巨噬细胞炎性蛋白4的非融合表达载体的构建和表达

目的探索如何抑制嗜酸性粒细胞的趋化作用,选择β-趋化因子巨噬细胞炎性蛋白4(MIP4)的突变体(Met-MIP4)作为趋化因子受体3的拮抗剂,将Met-MIP4基因在原核细胞中进行非融合表达. 方法设计MIP4基因的PCR引物并进行氨基酸突变,将MIP4 N末端的丙氨酸突变为蛋氨酸.以正常人肺cDNA文库为模板,PCR方法获取Met-MIP4基因.克隆入载体pUC19,测序验证序列已得到突变.将正确的基因插入到非融合表达载体pBV220中进行表达.结果 PCR产物为220 bp左右的片段,连接入pUC19质粒后测序验证获得正确突变.构建的pBV220非融合表达载体在大肠杆菌DH5-α中表达,经Tricine-SDS-PAGE凝胶电泳显示有大小约8×103的非融合蛋白表达.结论成功突变并克隆了β-趋化因子MIP4基因.Tricine-SDS-PAGE表明,非融合的Met-MIP4突变体已得到表达,为进一步研究其对哮喘的生物治疗奠定了基础.     

人酪氨酸酶相关蛋白-2的cDNA克隆及表达

目的 克隆酪氨酸酶相关蛋白－2（TRP－2）编码基因，表达TRP－2蛋白。方法 从培养的人黑素细胞中提取总RNA，反转录成cDNA，通过PCR方法扩增TRP－2编码基因，克隆至pUC19载体并测序，再亚克隆至谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融全表达载体pGEX-4T-1，转化大肠杆菌，IPTG诱导表达TRP－2／GST融合蛋白。结果 从培养的人黑素细胞中扩增出编码TRP－2的cDNA，序列测定证实与文献报道的序列一致；成功构建了GST融合表达载体pGEX-4T-1/TRP-2,表达了TRP－2／GST融合蛋白。结论 成功克隆了人TRP－2基因，构建了GST融合表达载体并表达了TRP－2／GST融合蛋白。     

谷胱甘肽-S-转移酶人趋化因子CCL3L1的表达

目的克隆人趋化因子CCL3L1基因,表达并初步纯化谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-CCL3L1融合蛋白。方法从乳腺癌细胞MCF7中提取总RNA,采用RT-PCR扩增CCL3L1cDNA基因,克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,重组载体经酶切和测序鉴定后,在BL21大肠杆菌中用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,获得GST-CCL3L1融合蛋白,采用SDS-PAGE和Westernblotting分析表达产物。结果经测序、酶切鉴定证明CCL3L1基因已正确插入到pGEX-4T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子质量为34000的新生GST-CCL3L1融合蛋白。结论GST-CCL3L1融合蛋白可被成功表达。     

人β-防御素-3基因定点突变,原核表达载体构建和融合蛋白表达

目的:利用PCR技术对人β-防御素-3基因进行定点突变,将突变后的基因连接入pGEX-4T-1表达载体.方法:采用PCR体外定点突变技术,设计两对引物,引入一个突变点,通过重叠延伸法进行两次PCR扩增,使人β-防御素-3基因第27位密码子由GAG突变为CGA,将突变后的片段克隆入pGEX-4T-1质粒中,转化至E.coli BL21,对鉴定含有目的片段的克隆进行测序.结果:获得预期大小的突变产物,经序列鉴定证实为突变的人β-防御素-3基因. 将诱导后的菌体进行SDS-PAGE电泳,在Mr31 000处可见明显的高表达带.结论:获得突变型人β-防御素-3基因,构建了表达载体,融合蛋白得到表达,为基因工程制备肽类抗生素奠定了基础.     

巢蛋白样结构域蛋白的表达?纯化与鉴定

目的:重组构建原核表达载体以正确表达巢蛋白样结构域(nidogen domains,NIDO)蛋白,并进一步纯化与鉴定?方法:PCR法拼接NIDO基因,经T-A连接亚克隆至pMD19-T载体,测序鉴定?采用质粒抽提?纯化?酶切?连接?感受态细胞制备和转化等技术,构建并鉴定原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO?药物诱导方式诱导NIDO-GST融合蛋白的表达?对表达产物进行分离,用SDS-PAGE检测上清与包涵体沉淀中目的蛋白的表达量?对包涵体进行变性和透析复性后,进行GST亲和层析纯化?采用SDS-PAGE和质谱分析,鉴定纯化的目的蛋白?结果:测序证实了NIDO基因的正确合成和pMD19-T-NIDO克隆载体的构建?原核表达系统pGEX-4T-1-NIDO构建成功,在大肠杆菌BL21中被诱导,获得高表达量的N-末端带有GST标签序列的重组融合表达蛋白(30%)?超声裂菌法分离的结果显示,目的蛋白在菌体沉淀中以包涵体形式居多?将包涵体变性?复性后用GST亲和层析纯化,纯化蛋白> 80%并经质谱鉴定证实?结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-NIDO,能正确表达NIDO-GST融合蛋白,GST亲和层析对于NIDO-GST融合蛋白有较好的纯化效果?     

迁移侵袭抑制蛋白 MIIP 基因 K167E 位点突变体的构建和表达

目的构建人迁移侵袭抑制蛋白（MIIP）蛋白K167E突变体的原核表达载体pGEX-4T-1-MIIP（K167E）并进行表达和纯化,为MIIP的后续功能研究提供有效工具。方法以pGEX-4T-1-MIIP重组质粒为模板,PCR扩增得到人MIIP基因（K167E）突变体的eDNA全长,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建获得pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体,经酶切鉴定及测序验证完全正确后,将其转化至大肠杆菌B121细胞中诱导表达,纯化获得GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结果酶切鉴定和测序结果显示,pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体构建成功。经诱导表达及纯化后,成功获得的GST—MIIP（K167E）融合蛋白。结论成功构建了pGEX-4T-1-MIIP（K167E）突变体表达载体,并获得了GST—MIIP（K167E）融合蛋白。     

人表皮生长因子受体Ⅲ型突变体胞外区的克隆表达和鉴定

目的 构建含表皮生长因子(EGF)受体Ⅲ型突变体胞外区基因(vⅢECD)的重组质粒并进行表达和鉴定.方法 应用PCR方法扩增EGFRvⅢECD片段,将其T-A克隆和测序.再将目的基因插入GST融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达.采用双酶切鉴定插入序列的正确性,用SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致;双酶切鉴定表明,EGFRvⅢ ECD序列已经正确克隆到GST融合表达载体中.SDS-PAGE电泳显示融合蛋白在E.coli BL21(DE3)中以包涵体形式表达.重组融合蛋白GST-vⅢ ECD的表达量占菌体总蛋白的15%以上.Western blotting分析证实重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 成功构建了融合表达载体(pGEX-4T-1/vⅢECD),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFRvⅢ功能及免疫学研究.     

H9N2亚型禽流感病毒ns1基因克隆

目的克隆A／Duck／Shantou／2088／01（H9N2）亚型禽流感病毒ns1基因，构建重组融合表达载体。方法采用常规PCR方法扩增ns1基因cDNA，将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-3中，构建重组质粒pGEX-4T-3／ns1，转化BL21（DE3）宿主菌；采用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切和序列分析鉴定插入的ns1，基因；并用IPTG诱导工程菌，SDS—PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达。结果双酶切鉴定表明，ns1基因已正确克隆到GST融合表达载体中，测序结果证实ns1基因序列与目的基因序列完全一致。SDS—PAGE电泳显示，融合蛋白在BL21（DE3）工程菌中以可溶形式表达，重组融合蛋白GST—NS1的表达量占菌体总蛋白的20％左右。经Western blotting分析证实，重组融合蛋白可以被GST特异性抗体所识别。结论本实验成功克隆了H9N2亚型禽流感病毒ns1基因，构建了融合表达载体，并进行了融合蛋白的诱导表达，为进一步研究NS1蛋白在流感流行中的作用打下基础。     

组蛋白脱乙酰化酶4N-末端和C-末端片段的原核表达及纯化

目的 在大肠杆菌中分别表达组蛋白脱乙酰化酶4(HDAC4)N-末端(1-1950bp)和C-末端(1708-3255 bp)片段与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并进行纯化.方法 应用PCR方法扩增HDAC4 N-末端和C-末端片段,将目的基因插入GST融合载体pGEX-6P-1中,重组载体在酶切鉴定和序列测定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达GST-HDAC4-N'和GST-HDAC4-C'蛋白.经SDS-PAGE及Western blotting鉴定表达产物后,用谷胱苷肽琼脂糖珠纯化目的蛋白.结果 经测序、酶切鉴定证明成功构建了融合蛋白表达质粒,表达出的融合蛋白经SDS-PAGE分析其相对分子量约为110500和93080.Western blotting分析证实融合蛋白可以被HDAC4特异性抗体所识别.结论 成功构建了融合表达载体(pGEX-6P-1/HDAC4-N'和pGEX-6P-1/HDAC4-C'),并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可以进一步用于HDAC4与其他蛋白质相瓦作用的研究.     

MIP4的突变体构建及其对嗜酸粒细胞趋化的抑制

目的：为研究MIP4（巨噬细胞炎性蛋白4）的突变体在拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用中的活性。构建MIP4突变体（Met-MIP4)并进行原核表达和纯化，体外观察其拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用。方法：将Met-MIP4基因片段插入到pR-SET-A融合表达载体中。诱导表达后，表达工程菌经超声裂菌后鉴定可溶性，细菌裂解上清经镍螯合亲和层析纯化，采用葡聚糖沉淀法分离和纯化嗜酸粒细胞，利用24孔Transwell双层板鉴定融合表达蛋白的趋化和抗趋化活性。结果：构建入融合表达载体pRSETA的基因在大肠杆菌中得到表达。裂菌后鉴定显示融合蛋白可溶部分占80%，经镍螯合亲和层析纯化后纯度达87%，分离的嗜酸粒细胞纯度达到90%，拮抗嗜酸粒细胞趋化活性实验表明，纯化的Met-MIP4蛋白具有明显拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用。结论：Met-MIP4突变体基因在pRSETA融合表达载体中获得可溶性表达和纯化，生物学活性实验表明融合的pRSET-Met-MIP4蛋白具有拮抗嗜酸粒细胞的趋化作用的活性。为进一步开发其临床应用奠定了基础。     

β-synuclein蛋白原核表达载体的构建与表达

目的 构建人β-synuclein基因的原核表达载体,分析其在大肠杆菌中的表达.方法 从人脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人β-synuclein基因,克隆至pCUm-T载体中,PCR筛选阳性克隆并测序.将酶切后的目的片段克隆至原核表达载体pGEX-6P-1中,转化大肠杆菌BL21.IPTG诱导后,经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达.结果 RT-PCR扩增出人β-synuclein基因,将其亚克隆至pGEX-6P-1构建成重组表达质粒,并在BL21中表达了β-synuclein蛋白.结论 成功构建人β-synuclein的原核表达载体,并在大肠杆菌中表达了人β-synuclein融合蛋白,为进一步研究β-synuclein在帕金森病中的作用奠定了良好的基础.     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因原核表达质粒的构建

目的:对人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)进行基因突变,构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/(Val8)hGLP-1,并在大肠杆菌中诱导表达。方法:选择大肠杆菌偏爱密码子,将hGLP-1(7～37)第2位的丙氨酸(Ala8)定点突变为缬氨酸(Val8),直接生物合成4个寡聚核苷酸片段并进行基因拼接,形成完整的hGLP-1突变体基因(Val8)hGLP-1,并连接到载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL21,BamH I与Xho I双酶切电泳鉴定与序列测定,然后诱导表达其融合蛋白。结果:经酶切电泳鉴定与测序分析,证实所合成的突变体基因(Val8)hGLP-1已克隆到pGEX-4T-1中,经SDS-PAGE分析可以诱导表达出融合蛋白。结论:成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-4T/(Val8)hGLP-1,为进一步获得重组hGLP-1蛋白奠定基础,为产业化规模制备hGLP-1突变体提供实验依据。     

重组膜型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST-TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的融合基因表达载体。方法：用RT-PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700 bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：建立了重组膜型TNF的GST融合表达及纯化优势,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

小鼠TSR2-3/TSP-1基因片段的克隆及其GST融合蛋白的表达和纯化

目的：获取小鼠TSR2—3／TSP-1基因片段，并高效表达和纯化GST—TSR2—3融合蛋白。方法：应用RT—PCR技术，从小鼠肺总RNA中，获得编码TSR2—3的基因片功能片段，测序后，通过酶切克隆至表达载体pGEX-5X-2，构建重组表达载体，并导入E.coli BL21宿主菌中，IPTG诱导表达重组的GST融合蛋白，亲和层析纯化表达产物，SDS—PAGE和Westem blot进行分析鉴定。结果：获得小鼠TSR2-3基因片段，测序结果与GenBank的基因序列一致，重组GST融合蛋白经SDS-PAGE和Westem blot分析，在相对分子量39kDa处，出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白。结论：成功克隆小鼠TSR2—3基因片段，并在Ecoli BL21中高效表达，亲和层析后获得高纯度GST—TSR2—3融合蛋白。     

人胰高血糖素样肽-1突变体基因的构建和表达

目的构建人胰高血糖素样肽-1突变体（^2Gly-hGLP-1）基因，并表达GST一^2Gly-hGLP-1。方法用限制性内切酶双酶切载有hGLP cDNA的重组克隆质粒PMD18T simple和原核表达质粒pGEX-4T-1，将GLP-1定向插入原核表达载体pGEX-4T-1^＊中，筛选出阳性克隆。在获得重组hGLP-1基因工程菌的基础上，利用定向突变的技术改造其第2位丙氨酸为甘氨酸，经酶切克隆于pGEX-4T-1^＊中，构建pGEX-4T-1^＊／^2Gly-hGLP-1表达载体。转化大肠杆菌BL21并进行诱导表达。结果经测序分析，证明^2Gly-hGLP-1已经克隆到pGEX-4T-1^＊中。Western blot证实，该蛋白可被特异性hGLP-1识别。结论成功构建和表达了人胰高血糖素样肽-1突变体原核表达质粒。     

重组模型人肿瘤坏死因子α的克隆及GST—TNF融合基因的构建

目的：构建膜结合型人肿瘤坏死因子与谷胱甘肽－S－转移酶（GST）的融合基因表达载体。方法：用RT－PCR一步法扩增出人膜结合型TNF基因片段,定向克隆到质粒pUC19中。再通过定向亚克隆插入真核表达质粒pGEX-4T-3中GST下游。结果：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结论：从激活的单核细胞中扩增出700bp左右的膜型TNF基因;限制性酶切产物和以重组载体为模板的PCR扩增证实了重组载体构建成功。结: 重组模型TNF的GST融合表达及纯化优化,为进一步定点突变,设计高效低毒的非分泌性膜结合TNF,用于肿瘤的基因治疗打下了良好的基础。     

人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定

目的 原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定.方法 通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白.结果 重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功.导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符.该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白.结论 构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础.     

人Survivin蛋白的表达?纯化及初步应用

目的:克隆、表达肿瘤特异性凋亡抑制因子(Survivin),并对其在人肝癌诊断中的意义进行研究。方法:从人白血病细胞系HL60提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出Survivin基因片段。将Survivin基因片段插入载体pMD-18T中,测序正确后亚克隆到原核表达载体pGEX-2TK中。IPTG诱导重组质粒pGEX-2TK-Survivin在大肠杆菌BL21中表达N端融合GST的目的蛋白,采用GST蛋白纯化系统进行纯化,经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin裂解后进行Westernblot鉴定。将获得的目的蛋白包板,用ELISA法初步检测了肝癌患者血清中抗Survivin蛋白的表达。结果:克隆了人Survivin基因、表达出相对分子质量约为16.2ku的蛋白并进行了肝癌患者血清的检测应用。结论:成功克隆、表达和纯化了Survivin基因和融合蛋白,为进一步探讨以Survivin为基础的肿瘤诊断和治疗奠定了实验基础。     

多功能转录因子CTCF重组质粒构建及其表达鉴定

目的 构建人CTCF cDNA全长及N端、Zn指、C端3个片段的原核融合表达载体,纯化融合蛋白并进行鉴定.方法 以编码CTCF全长序列的质粒为PCR模板,分别构建GST融合表达重组质粒pGEX-4T-2-CTCF,pGEX-4T-2-CTCF-N,pGEX-4T-2-CTCF-Zn,pGEX-4T-2-CTCF-C,转化大肠杆菌BL21,酶切、测序鉴定;优化IPTG诱导表达条件,并对亲和层析纯化的GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF进行Far-West-ern blot鉴定.结果 重组质粒经双酶切和测序鉴定证实构建成功.GST融合蛋白CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C均在大肠杆菌中成功诱导表达,融合蛋白经亲和层析纯化获得纯化蛋白.各纯化蛋白经SDS-PAGE和Far-Western blot鉴定,均为诱导表达蛋白质.结论 成功构建了GST融合表达CTCF,CTCF-N,CTCF-Zn,CTCF-C的重组质粒,对融合蛋白表达条件进行了优化.获得了高效表达的GST融合蛋白.     

表皮生长因子受体胞外区的原核表达和鉴定

目的 克隆表皮生长因子受体(EGFR)胞外区段基因序列(EGFR ECD),构建重组融合表达载体.方法 采用常规PCR方法 扩增EGFR的胞外区DNA序列,并将扩增产物克隆入GST融合表达载体pGEX-4T-1中,构建重组质粒pGEX-4T-1/EGFRECD,转化BL21(DE3)宿主菌;采用Sal Ⅰ和Not Ⅰ双酶切和序列分析鉴定插入序列的正确性:并用IPTG诱导工程菌,SDS-PAGE及Western blotting分析融合蛋白的表达.结果 双酶切鉴定表明,EGFR胞外区序列已经正确克隆到GST融合表达载体中,测序结果证实插入DNA序列与EGFR胞外区序列完全一致.SDS-PAGE电泳显示,融合蛋白在BL21(DE3)中以包涵体形式表达,重组融合蛋白GST-EGFRECD的表达量占菌体总蛋白的12%左右.经Western blotting分析证实,重组融合蛋白可以被EGFR特异性抗体所识别.结论 本试验成功克隆了EGFR胞外区DNA序列,构建了融合表达载体,并进行了融合蛋白的诱导表达和鉴定,可进一步用于EGFR功能及免疫学研究.