用一对错配引物进行的PCR/酶解法检测β-地中海贫血-28(A→G)突变

1989年Haliassos等首先报道用误配碱基引物PCR检测点突变。其基本原理是,一个引物3′末端紧邻突变点,3′末端或近3′末端引入一个错配碱基,介导突变产物在此产生某内切酶酶切序列,而正常模板的PCR产物无该酶切序列;另一引物不含错配碱基。问题是当内切酶用量太少或失活时,突变模板PCR产物不能彻底酶解或完全不被酶解,易造成判一断错误。为避免上述情况,保证检测结果准确可靠,作者研究设计了用一对错配引物检测点突变方案,并     

3’末端碱基游移混合引物提高多变区基因片段PCR检测的阳性率(英文)

目的:通过使用3’末端碱基游移混合引物,减少引物末端错配,提高多变区基因片段的PCR检测阳性率。方法:在HBV DNA P基因区设计一对检测阳性率相对较高的引物(原型引物),在原型引物序列基础上将两根引物的3’末端分别截去1个或2个碱基,设计出两对参数与原型引物近似的突变引物。分别单独用原型引物和原型引物与突变引物组成的混合引物,在相同条件下对27份HBV DNA阳性标本行PCR,比较二者阳性率。用混合引物扩增4例拉米呋丁治疗无效患者血清HBV DNA,将扩增产物测序并评价3’末端错配对PCR的影响。结果:原型引物和混合引物检测阳性率分别为70.4％(19/27)和85.2％(23/27),两者差异非常显著(P<0.05)。引物3’末端错配能导致PCR假阴性。结论:扩增保守性相对较差的基因片段,采用3’末端单个或多个碱基截短的引物,构成3’末端碱基游移混合引物,可以避免因3’末端错配产生的PCR假阴性,提高检测阳性率。     

3’末端碱基游移混合引物提高多变区基因片段PCR检测的阳性率

目的：通过使用3′末端碱基游移混合引物，减少引物末端错配，提高多变区基因片段的PCR检阅阳性率。方法：在HBV DNA P基因区设计一对检测阳性率相对较高的引物(原型引物)，在原型引物序列基础上将两根引物的3′末端分别截去1个或2个碱基，设计出两对参数与原型引物近似的突变引物。分别单独用原型引物和原型引物与突变引物组成的混合引物，在相同条件下对27份HBV DNA阳性标本行PCR，比较二者阳性率。用混合引物扩增4例拉米呋丁治疗无效患者血清HBV DNA，将扩增产物测序并评价3′末端错配对PCR的影响。结果：原型引物和混合引物检阅阳性率分别为70．4％(19／27)和85．2％(23／27)，两者差异非常显著(P＜0．05)。引物3′末端错配能导致PCR假阴性。结论：扩增保守性相对较差的基因片段，采用3′末端单个或多个碱基截短的引物，构成3′末端碱基游移混合引物，可以避免因3′末端错配产生的PCR假阴性，提高检测阳性率。     

末端标记引物延伸反应对核酸单碱基辨认的实验研究

目的 探讨高保真DKA聚合酶的校正机制在核酸序列单碱基识别中的可能性。方法 采用三末端氚标记的引物与配对及不完全配对的模板进行引物延伸反应，对延伸产物片段进行放射性活性的检测。结果 当引物与模板配对时，其延伸产物含有可探测标记信号。当引物三末端与模板在单碱基水平不配对时，其延伸产物则不含可探测标记信号，表明引物三末端带有标记信号的碱基在高保真酶的错配纠正过程中被切除。结论 高保真酶的错配纠正机制与引物的三末端标记结合，能够有效辨认核酸序列单碱基，提示该方法可用于单碱基多态性检测。     

高保真DNA聚合酶在SNP检测中的应用

DNA测序技术，使人类步入了后基因时代；而后基因时代对DNA序列分析的新要求，尤其是有关单碱基多态性的检测，急需更高效和更特异的分析方法。作者介绍两种可靠性高且适应性广的单碱基多态性检测新方法。基于高保真DNA聚合酶对引物3’末端错配碱基的校正机制，通过标记引物3’末端，配对引物得到带标记信号的产物而不配对的引物则只能得到不含标记信号的产物。最近，我们新发现高保真DNA聚合酶具有通过聚合反应非成熟性终止以维持成熟性终产物保真度的能力。利用3’硫化磷酸修饰的引物，可强化由不配对引物所激发的对聚合反应的终止作用。3’硫化磷酸修饰与高保真DNA聚合酶共同形成一种由单碱基多态性调控的分子开关。这一新的分子开关可与电泳等多种现有的技术联合使用，在分析单一或多个已知SNP位点时，具有极大的应用价值。     

2种PCR方法扩增盐藻肌动蛋白基因3'旁侧序列比较

目的：比较扩增盐藻肌动蛋白基因3’旁侧序列的2种PCR方法。方法：用pvuⅡ、EcoR Ⅴ和StuⅠ3种限制性内切酶消化盐藻基因组DNA后，供2种PCR用，一种是连接介导法PCR(LMPCR)，与用人工合成的适配子相连并用适配子引物和盐藻肌动蛋白基因特异引物扩增未知序列；另一种是反向PCR(IPCR)，酶切后的DNA自身环化做模板，用2对基因特异引物反向扩增。结果：2轮PCR后，LMPCR中得到大量的非特异扩增产物，测序结果发现许多产物是由适配子引物AP2单独扩增引起。而反向PCR在得到pvuⅡ和Stu Ⅰ消化的自连文库中扩增得到2．5kb特异产物，经测序发现，片段两侧为基因特异引物，部分序列与已知序列相一致。Southern也进一步证实了IPCR扩增片段来源于盐藻基因组DNA。结论：IPCR技术在克隆基因旁侧序列时优于LMPCR方法。     

RD—PCR技术在酵母基因表达谱研究中的应用

目的 应用RD－PCR技术分离酵母基因。方法 首先提取酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)总RNA，纯化mRNA，然后，转录成双链cDNA，再用限制性内切酶Sau3AI酶切，在酶切片段上加上接头后，用通用引物U进行第一次PCR扩增，以这一产物为模板用选择性引物（在通用引物的3‘端延伸两个碱基）作第二次PCR扩增。5％PAGE胶分离基因片段，选择单带割胶回收，做第三次PCR扩增，与载体连接，最后进行测序分析。结果 采用这种方法分离得到的基因片段，经Blast检索分析，确为来自酿酒酵母基因的cDNA片段或表达序列标签（EST）。结论 RD－PCR技术可以有效地分离EST，可用于酵母基因表达调控的研究。     

通过引物设计和提高退火温度提高实时定量PCR检测microRNA的特异性

目的：了解因某些microRNA (miRNA) 家族成员序列相似,以及同一种成熟miRNA的长度不均一对PCR定量检测结果的影响,寻找区分相似miRNA成员和准确定量的方法和条件。方法: 采用RNA加尾和引物延伸实时定量RT-PCR法,设计不同位置错配的引物,以克隆到质粒中的全长成熟miRNA为模板,比较在不同退火温度下各种错配引物与完全匹配引物在扩增miRNA上的效率差异,并根据由此得出的经验设计let-7家族成员引物,以克隆的成熟miRNA为模板,检测其在不同退火温度下区分相似家族成员的能力。此外,设计了10组3′末端碱基位置不同的特异引物,比较了它们在检测小鼠大脑miRNA表达水平上的差异。结果：提高退火温度12 ℃~14 ℃将最大限度增加特异性而不降低敏感性,将引物的3′ 末端置于差异碱基或其附近可以有效区分相似miRNA序列,将引物3′ 末端置于miRNA第18~20个碱基,可避免漏检较短的成熟miRNA,使定量更真实准确。结论：精心设计引物并提高退火温度可提高实时定量PCR检测microRNA的特异性和准确性。     

KRT14分子诊断中两种去除假基因干扰的扩增方法比较

目的已报道有3种方法可以去除KRT14P对于KRT14分子诊断的干扰,分别为从活检组织中提取RNA法、用识别KRT14P的限制性内切酶酶切基因组DNA法和长距离特异性扩增KRT14法。本文建立特异性扩增法并和内切酶法就能否完全去除假基因干扰做比较。方法据文献报道KRT14P外显子2上有AluI的酶切位点而KRT14外显子2上没有该位点,用AluI消化基因组DNA。部分消化和完全消化的酶切产物作为模板用于下一步KRT14的分子诊断。比对KRT14和KRT14P的区别,设计特殊引物对使其包括3′末端的碱基和KRT14P错配而和KRT14完全匹配,这些引物对在PCR过程中将只扩增KRT14而去除假基因的干扰。结果部分酶切消化的基因组DNA因为不能完全去除KRT14P可能导致假阳性结果。应用本文中的特殊引物对,能够很好地去除KRT14P的干扰。结论我们采用的特异性扩增法去除KRT14P较酶切法经济有效。     

盐藻cbr基因启动子及其3''''-非翻译区序列的克隆

目的：克隆盐藻cbr基因启动子和3‘-非翻译9(3‘-UTR)片段。方法：设计2对引物，通过2轮巢式PCR反应，扩增cbr基因启动子，其中首轮PCR反应使用改良的降落PCR程序，第二轮巢式PCR反应的模板是第一轮PCR产物，使用普通PCR程序；cbr基因3‘-UTR片段的克隆采用一对引物，通过一般PCR程序得到。结果：通过巢式PCR得到长约1．1kb的cbr基因启动子片段，DNA测序结果表明碱基序列与文献记载完全相同，无任何碱基突变；克隆的长0．3kh的chr基因3‘-UTR片段经人工比较，与收录的序列吻合，无碱基突变。结论：利用普通Taq酶对用PCR方法克隆得到了盐藻胡萝卜素生物合成相天基因cbr的2个基因表达渊控序列；结合使用巢式PCR和改良降落PCR，可以非常有效地克隆具有复杂二级结构的DNA片段；通过两端人工添加的限制序列．将cbr基因启动子和3‘-UTR2个调控片段构建到同一个载体上，形成cbr基因表达盒，为构建转基因盐藻表达载体打下了基础。     

PCR产物靶向克隆法构建原核表达载体pET15b-CAT

目的:将人过氧化氢酶(Catalase,CAT)cDNA的PCR扩增产物定向克隆到pET15b载体上以构建重组质粒pET15b-CAT.方法:扩增目的基因的PCR引物的5′端加上与线性化载体同源的碱基序列,以使PCR的扩增产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列.以pZeoSV2( )-CAT为模板进行靶向克隆所需的人CAT cDNA扩增.将纯化的人CAT cDNA PCR产物与经XhoⅠ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b以6:1摩尔数之比混合于含重组酶的反应液中,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆于目标载体pET15b上,获得重组质粒pET15b-CAT.重组质粒经PCR,XhoⅠ酶切和DNA测序鉴定.结果:人CAT cDNA的PCR扩增产物与经Xho Ⅰ和BamHⅠ酶切的线性化载体pET15b发生了同源重组反应,经鉴定采用PCR产物靶向克隆法成功构建了pET15b-CAT.结论:PCR产物靶向克隆法是一种简便、高效地将PCR产物定向克隆于目标载体的方法,而无需对PCR产物进行酶切、末端抹平、载体去磷酸化及连接反应,适用于任何载体、任何插入片段和任意酶切位点.     

利用退火反应产生粘性末端的基因克隆新方法

目的通过引物设计和退火反应产生内切酶的粘性末端,旨在开发一种高效、简单、可靠的分子克隆方法。方法选定限制性内切酶（平末端或者粘性末端）设计3条或4条引物,同时进行两次独立的聚合酶链式反应（PCR）,随后把两次PCR产物回收后混在一起经过解链退火,再将其与双酶切的载体质粒进行连接反应,最后转化即可得到目的克隆。结果利用此方法成功一次性将若干靶基因（P90rsk、Nprl2、Mios、Ragc、S6k、Pkca）构建在经EcoRV和NotI双酶切后的pcDNA3.1(+)载体上,经酶切及测序验证。结论该方法无需考虑靶基因内部是否存在酶切位点,可省去PCR产物酶切及之后的纯化回收过程,可快速并准确地克隆目标基因。     

环状定点诱变技术在单碱基定点诱变中的应用

目的采用环状定点诱变技术将重组真核表达质粒pcDNA3．1-hTSHR中hTSHRcDNA序列上发生突变的单碱基诱变回正常的序列。方法设计1对含预期突变的完全互补的诱变引物,以环状质粒为模板进行PCR扩增,得到带缺口的突变质粒,酶消化去除模板质粒,将PCR产物转化DH5α感受态细胞进行缺口修复和克隆。结果DNA测序表明,在预期位点已成功发生诱变,且目的基因其他部位的碱基序列均未发生随机突变。结论环状定点诱变技术是一种高效、简便、快捷的诱变方法,通过该方法成功实现了目的碱基的定点诱变,为后续研究奠定了基础。     

恶性疟原虫红内期SSUrRNA编码基因的克隆与序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株红内期小亚单位核糖体核糖核酸SSUrRNA编码基因(SSUrDNA)片段，并进行序列分析。方法根据献报道恶性疟原虫基因序列设计1对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)方法从海南恶性疟患血样核酸提取物中扩增出恶性疟原虫SSUrDNA目的基因片段，纯化后与PUC19m-T质粒载体连接构建重组子，并导入大肠杆茵JM109；阳性克隆经双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列，并采用ExPASy Proteomicstools软件分析。结果 恶性疟原虫SSUrDNA扩增片段大小约为431bp；阳性克隆重组质粒作双酶切及PCR扩增均得到预期大小的基因片段；测定的SSUrDNA插入片段核酸序列与巴西恶性疟原虫IMTM／7G8相同基因序列对比。未发现碱基的插入或缺失去，同源性为99．3％；第353位碱基由C取代了G，第371位碱基由T取代了C，其余序列相同。结论 成功克隆了恶性疟原虫海南株红内期SSUrDNA基因片段，该序列在不同恶性疟原虫虫株间相对保守。     

HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法的建立

目的：建立一种简便，准确，实用的乙型肝炎病毒（HBV）耐拉米夫定多聚酶基因变异检测方法。方法：根据已公布的HBV DNA序列，在HBV多聚酶基因区设计合成了两对寡核苷酸引物，其中一只为错配引物；应用巢式错配聚合酶链反应（PCR）特异性扩增含有HBV多聚酶基因YMDD基序的片段，扩增产物用限制性内切酶（NdeI)酶切，琼脂糖凝胶电泳，观察酶切后目的片段的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱，部分标本进行DNA测序。结果：（1）所建立的巢式错配PCR－RFLP法，从DNA提取到酶切后电泳分析仅需要11小时，灵敏度高，可以检测到10^3copies/ml的HBV DNA；特异性强，结果准确，经DNA测序证实。（2）检测20例长期服用拉米夫定的慢性乙型肝炎患者的系列血清，发现YMDD变异者（45％）9例，YMDD野毒株者（55％）11例 ，表明该法可有效地鉴别HBV YMDD野毒株与变异株。结论：本实验所建立的用于检测HBV耐拉米夫定多聚酶基因变异的巢式错配PCRRFLP方法简单，敏感，特异，适用于一般实验室及大规模的人群调查。     

PCR产物靶向克隆法高效构建携带人内皮型一氧化氮合酶cDNA的重组质粒

目的:将PCR扩增产物人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)cDNA定向克隆到载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以构建重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。方法:在扩增目的基因的PCR引物5′端加上与线性化载体同源的15个碱基,使PCR反应产物两端分别带上15个和线性化载体两端同源的碱基序列。EcoRⅠ酶切质粒pHCM-Vsp1A-heNOS,回收heNOS cDNA作为模板,进行PCR扩增。将纯化的PCR产物heNOS cDNA与EcoR V酶切后的线性化载体pShuttle-IRES-hrGFP-2以摩尔数为8∶1比例混和,在重组酶作用下,25℃反应30 min,将PCR产物定向克隆入目标载体pShuttle-IRES-hrGFP-2上,获得阳性重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定。结果:经鉴定,成功构建出重组质粒pShuttle-heNOS-EGFP。结论:无需传统的酶切、连接、载体去磷酸化等手段,利用PCR产物靶向克隆法,可快速、高效完成PCR产物的定向克隆。     

用大引物PCR法获得轮状病毒VP4基因的突变体

目的；对A组轮状病毒主要结构抗原VP4基因中PacⅠ的识别序列进行无义突变以便于用腺病毒Ad-Easy载体系统进行表达。方法：采用大引物PCR方法，通过3条引物，两轮PCR反应，获得VP4基因的突变体，并经核酸序列分析证实。结果：PacⅠ识别的8个碱基序列TTAAT－TAA，突变为CTGATCAA。结论；大引物PCR是对核酸进行突变的一种简便，快速的方法。     

通用引物检测登革热病毒NS1基因及其酶切分型

目的：利用通用引物经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测登革病毒RNA，并经限制性内切酶酶切鉴定病毒型别。方法：用C6／36细胞培养登革病毒，碘化钠法提取病毒RNA，利用通用引物进行RT-PCR，对PCR产物用Mav I限制性内切酶酶切鉴定。结果：应用通用引物RT-PCR方法可检测到含量为0．212ng／L的病毒RNA，扩增的产物及酶切片段与预期的靶序列长度和限制酶谱分析相一致。结论：用登革病毒NS1区通用引物通过RT-PCR并经酶切分型，是诊断登革病毒感染的一种简易快速的方法。     

间日疟原虫深圳株红内期SSUrDNA基因片段的克隆与序列分析

目的 体外扩增间日疟原虫深圳株红内期小亚单位核糖体核糖核酸编码基因(SSUrDNA)片段，研究其结构与功能。方法 设计一对特异性引物，采用聚合酶链反应(PCR)从间日疟原虫患者血样中扩增出间日疟原虫SSUrDNA片段，以PUC19质粒T载体构建重组子导入大肠杆菌JM109；阳性克隆双酶切鉴定后，双脱氧末端终止法测定序列。结果 间日疟原虫SSUrDNA扩增片段大小为341bp；阳性克隆双酶切及PCR扩增均得到预期大小的片段；序列测定插入片段为341bp，与Sal I株顺序相比，仅在第151位处缺失一个碱基C。结论 成功克隆了间日疟原虫SSUrDNA片段．该序列在间日疟原虫虫株间高度保守。     

脑白质疏松与Notch3基因突变相关性研究

目的：探讨脑白质疏松（LA）与Notch3基因突变的关系。方法：应用限制性内切酶序列和错配引物试验，对96例影像学表现为LA患者的Notch3基因第4外显子133bp基因位点（Arg133 →Cys)突变热点碱基进行检测和分析，并与42例正常人进行对照。结果：LA患者和对照组Notch3基因第4外显子Arg133→Cys未发生突变。结论：目前未发现LA与Notch3第4外显子Arg133→Cys突变的相关性。但Notch3基因突变有多个不同位点和多态性，可增加其他突变位点的检测，可望提高Notch3基因突变检测率，进一步了解Notch3基因功能及其在脑白质损害疾病中的发生和发展意义。