展简要综述如下。     

HBV DNA转染原代鸭肝细胞初步观察

目的：通过观测人HBV DNA在非哺乳动物－－鸭肝细胞中的复制和表达水平，探讨人HBV感染与复制的跨种属特异性，为建立人HBV DNA转染跨种属肝细胞模型奠定基础。方法：获取线性HBV DNA并电转染原代鸭肝细胞，电转后48h采用IMX系统检测鸭肝细胞中HBsAg表达水平，用Southern blot-ting和dot blotting检测HBV DNA复制情况。以单纯电击肝细胞为对照。结果：转染组原代鸭肝细胞裂解液中HBsAg为9．10（P／N值≥2．1为阳性），HBeAg为阴性；上清液中二者均为阴性。转染组原代鸭肝细胞裂解液dot blotting呈强阳性；转染组肝细胞总DNA Southern blotting显示约4.0kb以下分子涂抹带，为游离复制型HBV DNA，包括rcDNA,cccDNA与ssDNA等复制中间体，未见整合型HBV DNA－－高分子区（4.0-24.0kb)涂抹带，对照上述指标均为阴性。结论：人HBV DNA能在原代鸭肝细胞中复制和表达，可能为肝细胞内环境依赖性，无严格种属特异性限制。     

Characterization of hepatitis B virus X gene quasispecies complexity in mono-infection and hepatitis delta virus superinfection

Hepatitis delta virus(HDV) seems to strongly suppress hepatitis B virus(HBV)replication, although little is known about the mechanism of this interaction. Both these viruses show a dynamic distribution of mutants, resulting in viral quasispecies. Next-generation sequencing is a viable approach for analyzing the composition of these mutant spectra. As the regulatory hepatitis B X protein(HBx) is essential for HBV replication, determination of HBV X gene(HBX)quasispecies complexity in HBV/HDV infection compared to HBV monoinfection may provide information on the interactions between these two viruses.AIM To compare HBV quasispecies complexity in the HBX 5' region between chronic hepatitis delta(CHD) and chronic HBV mono-infected patients.METHODS Twenty-four untreated patients were included: 7/24(29.2%) with HBeAgnegative chronic HBV infection(CI, previously termed inactive carriers), 8/24(33.3%) with HBeAg-negative chronic hepatitis B(CHB) and 9/24(37.5%) with CHD. A serum sample from each patient was first tested for HBV DNA levels.The HBX 5' region [nucleotides(nt) 1255-1611] was then PCR-amplified for subsequent next-generation sequencing(MiSeq, Illumina, United States). HBV quasispecies complexity in the region analyzed was evaluated using incidencebased indices(number of haplotypes and number of mutations), abundancebased indices(Hill numbers of order 1 and 2), and functional indices(mutation frequency and nucleotide diversity). We also evaluated the pattern of nucleotide changes to investigate which of them could be the cause of the quasispecies complexity.RESULTS CHB patients showed higher median HBV-DNA levels [5.4 logIU/mL,interquartile range(IQR) 3.5-7.9] than CHD(3.4 logIU/mL, IQR 3-7.6)(P = n.s.)or CI(3.2 logIU/mL, IQR 2.3-3.5)(P < 0.01) patients. The incidence and abundance indices indicated that HBV quasispecies complexity was significantly greater in CI than CHB. A similar trend was observed in CHD patients, although only Hill numbers of order 2 showed statistically significant differences(CHB2.81, IQR 1.11-4.57 vs CHD 8.87, 6.56-11.18, P = 0.038). There were no significant differences in the functional indices, but CI and CHD patients also showed a trend towards greater complexity than CHB. No differences were found for any HBV quasispecies complexity indices between CHD and CI patients. G-to-A and C-to-T nucleotide changes, characteristic of APOBEC3 G, were higher in CHD and CI than in CHB in genotype A haplotypes, but not in genotype D. The proportion of nt G-to-A vs A-to-G changes and C-to-T vs T-to-C changes in genotype A and D haplotypes in CHD patients showed no significant differences. In CHB and CI the results of these comparisons were dependent on HBV genotype.CONCLUSION The lower-replication CHD and CI groups show a trend to higher quasispecies complexity than the higher-replication CHB group. The mechanisms associated with this greater complexity require elucidation.     

Inhibition of hepatitis B virus DNA replicative intermediate forms by recombinant interferon-γ

AIM: To evaluate the in vitro anti-HBV activity of recombinant human IFN-γ, alone and in combination with lamivudine.METHODS: A recombinant baculovirus-HBV/HepG2 culture system was developed which could support productive HBV infection in vitro. Expression of HBsAg and HBeAg in infected HepG2 culture medium was detected by commercial enzyme immunoassays. HBV DNA replication intermediates were detected in infected cells by Southern hybridization and viral DNA load was determined by dot hybridization.RESULTS: IFN-γ at 0.1 to 5 μg/L efficiently down regulated HBsAg expression in transduced HepG2 cells.At 5 μg/L, IFN-γ also suppressed HBV DNA replication in these cells. While treatment with a combination of lamivudine and IFN-γ showed no additive effect,sequential treatment first with lamivudine and then IFN-γ was found to be promising. In this culture system the best HBV suppression was observed with a pulse of 2 μmol/L lamivudine for two days, followed by 1 μg/L IFN-γ for another four days. Compared to treatment with lamivudine alone, the sequential use of 0.2 μmol/L lamivudine for two days, followed by 5 μg/L IFN-γ for six days showed a 72% reduction in HBV cccDNA pool.CONCLUSION: This in vitro study warrants further evaluation of a combination of IFN-γ and lamivudine,especially in IFN-α non-responder chronic hepatitis B patients. A reduced duration of lamivudine treatment would also restrict the emergence of drug-resistant HBV mutants.     

HBV/HCV重叠感染的抗病毒治疗

从全球范围看,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)和丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)重叠感染估计约有700-2000万人口感染.重叠感染和单一HBV或HCV感染比较,更易发展为肝硬化、肝细胞癌甚至肝衰竭的比例也高,HBV和HCV重叠感染可有四种不同的临床模式,即HCV活动...     

乙型肝炎病毒X变异体穿梭载体的成功构建及在酵母中的表达

目的构建表达乙肝病毒（HBV）X变异体基因的穿梭载体。方法用PCR法扩增HBVX基因及变异体基因序列，用EcoRⅠ和PstⅠ双酶切pAS2-1和PCR产物．连接酶切片段pAS2—1及X变异体片段以构建pAS2-1-（X变异体）穿梭质粒，并通过醋酸锂转化法转化入酵母AH109中。结果已构建的pAS2-1-（X变异体）穿梭质粒经序列测定含有所需的HBV—X变异体基因片段，转入酵母细胞后经PCR证实酵母内有表达。结论成功构建了pAS2-1-X变异体穿梭质粒，为进一步在真核细胞内更全面了解HBV-X蛋白作用奠定了基础。     

未经治疗的慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒耐药变异、基因型和血清型研究

目的 研究未经核苷(酸)类似物(NA)治疗的慢性乙型肝炎患者HBV耐药变异、基因型、基因亚型和血清型特点.方法 从北京大学附属医院收集97例未经NA治疗的慢性乙型肝炎患者血清,用半巢式聚合酶链反应-直接测序法获得HBV全长逆转录酶区序列,用生物信息学技术筛查该区内11个经典耐药变异位点并鉴定基因型、基因亚型和血清型.用统计分析软件SPSS11.0进行t检验和χ~2检验. 结果 HBV在11个经典耐药变异位点上均为野生型氨基酸;B基因型和C基因型分别占36.1%(35/97)和63.9%(62/97),前者均属B2亚型,后者C2亚型占91.9%(57/62),C1亚型占6.5%(4/62),1例未能分出亚型.已知出生地的患者中,71.9%(23/32) B基因型感染者出生于我国南方地区,81.6%(40/49) C基因型感染者出生于北方地区,基因型地域分布特点明显,χ~2=23.19,P<0.01.血清型为adr者占60.8%(59/97),与C基因型相关;为adw者占38.1%(37/97),与B基因型相关,χ~2=87.83,P<0.01.结论 未经NA治疗的慢性乙型肝炎患者体内野毒株为优势株,其基因型、基因亚型和血清型与患者出生地有关.     

一种新的HBeAg阴性慢性乙型肝炎病毒变异机制

目的 检测HBV核心启动子区(CP)基因变异方式.方法 自HBV慢性感染患者血清中提取HBV DNA,扩增CP区域序列,克隆入pMD19 T载体,选择阳性克隆进行DNA测序,与已知HBV基因相应序列比较患者体内HBV基因变异位点以及变异形式.结果 自21例患者中共挑选74个克隆测序,54个克隆中病毒基因序列CP区发生大段缺失突变,长度达234个核苷酸,另有1个克隆发生245个核苷酸缺失突变.缺失突变区域包括CP区、HBeAg起始密码子和直接重复序列(DR)Ⅰ区,命名为CP缺失突变,发生CP缺失突变的病毒株同时存在A1585T替换突变,这两个部位的突变具有联动特征.结论 观察到一种导致HBeAg阴性慢性乙型肝炎的新方式,即CP、HBeAg起始密码子缺失突变,并提出一种简明的CP缺失检测方式.     

靶向乙型肝炎病毒X区的siRNAs对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用

目的观察siRNA对HBV基因表达和复制的抑制情况。方法针对HBVX区设计并化学合成4条siRNAs,观察在不同浓度下对HepG2.2.15细胞HBV复制的抑制作用。结果 siRNA在30nmoL/L浓度时,4种siRNA对HepG2.2.15细胞HbsAg和HBeAg无明显的抑制作用(P0.05);在60nmoL/L和90nmoL/L浓度下,siR-NA-1和siRNA-4有明显的抑制作用(P0.05),他们对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为41%和43%;siRNA能降低HepG2.2.15细胞HBVDNA的拷贝数。结论化学合成的siRNAs可以有效地抑制HBV基因的表达和复制。