外基因与克隆动物

外基因与克隆动物牛满江关键词ＲＮＡ，信使；基因；克隆细胞；遗传中国图书资料分类法分类号Ｑ３４３１９９７年春媒体报道英国克隆绵羊，美国克隆猿猴。生命科学界公认这是生物新技术的大跃进，社会反响强烈，有些政府下令阻止克隆人类的尝试。不论克隆哪类动物，一般认...     

介绍cDNA基因和差异表达基因的克隆技术

cDNA文库的构建是克隆cDNA基因重要的方法，方法的发展经历了置换合成法、SMART方法、固相cDNA文库的构建和逆转录病毒cDNA表达系统构建。细胞内分布克隆方法用于克隆功能性基因。而差异表达基因克隆方法用于克隆不同生命状态下表达基因。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain-like的克隆及生物学特性

目的克隆弓形虫RH株Calpain（依钙蛋白酶）-like基因，分析免疫生物学功能，筛选预防弓形虫感染的疫苗候选分子。方法利用人类、鼠类和其它寄生虫的Calpain基因同源性比较的保守区域合成混合引物，以弓形虫的RNA为模板，应用RT-PCR扩增弓形虫Calpain-like基因片段，扩增的片段通过TA克隆插入克隆载体pET32A，筛选阳性克隆进行双酶切鉴定和DNA序列分析，用克隆的基因片段制备特异性基因探针，经Northern blot技术证实弓形虫Calpain-like基因mRNA。结果RT-PCR扩增了316bp弓形虫Calpain-like基因，其DNA序列与日本血吸虫Calpain基因同一区域的同源性为70％，与计算机推测的弓形虫Calpain-like基因的同源性为100％。Northern blot显示了弓形虫Calpain-like基因mRNA的大小约6300bp。结论弓形虫RH株基因组中存在Calpain-like基因，Calpain-like基因在弓形虫RH株中高度表达。     

肾小球硬化相关基因的分离克隆及功能研究

后基因组时代的功能基因组学研究内容丰富而繁杂，基因功能信息的获取将成为基因研究的重点．采用基因差异表达分析策略分离克隆的。肾小球硬化相关基因及其功能研究的结果表明，通过基因的差异表达获取基因功能信息，进而进行基因相关功能研究是克隆和鉴定疾病相关基因的的重要手段．     

mRNA差异显示技术在紫杉醇诱导的表达基因克隆中的应用

作者应用mRNA差异显示、DNA序列分析和Northern杂交技术，对紫杉醇处理人乳癌细胞诱导的表达基困进行cDNA克隆研究，12个克隆有明确的mRNA水平表达改变，其中6个cDNA克隆核旮酸序列与已知的cDNA序列有较高的同源性，其余6个尚无同源性基因。克隆C3P3与人腺苷基蛋氨酸合成酶基因序列同源性达99％，紫杉醇诱导该酶基因转录活动和基因产物活性增高。提示mRNA差异显示技术在筛选mRNA水平表达差异的基因cDNA克隆研究中是可行的和有效的。     

细粒棘球蚴95抗原基因的克隆及原核表达质粒的构建

目的：克隆细粒棘球蚴95（Eg95)抗原基因，构建携带目的基因的原核表达载体，为细粒棘球蚴抗原的免疫保护机制研究提供材料。方法：应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因，将其克隆至pUCm-T载体，测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至原核表达质粒pET28上，根据选择标记的卡那霉素抗性基因筛选到阳性克隆，通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆，测序确定序列。结果：测序表明所有pET28-Eg95阳性克隆均为正确连接95抗原基因的重组质粒。结论：pET28-Eg95可以进一步用于重组蛋白的表达及抗细粒棘球蚴感染的实验研究。     

克隆基因的新方法

目前克隆人类新基因的方法不下几十种，概括起来不外乎从三个水平来确定基因：①ＤＮＡ水平，如ＤＮＡ全序列分析、外显子陷井捕获、ＣｐＧ岛剪切位点或ＮｏｔＩ连锁片段克隆，一致序列克隆，基因错配扫描，代表性差异筛选，显微切割，微克隆法等等，是从ＤＮＡ本身的结构...     

葡萄胎发病相关新基因的克隆

目的筛选和克隆与葡萄胎发病相关的新基因。方法采用抑制性消减杂交方法，建立葡萄胎组织与正常早孕绒毛组织间的差示cDNA文库，从中筛选出新基因序列，并克隆其全长。结果从差示cDNA文库中共筛选出28个克隆，测序结果提示含10种基因序列，其中3个基因片段被确认为功能未明的新基因，并获得其中一条基因的全长序列（按克隆序列号命名为F10）。结论F10等新基因可能与葡萄胎的病理发生发展密切相关。     

非综合性耳聋基因及在我国的研究现状

目的：综述已克隆的非综合征性耳聋相关基因，总结这些基因的功能和在耳蜗的表达特点，并介绍我国非综合征性耳聋分子遗传研究现状。方法：资料来源于非综合征性耳聋分子遗传学研究相关献，和国内近年来在本研究领域的成果及作的研究经历。结果：已鉴定和克隆非综合征性耳聋相关基因23个，其中有些基因与非综合征性和综合征性耳聋都相关，或与常染色体显性遗传和常染色体隐性遗传的非综合征性耳聋都相关。耳聋基因在耳蜗具有较特异性的表达方式，根据其特点可进行某些功能分类；在个体的遗传背景中存在影响听力受损程度的与耳聋基因相互作用的基因。高频感音神经性耳聋基因GJB3是由我国实验室克隆，我国学还在一些非综合征性耳聋患中发现GJB2和线粒体基因等突变，目前主要致力于非综合征性耳聋新基因的定位和克隆及耳聋基因的功能研究。结论：继续鉴定和克隆耳聋相关基因是非常值得挑战的一个课题。通过对单基因遗传的耳聋基因进行鉴别，可能有助于更多了解听觉分子过程和耳聋的病理机制。     

小鼠GITRL基因的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA，同时对其序列分析。方法：采用RT-PCR方法，从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA，克隆至pMD18-T载体，选择阳性克隆并进行序列测定。结果：扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519hp，编码173个氨基酸残基，与GeneBank中发表的序列完全一致。结论：获得小鼠GITRL基因的克隆，为进一步研究其生物学功能提供基础。     

拖丝蛋白全基因亚克隆文库的构建和部分序列的测定

目的 为获得蜘蛛拖丝蛋白全基因。方法 以斑点杂交、Southem印迹结果证实了的蜘蛛拖丝蛋白全基因的克隆，构建其亚克隆文库，采用鸟枪法测序的策略，选取以HinfI为酶切工具，对Scos—DS1的DNA做大量酶切，以pUC19为载体，取插入片段大小为500bp左右的阳性重组子100个构建拖丝蛋白基因的亚克隆文库。结果 成功地构建了蛛丝蛋白基因Scos—DS1由HinfI酶切片段连接而成的亚克隆文库，得到了其部分序列。结论 亚克隆方法可以得到拖丝蛋白基因全序列。     

基因变构IL-2重组克隆的构建

①目的 构建基因变构IL-2（88ArgIL-2)的重组克隆。②方法 将正常人的扁桃体细胞经PHA刺激后，获得cDNA文库，并以此为模板，经套式PCR扩增得IL-2的基因编码序列。测序确认正确后，设计含有突变位点的引物，经pCR定点诱变技术获得变构IL-2克隆并进行序列确定。③结果 IL-2基因定点诱变成功，并获得了基因变构IL-2重组克隆。④结论 IL-2重组基因变构克隆的构建为进一步在原核和真核细胞中表达以及研究制备低毒、高效的新型基因变构IL-2奠定了基础。     

西尼罗I型病毒亚克隆的构建及其鉴定

目的构建西尼罗病毒基因组的cDNA亚克隆，为西尼罗病毒全长cDNA克隆的研发和应用打下基础。方法根据基因组中限制性酶切位点的分布设计4对引物，QIAamp RNA抽提试剂盒提取西尼罗病毒培养细胞BHK-21的总RNA，长片段RT-PCR技术扩增目的基因片段。将目的基因片段与pMD18-T载体进行连接，转化人感受态细胞E.coli DH5α，进行蓝白斑筛选后得到阳性克隆。将重组质粒进行PCR和测序鉴定。结果获得的目的基因片段经PCR和测序结果表明西尼罗病毒功能基因正确地克隆进入载体。结论成功获得西尼罗I型病毒功能基因的cDNA亚克隆，可应用于西尼罗病毒全长cDNA克隆的制备。     

PCR法筛选日本血吸虫cDNA文库中磷酸丙糖转移酶基因

目的：用PCR法自日本血吸虫童虫cDNA文库到丙糖转移酶（TPM）基因，为进一步亚克隆和表达奠定基础。方法：根据GeneBank中日本血吸虫TPM基因开放阅读框设计合成一对引的，应用PCR测定cDNA文库中该基因的频率。根据测得的频率，将适量的噬功体接种于96孔细胞培养板上进行细菌培养扩增。再利用PCR是性克民在位置，经过选择性扩增，筛选出阳性克隆，并环化成质粒，经测序验证后构建pGEM-T/TPM克隆载体。结果：经过3轮筛选，所得阳性克隆经过测序，用Genebank BLAST进行序列比较，证实为日本血吸虫磷酸丙糖转移酶基因。重组质粒pGEM-T双酶切证实有约760bp的插入片段。结论：从日本血吸虫cDNA文加中筛选出TPM基因，并成功地构建该原克隆载体，为研究该基因在血吸虫糖代谢中的作用创造了条件。     

人Vigilin基因5‘端EcoRI片段的克隆及限制性酶切图谱分析

为了解人基因组Ｖｉｇｉｌｉｎ基因结构和探讨Ｖｉｇｉｌｉｎ蛋白的功能，在人基因组Ｖｉｇｉｌｉｎ基因全长克隆的基础上，在５’端ＥｃｏＲＩ片段亚克隆，并从１３个限制性核酸内切酶中选出６种对亚克隆ＤＮＡ进行部分酶切和分子杂交，组建了克隆Ｖｉｇ－ＣＧ５－７Ｅ ＤＮＡ的详细限制性酶切图谱，从而为克隆Ｖｉｇｉｌｉｎ基因的转录调控序列提供合适的酶切位点。     

mRNA差异显示技术在紫杉醇诱导的表达基因克隆中的应用

作者应用ｍＲＮＡ差异显著，ＤＮＡ序列分析和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交技术，对紫杉醇处理人乳癌细胞诱导的表达基因进行ｃＤＮＡ克隆研究，１２个克隆有明确的ｍＲＮＡ水平表达改变，其中６个ｃＤＮＡ克隆核苷酸序列与已知的ｃＤＮＡ序列有较高的同源性，其余６个尚无同源性基因。克隆重Ｃ３Ｐ３与人腺苷基蛋氨酸合成酶基因序列同源性达９９％，紫杉醇诱导该酶基因转录活动和基因产物活性增高，提示ｍＲＮＡ差异显著技术筛选ｍＲＮＡ水     

基因串联体的构建策略及其表达模式

为了获取足够的DNA片段或得到基因的表达产物，常需要构建基因串联体，将目的基因按头尾相连随机串联起来，克隆入克隆载体以制备需要的目的基因片段或克隆入表达载体进行高效表达。串联的策略包括定向串联法、PCR扩增串联法、化学拼接法、同尾酶法等，不同方法构建的串联体基因表达模式也有一定差异。     

疟疾基因工程疫苗的研究Ⅱ．恶性疟保护性抗原复合基因的串接与克隆

将人工合成的恶性疟原虫４５肽抗原基因ＨＰＦＡ和７５肽抗原基因ＨＧＦＣ分别从克隆载体上切下，经过一系列的串接和克隆，筛选出含有ＨＧＦＣ－ＨＰＦＡ－ＨＧＦＣ三连体基因（ＨＧＦＣＡＣ）的重组克隆，经酶切鉴定和ＤＮＡ序列分析证实基因序列与设计一致。该三连体基因含有起始和终止密码，编码一个１９３肽的复合抗原。多连体基因串接与克隆的成功，在基因水平上实现了复合抗原的多聚，从而为进一步研究疟疾多价疫苗的结构和功能提供了条件。     

应用抑制消减杂交技术克隆人大肠癌转移相关新基因

目的 克隆新的大肠癌转移相关基因，为进一步阐述大肠癌转移的分子机制提供线索。方法 利用抑制消减杂交技术，以1对来自同一亲本、转移能力不同的大肠癌细胞株SW620和SW480为研究对象．构建2种大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的cDNA消减库。随机挑取库克隆进行差异筛选．对所得的差异片段进行测序和同源性分析，利用Northern Blot对新基因的表达情况进行验证。结果 两种消减库分别含有235和232个白色克隆．90％以上的白色克隆含有插入片段。随机挑取约200个阳性克隆进行差异筛选．共获得29个差异片段。测序及同源分析发现15个为未知基因，GenBank登陆号为CD485499-CD485513。其中与5号染色体序列同源的基因有6个。结论 抑制消减杂交技术是筛选、克隆大肠癌转移相关新基因的有效手段：5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点：筛选到的新基因片段为进一步克隆基全长、研究基因功能提供了实验基础。     

嗜热菌热休克蛋白基因的克隆与表达

克隆和在原核表达系统中表达超嗜热古球菌之热休克蛋白基因β亚基。方法：用ＰＣＲ技术从ＨＰＫ基因组ＤＮＡ中扩增ｃｐｋＢ基因片段，经克隆和核苷酸序列分析后再克隆至原核表达载体ｐＢＶ２２０，升温诱导ｃｐｋＢ基因表达，利用ＣｐｋＢ蛋白的耐温特性纯化该蛋白。结果：扩增和克隆了１．６ｋｂ的ｃｐｋＢ基因，并经ＤＮＡ测序证实，实现了ｃｐｋＢ基因在原核系统ＰＬＰＲ启动子控制下的表达，建立了纯化ＣｐｋＢ蛋白的方法。结论