抗肌萎缩蛋白基因51号外显子的精确定位

抗肌萎缩蛋白基因是迄今发现的人类最大基因,长约2300 kb,含有75个外显子。对该巨大基因的研究是近年来医学分子生物学研究的一个热点。虽然抗肌萎缩蛋白基因HindⅢ片段排序后就知道第51号外显子位于3.lkb的第40号HlndⅢ片段中,由于抗肌萎缩蛋白基因组DNA至今未被克隆,233bP的第51号外显子在3.lkp HindⅢ片段中的部位并不知道,也不知道它两侧的DNA结构。51号外显子     

抗肌萎缩蛋白基因缺失热区50号和51号内含子的克隆和测序

抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因是迄今发现的人类最大基因，长约2300kb，含有75个外显子，编码14kb mRNAE。该基因的异常导致其蛋白产物抗肌萎缩蛋白异常，从而在临床上出现病情严重前假肥大型肌营养不良症(DMD)和病情缓和的Becker肌营养不良症(BMD)。60％以上的DMD／BMD是由于该基因部分外显子缺失所致，     

抗肌萎缩蛋白基因51号外显子的筛选及其两侧内含子的亚克隆

用ｃＤＭＤｓ探针，从人Ｘ染色体噬菌体文库中筛选并作ＤＮＡ印迹杂交鉴定出含有抗肌萎缩蛋白基因５１号外显子的克隆。经限制酶切图谱分析，确定ＫｐｎⅠ和ＨｉｎｄⅡ为亚克隆位点，从而获得了与抗肌萎缩蛋白基因５１号外显子相连的５０和５１号内含子亚克隆，为该区段的核苷酸顺序分析打下了基础。     

抗肌萎缩蛋白基因缺失热区50号和51号内含子的克隆和测序

抗肌萎缩蛋白(dystrophin)基因是迄今发现的人类最大基因,长约2300 kb,含有75个外显子,编码14 kb mRNA。该基因的异常导致其蛋白产物抗肌萎缩蛋白异常,从而在临床上出现病情严重的假肥大型肌营养不良症(DMD)和病情缓和的Becker肌营养不良症(BMD)。60％以上的DMD/BMD是由于该基因部分外显子缺失所致,其中位于缺失热     

部分抗肌萎缩蛋白基因酵母人工染色体物理图谱

酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome,YAC)是近年发展起来的大容量克隆载体,可容纳数十万乃至上百万碱基对的DNA大片段,对克隆巨大基因和绘制大尺度物理图谱具有显著的优越性。抗肌萎缩蛋白基因是迄今发现的人类最大基因,长约、2300kb,该基因的异常,导致其蛋白产物一抗肌萎缩蛋白(Dystrophin)异常而引起假肥大型肌营养不     

部分抗肌萎缩蛋白基因酵母人工染色体物理图谱

酵母人工染色体《Yeast Attificial Chromosome，Hc)是近年发展起来的大容量克隆载体，可容纳数十万乃至上百万碱基对的DNA大片段，对克隆巨大基因和绘制大尺度物理图谱具有显的优越性。抗肌萎缩蛋白基因是迄今发现的人类最大基因，长约：2300kb．该基因的异常，     

成人型脊髓性肌萎缩症的基因研究

目的：研究我国成人型脊髓性肌萎缩症（SMA）患者的运动神经元生存基因（SMN）及神经细胞凋亡抑制蛋白（NAIP）基因外显子的缺失情况。以探讨此二种基因与成人型SMA之间的关系。方法：应用PCR法检测30例成人型SMA患者，30例表型正常的SMA直系亲属及30例正常对照的SMN基因第7，8号外显子和NAIP基因第5，6号外显子缺失情况。结果：成人型(Ⅳ型）SMA未检测到SMN基因第7，8号外显子及NAIP基因外显子5和（或）6的缺失。结论：成人型SMA未检测到SMN基因缺失，其发病可能与SMN基因缺失无关；NAIP基因在SMA发病中的作用尚不清楚，有待进一步研究。     

Dystrophin基因3～5号外显子缺失连接片段的克隆和测序

目的 通过对抗肌萎缩蛋白（dystrophin）因3～5号外显子缺失后连接片段的克隆和测序分析,探讨dystrophin基因缺失的发生机制。方法 先以外显子PCR反应检测证实1例杜氏肌营养不良症患者3～5号外显子缺失,然后在2、5号内含子上用PCR步移方法寻找断裂位点,最后用靠近断裂位点处设计的引物,以PCR法直接扩增dystrophin基因的缺失连接片段并测序,测序结果和正常内含子序列作对比分析。结果 获得2113bp PCR产物,本例基因缺失片段长约49000bp。5’端断裂点位于2号内含子短散在元件Alu序列内,3’端断裂点在单一序列,附近有TTTAAA序列。断裂点附近有较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点。连接片段插入了26bp序列并在断裂点周围形成3个13bp的短序列重复（GGCTTATATTTAA）连接断裂点两端。结论 推测重复序列、断裂点附近较强的拓扑异构酶Ⅱ酶切位点关联易引起基因的断裂重组,加上非同源末端连接修复机制等综合因素可能是导致基因缺失的重要原因。     

兄妹同患假肥大型肌营养不良症

目的探讨同患假肥大型肌营养不良症(DMD)兄妹的临床以及实验室检查特点。方法对患者进行临床观察、血清酶、肌电图、心电图及心脏彩色超声检查、肌肉病理HE染色,免疫组织化学染色检测肌肉组织抗肌萎缩蛋白、utrophin的表达,用多重连接探针扩增法对抗肌萎缩蛋白基因1～79号外显子进行缺失和/或重复突变检测,利用抗肌萎缩蛋白基因的CA短串联重复序列(STR)对该家系进行STR-PCR连锁分析。结果兄妹二人符合DMD诊断,具有典型的DMD临床表现,肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶、羟丁酸脱氢酶和谷草转氨酶的水平均显著高于正常值,肌电图呈肌源性损害,肌肉HE染色符合DMD,男患者的抗肌萎缩蛋白表达阴性,女患者的少量肌纤维仍可见不连续膜阳性,两患者抗肌萎缩蛋白基因的1～79号外显子未见缺失和重复突变,女患者与男患者携带相同的母源性X染色体。结论携带DMD致病基因的女性携带者可以具有临床以及实验室的典型表现,应加强对携带者的全面检查。     

人载脂蛋白CⅡ成熟肽编码基因的克隆

目的：克隆人载脂蛋白CⅡ（ApoCⅡ）成熟肽编码基因。方法：以人基因组DNA为模板，利用聚合酶链反应（PCR）分别扩增ApoCⅡ成熟肽的编码基因外显子3和外显子4，继而采用外显子拼接法。以两种扩增产物为模板再次进行PCR，得到246bp的人ApoCⅡ基因编码片段。将ApoCⅡ基因编码片段重组入载体pUC18，并进行序列测定。结果：PCR扩增得到ApoCⅡ基因编码片段．经测序证实重组人载体pUC18中的ApoCⅡ编码片段的序列与Genbank中所检索到的编码序列完全一致。结论：利用外显子拼接法完成人ApoCⅡ成熟肽基因编码片段的克隆，为基因工程研制有生物活性蛋白提供了可行的技术手段。     

PCR—RFLP法检测上海地区汉和载脂蛋白E基因型

载脂蛋白Ｅ基因位于第１９号染色体上，与载脂蛋白ＣＩ及ＣⅡ基因紧密连锁，其编码第１２及第１５８位氨基酸的密码子具有多态性。研究运用聚合酶链反应扩增该基因第４号外显子内２９２ｂｐ片段，以限制性内切酶ＨｈａⅠ酶解，最后对酶解产物进行聚丙烯胺凝胶电泳，根据电泳带型判断载脂蛋白Ｅ基因型。     

抗肌萎缩蛋白基因缺失机制的研究

抗肌萎缩蛋白基因缺失机制的研究张成，刘焯霖，梁秀龄（中山医科大学神经病学教研室；广州，５１００８０）关键词抗肌萎缩蛋白基因，内含子，ＡＴ富集区，重组，缺失机制中图号Ｒ７４６．２Ｄｕｃｈｅｎｎｅ型和Ｂｅｃｋｅｒ型肌营养不良症的患者６０％以上是由于抗肌萎...     

人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的 构建人微小抗肌萎缩蛋白基因（microdystrophin）的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞（rMSC）,研究其体外表达情况。方法 限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒poD-NA3．1（＋）的Notl位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3．1（＋）／microdystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染人rMSCs中,经过G418筛选后。用RT—PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果 pcDNA3．1（＋）／microdystrophin经过Notl、HindⅢ酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录：对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光．说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论 成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染人rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达．为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。     

X-连锁进行性肌营养不良症(附Becker型肌营养不良一家系基因诊断)

目的 应用分子遗传学方法对患者在基因水平上作出诊断。方法 应用dystrophin cDNA 14kb探针（包括6个亚探针1－2a,2b-3,4-5a,5b-7,8,9-14)与1名18岁的临床表现温和肌营养不良患者及2例对照者[1例正常25岁男性及1例12岁DMD（Duchenne muscular dystrophy)患者]的基因组DNA／HindⅢ片段进行Southern印记分析。结果 患者在亚探针5b-7杂交中,发现其1.5kb,0.5kb杂交带缺失,在与亚探针8杂交中,发现10．0kb杂交带缺失。DMD对照者在与5b-7杂交中,发现0．5kb杂交带缺失。正常对照者在与全部探针杂交中,未发现杂交带缺失。结论 这三个Hd片段分别含有基因的45,46,47号外显子,证明患者缺失了45,46,47号外显子,故诊断该患者为Becker型肌营养不良,从而为该家系的遗传咨询获得了可靠的资料。     

首次发现肥厚型心肌病肌球蛋白结合蛋白C基因Arg856fs突变

目的： 研究中国人群肥厚型心肌病(HCM)患者的致病基因突变位点，并对基因型与临床表型之间的关系进行分析。方法: 对76例HCM先证者进行聚合酶链反应(PCR)扩增心肌肌球蛋白结合蛋白C基因（MYBPC3）第15 16,18,26,28,34号外显子，产物做单链构象多态性(SSCP)分析，出现异常条带者将其目的片段和正常对照组该片段送检测序。结果: 在1例52岁男性患者的MYBPC3基因第26号外显子上发现了一个新的移码突变位点Arg856fs。由于在100名正常对照组中未见异常，故我们认为此突变位点为该患者的致病基因位点。结论: MYBPC3基因是我国HCM的致病基因之一。     

抗肌萎缩蛋白基因内含子不稳定性研究

报道中山大学附属第一医院神经科盛文利的研究表明,抗肌萎缩蛋白基因内含子结构与内含子不稳定性相关。该研究对缺失型DMD患者的连接片段     

人类Vimentin基因第1，2，6，7内含子序列的测定

目的 人vimentin(VIM）基因位于10号染色本短臂1区3带,属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因。目前已知全部外显子序列及部分内含子序列。本测定了部分未知的VIM基因内含子序列。方法 通过已知VIM基因的外显子序列设计引物,用PCR扩增其未知的内含子片段,将PCR产物进行克隆测序。结果 共测得未知的4个内含子序列,内含子1长692bp,测得其全部序列;内含子2长2kb,测得其两端与外显子相接的序列,共1kb;内含子6长456bp,测得其全部旬;内含子7长404bp,测得其全部序列。结论 本研究PCR检测多例人VIM基因的内含子7大小为404bp,与献报道人类vimentin基因的内含子7大小为800bp相差很大,但引物两端外显子序列相同,另外,献报道的人类vimentin基因与外显子3相邻的第2内含子末端41nt的核苷酸序列与本研究所测的第2内含子末端序列完全不同。     

HCV结构基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-S的构建、鉴定及表达

目的：构建能表达HCV结构基因（C＋E1＋E2）的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCV结构基因的腺病毒载体做准备,方法：用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCV结构基因上、下游引物,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/BCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV结构基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ及HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-S.通过BglⅡ／HindⅢ双酶切、PCV及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定。以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-S在人肝癌细胞7721中的瞬时表达。结果：酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd.HCV-S插入片段为HCVCE1＋E2区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达。结论：构建的质粒pAd.HCV-S 可以表达HCV结构基因,为包装表达HCV结构基因的腺病毒载体奠定了基础。     

脊髓性肌萎缩运动神经元存活基因和神经元凋亡抑制 …

目的：研究国人脊髓性肌萎缩（ＳＭＡ）基因缺失特点。方法：应用ＰＣＲ扩增及限制性内切酶技术对１５例儿童型ＳＭＡ（Ⅰ型７例,Ⅱ型４例,Ⅲ型４例）和２例成人型ＳＭＡ进行运动神经元存活基因（ＳＭＮ）第７外显子和神经元凋亡掏蛋白基因（ＮＡＩＰ）第５外显子缺失分析。并对１例有阳性家族史的家系进行了羊水胎儿产前诊断。结果：１４例儿童型ＳＭＡ携有ＳＭＮ基因第７外显子缺失,占９３％;２例Ⅰ型ＳＭＡ携有ＮＡＩＰ基因第     

实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因的表达及其临床意义

WT1基因是从Wilms’瘤细胞染色体llp13分离的一种抑癌基因。全长50kb，10个外显子，其中第5、9外显子为剪接外显子，可进行选择性拼接；编码52～54kb的四种不同的WT1蛋白：＋KTS型、-KTS型、＋17AA型和-17AA型。WT1基因主要在胚胎发生过程中表达，对泌尿生殖系统的发育起重要作用，成人WT1基因仅在肾脏、卵巢、子宫内膜、睾丸、脾脏、